CN111678756A - 斑马鱼软骨染色一步法试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，包括溶液A为4%多聚甲醛溶液，溶液B由pH值7.5的浓度为100mM的Tris‑HCl缓冲液与浓度为10mM的MgCl2溶液组成的混合液；溶液C由0.04%阿可辛蓝与浓度为10mM的MgCl2溶液组成的混合液；溶液D由体积分数为80%的乙醇与浓度为10mM的MgCl2溶液组成的混合液；溶液E为体积分数为50%的乙醇；溶液F为体积分数为25%的乙醇；溶液G为体积分数6%的H2O2；溶液H为质量分数1%的KOH；溶液I为体积分数为的25%甘油和质量分数为0.1%的KOH溶液组成的混合液；溶液J为体积分数为的50%甘油和质量分数为0.1%的KOH溶液组成的混合液。本试剂盒能快速获得完整的斑马鱼软骨染色结果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种斑马鱼软骨染色一步法试剂盒。
背景技术
斑马鱼是近年来新兴的模式生物，具有体型小、身体透明、繁殖量大、生长发育快、养殖费用低等特点，正越来越多地被应用于科学研究中。在对斑马鱼进行研究时，需要对对斑马鱼的软骨进行染色，因此，有必要设计一种斑马鱼软骨染色一步法试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斑马鱼软骨染色一步法试剂盒。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，包括溶液A、溶液B、溶液C、溶液D、溶液E、溶液F、溶液G、溶液H、溶液I和溶液J；所述溶液A为4％多聚甲醛溶液，所述溶液B由pH值7.5的浓度为100mM的Tris-HCl缓冲液与浓度为10mM的MgCl2溶液组成的混合液；溶液C由0.04％阿可辛蓝与浓度为10mM的MgCl2溶液组成的混合液；溶液D由体积分数为80％的乙醇与浓度为10mM的MgCl2溶液组成的混合液；溶液E为体积分数为50％的乙醇；溶液F为体积分数为25％的乙醇；溶液G为体积分数6％的H2O2；溶液H为质量分数1％的KOH；溶液I为体积分数为的25％甘油和质量分数为0.1％的KOH溶液组成的混合液；溶液J为体积分数为的50％甘油和质量分数为0.1％的KOH溶液组成的混合液。
优选的技术方案为：所述溶液B的配置方法：10ml的pH值7.5的浓度为1M Tris-HCl缓冲液和1ml浓度为1M MgCl2溶液混合后加双蒸水至100ml。
优选的技术方案为：所述溶液C的配置方法：20ml的0.2％阿可辛蓝、10ml的pH值7.5的浓度为1M Tris-HCl缓冲液、1ml浓度为1M MgCl2溶液、65.2ml的体积分数为95％的乙醇混合后加双蒸水至100ml。
优选的技术方案为：所述溶液D的配置方法：84.2ml的体积分数为95％的乙醇、10ml的pH值7.5的浓度为1M Tris-HCl缓冲液和1ml浓度为1M MgCl2溶液混合后加双蒸水至100ml。
优选的技术方案为：所述溶液E的配置方法：52.6ml的体积分数为95％的乙醇和混合后加双蒸水至100ml。
优选的技术方案为：所述溶液F的配置方法：26.4ml的体积分数为95％的乙醇和混合后加双蒸水至100ml。
优选的技术方案为：所述溶液G的配置方法：取10mL的体积分数为30％的H2O2加双蒸水至50mL；所述溶液H的配置方法：取2.5ml的质量分数为20％的KOH定容至50ml。
优选的技术方案为：所述溶液I的配置方法：25ml的甘油和0.5ml的质量分数为20％的KOH溶液加双蒸水至100ml。
优选的技术方案为：所述溶液I的配置方法：50ml的甘油和0.5ml的质量分数为20％的KOH溶液加双蒸水至100ml。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本试剂盒能快速获得完整的斑马鱼软骨染色结果。
2、本试剂盒省去了繁琐的试剂配制过程，避免了配制试剂差异造成的实验误差。
3、本试剂盒大部分试剂均在(25℃)恒定条件下，保障了实验结果的重复性。
5、本试剂盒极大简化了实验步骤，真正做到快速，简便，高效。
附图说明
图1斑马鱼软骨染色方法及其一步法试剂盒染色结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1-3：斑马鱼软骨染色一步法试剂盒
溶液配制：
溶液A：4％多聚甲醛溶液为市售产品。
溶液B：100mM的Triss-HCl缓冲液(pH7.5)与10mM MgCl2混合液，100ml。
10ml的1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)+1ml的1M MgCl2，混合后加双蒸水至100ml。
1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)配制方法：12.14g的Tris溶于去离子水中，充分搅拌溶解，加HCl调节pH至7.5(所需浓盐酸的体积为6.6-7.1ML)；定容至100ml，高温高压灭菌(约半小时)后，室温保存。
1M MgCl2配制方法：称取3.0495g MgCl2，溶于15ml双蒸水。
溶液C：0.04％阿可辛蓝与10mM MgCl2混合液，100ml。
配制方法：20ml的0.2％阿可辛蓝(上清液)、10ml的1M的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、1ml的1MMgCl2、65.2ml的体积分数为95％无水乙醇，混合后加双蒸水至100ml。
0.2％阿可辛蓝与90％无水乙醇混合液(10ml)的配制方法：0.02g的阿可辛蓝8GX溶于1.25ml的体积分数为50％的乙醇，加热并剧烈震荡使其溶解，再加8.88ml的体积分数为95％无水乙醇，再加600μl的盐酸，剧烈震荡使其完全溶解，静置后如果出现沉淀，可取上清液。
溶液D：体积分数为80％的无水乙醇与10mM MgCl2混合液，100ml。配制方法：
84.2ml的体积分数为95％无水乙醇、10ml的1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)和1ml的1M MgCl2混合后加双蒸水至100ml。
溶液E：50％无水乙醇，100ml。配制方法：
52.6ml的体积分数为95％无水乙醇、10ml的1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合后加双蒸水至100ml。
溶液F：25％无水乙醇，100ml。配制方法：
26.4ml ml的体积分数为95％无水乙醇、10ml的1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合后加双蒸水至100ml。
3％H2O2和0.5％KOH混合液配制方法：
等量的6％H2O2和1％KOH混合即可。注：在使用前混合。
溶液G：6％H2O2：取10mL体积分数为30％d额加双蒸水至50ml。
溶液H：1％KOH：取20％KOH2.5ml定容至50ml。
20％的KOH：称取20gKOH(固体)加入100ml的双蒸水。
25％甘油和0.1％KOH混合液(100ml)--溶液I
25ml 100％甘油 0.5ml 20％KOH
加双蒸水至100ml。
50％甘油和0.1％KOH混合液(100ML)-溶液J
50ml 100％甘油 0.5ml 20％KOH
加双蒸水至100ml。
阿可辛蓝，又可称之为阿尔新蓝(Alcian)、爱先蓝或阿尔辛蓝等，是一种类铜钛花青共轭染料，最初用于纺织纤维染色。这种阳离子染料与酸性基团结合，也即阿尔辛蓝与组织内含有的阴离子基团如羧基和硫酸根形成不溶性复合物。该异硫脲基呈中度碱性，使阿尔新蓝带阳离子。
阿尔新蓝使碳水化合物着色的确切机制不明，普遍认为是阳离子的异硫脲基通过静电与组织内的多聚阴离子相连。阿尔辛蓝不能沉淀糖原，硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝酸和透明质酸的羧基或硫酸根在pH值为2.5时发生电离，从而带负电荷。这导致结缔组织和软骨中的酸性黏液物质(如蛋白多糖/透明质酸以及上皮酸性黏蛋白)与阿尔辛蓝发生反应，形成不溶性复合物，即染料分子中带正电荷的盐键和酸性黏液物质中带负电荷的酸性基团结合呈蓝色。注意：该产品常温避光保存，部分溶液4℃保存(溶液G、溶液H)。
试剂盒的使用方法：
1、根据所需要的时间点取样，EP管内取斑马鱼幼鱼10条，用1ml溶液A(固定液)固定，4℃保存至少6小时。建议做软骨染色时，早上收完样固定后，下午4点左右开始漂洗然后过夜染色。至少固定6小时后进行实验，若幼鱼未沉到EP管底建议加长固定时间，通常固定24小时。
2、吸出管内溶液弃去，加入1ml溶液B(漂洗液)洗10分钟，室温下摇床摇动。吸去溶液或注入溶液时都要缓慢，尽可能的不要把鱼冲起来，防止鱼组织破损，摇床调到最小转速。
3、吸出管内溶液弃去，加入1ml溶液C(染色液)室温下摇床摇动,染色(约17小时)。室内温度合适时可以室内过夜(约24-30℃)，室内温度较低时，可以在培养箱中过夜。温度影响染色时间，温度太低染色时间加长。吸去溶液或注入溶液时都要缓慢，尽可能的不要把鱼冲起来，防止鱼组织破损，摇床调到最小转速。
4、吸出管内溶液弃去，加入1ml溶液D(脱色处理A液)洗5分钟，室温下摇床摇动。吸去溶液或注入溶液时都要缓慢，尽可能的不要把鱼冲起来，防止鱼组织破损，摇床调到最小转速。
5、吸出管内溶液弃去，加入1ml溶液E(脱色处理B液)洗5分钟,室温下摇床摇动。吸去溶液或注入溶液时都要缓慢，尽可能的不要把鱼冲起来，防止鱼组织破损，摇床调到最小转速。
6、吸出管内溶液弃去，加入1ml溶液F(脱色处理C液)洗5分钟,室温下摇床摇动。吸去溶液或注入溶液时都要缓慢，尽可能的不要把鱼冲起来，防止鱼组织破损，摇床调到最小转速。
7、吸出管内溶液弃去，加入1ml现配的漂白液去色素，室温下摇床摇动，每10分钟观察一次(约30-45分钟即可)
配制1ml漂白液：取溶液G(漂白A液)0.5ml加入等量的溶液H(漂白B液)0.5ml充分混匀。
溶液一定要现配现用，建议每个EP管内加入700-800μl，防止溶液震摇导致溶液喷出，或者打开EP管盖摇晃，摇床调到最小转速。根据色素漂白的情况而定漂白时间，色素会影响拍照效果。软骨约30-45分钟左右可以吸几条鱼到显微镜下观察，色素是否漂干净，漂洗干净的鱼体呈淡黄色透明无色素，眼睛呈淡黄色。
8、吸出管内溶液弃去，加入1ml溶液I(清洗液)洗10分钟，2-3次，室温下摇床摇动。可以增加漂洗次数直到无气泡。注意：吸去溶液或注入溶液时都要缓慢，幼鱼鱼体透明，小心吸出溶液切勿把鱼吸走，建议用玻璃移液枪，摇床调到最小转速。
9、吸出管内溶液弃去，加入1ml溶液J(保存液)浸泡保存。注意：吸去溶液或注入溶液时都要缓慢，尽可能的不要把鱼冲起来，防止鱼组织破损，摇床调到最小转速。
10、拍照。注意：将染色完成的斑马鱼用玻璃移液器放在100％甘油中，拍每条斑马鱼的背面，侧面，腹部的照片。如图1所示。
注意事项：
1、固定时间可根据幼鱼是否沉到EP管底，建议固定一天，固定时间越长，漂白所需的时间减短。
2、去色素：溶液一定要现配现用，建议每个EP管内加入700-800μl，防止溶液震摇导致溶液喷出。
3、根据色素漂白的情况而定漂白时间，软骨染色参考时间约30-45分钟左右可以吸几条鱼到显微镜下观看，色素是否漂干净。
4、摇床开到最小，剧烈摇晃会使鱼组织破损。
5、吸去溶液或注入溶液时都要缓慢，尽可能的不要把鱼冲起来，防止鱼组织破损，建议用玻璃移液枪。
6、拍照：将染色完成的斑马鱼用玻璃移液器放在100％甘油中，拍每条斑马鱼的背面，侧面，腹部。
实施例4：斑马鱼软骨染色一步法试剂盒
一种斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，包括溶液A、溶液B、溶液C、溶液D、溶液E、溶液F、溶液G、溶液H、溶液I和溶液J；所述溶液A为4％多聚甲醛溶液，所述溶液B由pH值7.5的浓度为100mM的Tris-HCl缓冲液与浓度为10mM的MgCl2溶液组成的混合液；溶液C由0.04％阿可辛蓝与浓度为10mM的MgCl2溶液组成的混合液；溶液D由体积分数为80％的乙醇与浓度为10mM的MgCl2溶液组成的混合液；溶液E为体积分数为50％的乙醇；溶液F为体积分数为25％的乙醇；溶液G为体积分数6％的H2O2；溶液H为质量分数1％的KOH；溶液I为体积分数为的25％甘油和质量分数为0.1％的KOH溶液组成的混合液；溶液J为体积分数为的50％甘油和质量分数为0.1％的KOH溶液组成的混合液。
优选的实施方式为：所述溶液B的配置方法：10ml的pH值7.5的浓度为1M Tris-HCl缓冲液和1ml浓度为1M MgCl2溶液混合后加双蒸水至100ml。
优选的实施方式为：所述溶液C的配置方法：20ml的0.2％阿可辛蓝、10ml的pH值7.5的浓度为1M Tris-HCl缓冲液、1ml浓度为1M MgCl2溶液、65.2ml的体积分数为95％的乙醇混合后加双蒸水至100ml。
优选的实施方式为：所述溶液D的配置方法：84.2ml的体积分数为95％的乙醇、10ml的pH值7.5的浓度为1M Tris-HCl缓冲液和1ml浓度为1M MgCl2溶液混合后加双蒸水至100ml。
优选的实施方式为：所述溶液E的配置方法：52.6ml的体积分数为95％的乙醇和混合后加双蒸水至100ml。
优选的实施方式为：所述溶液F的配置方法：26.4ml的体积分数为95％的乙醇和混合后加双蒸水至100ml。
优选的实施方式为：所述溶液G的配置方法：取10mL的体积分数为30％的H2O2加双蒸水至50mL；所述溶液H的配置方法：取2.5ml的质量分数为20％的KOH定容至50ml。
优选的实施方式为：所述溶液I的配置方法：25ml的甘油和0.5ml的质量分数为20％的KOH溶液加双蒸水至100ml。
优选的实施方式为：所述溶液I的配置方法：50ml的甘油和0.5ml的质量分数为20％的KOH溶液加双蒸水至100ml。
本实施例中的其它试剂采用市售产品。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (9)
1.一种斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，其特征在于：包括溶液A、溶液B、溶液C、溶液D、溶液E、溶液F、溶液G、溶液H、溶液I和溶液J；所述溶液A为4%多聚甲醛溶液，所述溶液B由pH值7.5的浓度为100mM的Tris-HCl缓冲液与浓度为10mM的 MgCl2溶液组成的混合液；溶液C由0.04%阿可辛蓝与浓度为10mM 的MgCl2溶液组成的混合液；溶液D由体积分数为80%的乙醇与浓度为10mM 的MgCl2溶液组成的混合液；溶液E为体积分数为50%的乙醇；溶液F为体积分数为25%的乙醇；溶液G为体积分数6%的 H2O2；溶液H为质量分数1%的KOH；溶液I为体积分数为的25%甘油和质量分数为0.1% 的KOH溶液组成的混合液；溶液J为体积分数为的50%甘油和质量分数为0.1% 的 KOH溶液组成的混合液。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，其特征在于：所述溶液B的配置方法：10ml的pH值7.5的浓度为1M Tris-HCl缓冲液和1ml浓度为1M MgCl2溶液混合后加双蒸水至100ml。
3.根据权利要求1所述的斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，其特征在于：所述溶液C的配置方法：20ml的0.2%阿可辛蓝、10ml的pH值7.5的浓度为1M Tris-HCl缓冲液、1ml浓度为1MMgCl2溶液、65.2ml的体积分数为95%的乙醇混合后加双蒸水至100ml。
4.根据权利要求1所述的斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，其特征在于：所述溶液D的配置方法：84.2ml的体积分数为95%的乙醇、10ml的pH值7.5的浓度为1M Tris-HCl缓冲液和1ml浓度为1M MgCl2溶液混合后加双蒸水至100ml。
5.根据权利要求1所述的斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，其特征在于：所述溶液E的配置方法：52.6ml的体积分数为95%的乙醇和混合后加双蒸水至100ml。
6.根据权利要求1所述的斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，其特征在于：所述溶液F的配置方法：26.4ml的体积分数为95%的乙醇和混合后加双蒸水至100ml。
7.根据权利要求1所述的斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，其特征在于：所述溶液G的配置方法：取10mL的体积分数为 30%的H2O2加双蒸水至50mL；所述溶液H的配置方法：取2.5ml的质量分数为20%的KOH定容至50ml。
8.根据权利要求1所述的斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，其特征在于：所述溶液I的配置方法：25ml的甘油和0.5ml的质量分数为20%的KOH溶液加双蒸水至100ml。
9.根据权利要求1所述的斑马鱼软骨染色一步法试剂盒，其特征在于：所述溶液I的配置方法：50ml的甘油和0.5ml的质量分数为20%的KOH溶液加双蒸水至100ml。
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