JP2003528175A - 大腸菌からのリポ多糖 - Google Patents
大腸菌からのリポ多糖Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、Ｅ．コリ ＤＳＭ６６０１から抽出されたリポ多糖に関する。このＬＰＳは、Ｅ．コリからの従来公知のＬＰＳとは、コアのホスホリル化された糖部及びＯ-鎖の重合度において異なっている。このリポイドＡは、構造的及び生物学的にはＥ．コリの通常のタイプに相当する。記載のＬＰＳは、それを担持している大腸菌株の同定のために好適であるばかりでなく、これに、その免疫調節作用の保持下に、低められた病原性をも与える。
Description
【０００１】
本発明は大腸菌（Ｅ．コリ）からの新規リポ多糖に関する。
【０００２】
内毒素は、外毒素とは反対に、生きている細菌から分泌されず、特に自己分解
により放出される細菌構成成分であると理解される。いわゆる典型的な内毒素は
、グラム陰性細菌の外細胞膜からの熱安定性のリポ多糖であり、以後これをＬＰ
Ｓと記載する。ＬＰＳは、いわゆるリポイドＡ、コアオリゴ糖並びに特異的なＯ
-鎖からなっており、この際、このリポイドＡは、ＬＰＳの毒性作用に関与して
いる。
により放出される細菌構成成分であると理解される。いわゆる典型的な内毒素は
、グラム陰性細菌の外細胞膜からの熱安定性のリポ多糖であり、以後これをＬＰ
Ｓと記載する。ＬＰＳは、いわゆるリポイドＡ、コアオリゴ糖並びに特異的なＯ
-鎖からなっており、この際、このリポイドＡは、ＬＰＳの毒性作用に関与して
いる。
【０００３】
内毒素は、マクロ生体中で、免疫系のメディエーター、例えばインタ−ロイキ
ン１（略字ＩＬ-１）及び腫瘍-壊死-因子（略字ＴＮＦα）の生産を促進する。
ン１（略字ＩＬ-１）及び腫瘍-壊死-因子（略字ＴＮＦα）の生産を促進する。
【０００４】
腸内細菌、殊にＥ．コリの内毒素の組成に関しては、既に一連の研究が実施さ
れており、この際、Ｓ/Ｒ-突然変異株は通常は、１個のみの繰返し単位、即ち、
そのＯ-鎖の１個の”繰返し単位”を含有することが確認された（図１参照）。
この場合に、Ｏ-鎖の重合酵素をコードする遺伝子は欠損しており、従って、１
個のみの繰返し単位がコアオリゴ糖上に転移されることから出発する。ＬＰＳ-
構造類似タイプであるが他の構造が、屡々ヒト病原菌、例えばナイセリア（Neis
seria)、ビブリオ（Vibrio)、カンピロバクター（Campylobacter) 、ヘリコバク
ター（Helicobacter)等中に見出される。これらの菌は、特別な分子擬態（Mimik
ri)、特に、哺乳動物の糖蛋白質及び糖脂質に似ているシアル酸及びシアル酸含
有オリゴ糖の存在により、宿主の免疫抵抗を抑制することを可能にするＬＰＳを
含有する。Ｅ．コリ ＤＳＭ６６０１に関して、Ｏ６-セロタイプが確認された
。この構造は、P. E. Jansson et. al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283
により研究されており、公開されている。この構造は、図２に記載の式に相当す
る。
れており、この際、Ｓ/Ｒ-突然変異株は通常は、１個のみの繰返し単位、即ち、
そのＯ-鎖の１個の”繰返し単位”を含有することが確認された（図１参照）。
この場合に、Ｏ-鎖の重合酵素をコードする遺伝子は欠損しており、従って、１
個のみの繰返し単位がコアオリゴ糖上に転移されることから出発する。ＬＰＳ-
構造類似タイプであるが他の構造が、屡々ヒト病原菌、例えばナイセリア（Neis
seria)、ビブリオ（Vibrio)、カンピロバクター（Campylobacter) 、ヘリコバク
ター（Helicobacter)等中に見出される。これらの菌は、特別な分子擬態（Mimik
ri)、特に、哺乳動物の糖蛋白質及び糖脂質に似ているシアル酸及びシアル酸含
有オリゴ糖の存在により、宿主の免疫抵抗を抑制することを可能にするＬＰＳを
含有する。Ｅ．コリ ＤＳＭ６６０１に関して、Ｏ６-セロタイプが確認された
。この構造は、P. E. Jansson et. al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283
により研究されており、公開されている。この構造は、図２に記載の式に相当す
る。
【０００５】
大腸菌のリポイドＡも種々の研究グループにより研究されており、この際、こ
のリポイドＡの構造は通常はヘキサアシル形で存在し、Ｅ．コリの全てのセロタ
イプに一致することが明らかになった（図３）。このヘキサアシル化合物の構造
は、１９８４年に、Th. Rietschel et al., Structure and conformation of th
e lipid A component of lipopolysaccharides; Handbook of Endotoxins (Proc
tor, R., ed.), Vol. 1, Chemistry of Endotoxin (E. Th. Rietschel, ed. ),
Elsvier, Amsterdam (1984), pp. 187-220 に開示されており、図３中の記載に
相当する。
のリポイドＡの構造は通常はヘキサアシル形で存在し、Ｅ．コリの全てのセロタ
イプに一致することが明らかになった（図３）。このヘキサアシル化合物の構造
は、１９８４年に、Th. Rietschel et al., Structure and conformation of th
e lipid A component of lipopolysaccharides; Handbook of Endotoxins (Proc
tor, R., ed.), Vol. 1, Chemistry of Endotoxin (E. Th. Rietschel, ed. ),
Elsvier, Amsterdam (1984), pp. 187-220 に開示されており、図３中の記載に
相当する。
【０００６】
特異的なＯ-鎖及びリポイドＡが、コアオリゴ糖を介して相互に結合している
。従来、Ｅ．コリでは５種の異なるコアオリゴ糖が公知であり；その限りにおい
て次の文献を参照する；O. Holst et al., Chemical structure of the core re
gion of lipopolysaccharide, in : Bactereal Endotoxic Lipopolysaccharides
, Vol. 1, Morrison D. C. and Ryan, J. L. (eds.), Boca Raton, FL, USA (19
92) , pp. 135-170( 図４参照）。
。従来、Ｅ．コリでは５種の異なるコアオリゴ糖が公知であり；その限りにおい
て次の文献を参照する；O. Holst et al., Chemical structure of the core re
gion of lipopolysaccharide, in : Bactereal Endotoxic Lipopolysaccharides
, Vol. 1, Morrison D. C. and Ryan, J. L. (eds.), Boca Raton, FL, USA (19
92) , pp. 135-170( 図４参照）。
【０００７】
Ｅ．コリ菌株 ＤＳＭ６６０１のＬＰＳの研究の際に、このリポイドＡは、そ
の組成において、そのほかにもＥ．コリについて記載のリポイドＡのヘキサアシ
ル形に相当することが明らかになっている。
の組成において、そのほかにもＥ．コリについて記載のリポイドＡのヘキサアシ
ル形に相当することが明らかになっている。
【０００８】
ヒト単球中でのＩＬ-１及びＴＮＦαの放出に関する研究は、リポイドＡが同
じ活性を有し、従って、高い確率でＥ．コリ リポイドＡの公知構造に相当する
ことを確認している（図５及び図６参照）。これらの想定は、化学分析により確
認された。
じ活性を有し、従って、高い確率でＥ．コリ リポイドＡの公知構造に相当する
ことを確認している（図５及び図６参照）。これらの想定は、化学分析により確
認された。
【０００９】
Ｅ．コリ ＤＳＭ６６０１の特異的Ｏ-抗原の構造は、明らかに１個のみの特
有の”繰返し単位”が規則的にこの鎖中に存在する（図１参照）事実により意想
外であり、このことは、菌株ＤＳＭ６６０１が、ヒト単離体にとっては極めて異
例であるＳ/Ｒ-突然変異株であることを推論させる。しかしながら、この”繰返
し単位”の構造は、血清学的分析が示しているように、Ｅ．コリ Ｏ６のＯ-鎖
の基本型に相当する。
有の”繰返し単位”が規則的にこの鎖中に存在する（図１参照）事実により意想
外であり、このことは、菌株ＤＳＭ６６０１が、ヒト単離体にとっては極めて異
例であるＳ/Ｒ-突然変異株であることを推論させる。しかしながら、この”繰返
し単位”の構造は、血清学的分析が示しているように、Ｅ．コリ Ｏ６のＯ-鎖
の基本型に相当する。
【００１０】
菌株ＤＳＭ６６０１におけるコア-領域は、公知のＲ１-構造に相当する。しか
しながら、構造的特別性は、ＬＰＳ１分子当たり８個のホスフェート基が分析的
に確認されたことにあり、この際、リポイドＡには通常２個のみのホスフェート
が分配されている。更に、ピロホスホエタノールアミンの非化学当量的含分が見
い出された。
しながら、構造的特別性は、ＬＰＳ１分子当たり８個のホスフェート基が分析的
に確認されたことにあり、この際、リポイドＡには通常２個のみのホスフェート
が分配されている。更に、ピロホスホエタノールアミンの非化学当量的含分が見
い出された。
【００１１】
従って、要約すると、菌株ＤＳＭ６６０１のＬＰＳは、Ｅ．コリからの従来公
知のＬＰＳとは、殊にコアのホスホリル化された糖部及びＯ-鎖の重合度におい
て著しく異なっていることが確認できる。このリポイドＡは、構造的及び生物学
的に、生物学的作用効果においてこの物質の役割を発揮させるＥ．コリに通常の
タイプに相当する。記載のＬＰＳは、これを担持する大腸菌菌株の同定のために
好適であるばかりでなく、これに、その免疫調節作用の保持下に、低下された病
原性をも与える。Ｏ-鎖がα−グリコシド結合の代わりにβ−グリコシド結合し
ている事実は、Ｅ．コリのこのＳ/Ｒ-突然変異株ＤＳＭ６６０１の例で、はじめ
て明白に示すことができた。
知のＬＰＳとは、殊にコアのホスホリル化された糖部及びＯ-鎖の重合度におい
て著しく異なっていることが確認できる。このリポイドＡは、構造的及び生物学
的に、生物学的作用効果においてこの物質の役割を発揮させるＥ．コリに通常の
タイプに相当する。記載のＬＰＳは、これを担持する大腸菌菌株の同定のために
好適であるばかりでなく、これに、その免疫調節作用の保持下に、低下された病
原性をも与える。Ｏ-鎖がα−グリコシド結合の代わりにβ−グリコシド結合し
ている事実は、Ｅ．コリのこのＳ/Ｒ-突然変異株ＤＳＭ６６０１の例で、はじめ
て明白に示すことができた。
【００１２】
Ｅ．コリ ＤＳＭ６６０１のリポ多糖（ＬＰＳ）は、一方で、従来公知の部分
構造から成り（Ｏ-特異的鎖、コアオリゴ糖及びリポイドＡ）、他方、ここに存
在する複合形で、はじめてかつ完全に構造的に特徴付けられた、新規のスムース
-ラフ（smooth-rough)（Ｓ/Ｒ）-構造である（図７参照）。セロタイプＯ６の１
個のみの特有の繰返し単位（repeating unit)からなるこのＯ-特異的鎖は、コア
オリゴ糖にβ−グリコシド結合しており、従って、Ｏ-鎖内（α−グリコシド性
）とは異なって結合している。このコアオリゴ糖はＲ１-構造を有し、Ｒ１-特異
性抗体を用いる血清学的調査により確認される化学的調査結果を示す。このリポ
イドＡ-成分は、Ｅ．コリ リポイドＡに特徴的な特定の化学的構成を有する。
構造から成り（Ｏ-特異的鎖、コアオリゴ糖及びリポイドＡ）、他方、ここに存
在する複合形で、はじめてかつ完全に構造的に特徴付けられた、新規のスムース
-ラフ（smooth-rough)（Ｓ/Ｒ）-構造である（図７参照）。セロタイプＯ６の１
個のみの特有の繰返し単位（repeating unit)からなるこのＯ-特異的鎖は、コア
オリゴ糖にβ−グリコシド結合しており、従って、Ｏ-鎖内（α−グリコシド性
）とは異なって結合している。このコアオリゴ糖はＲ１-構造を有し、Ｒ１-特異
性抗体を用いる血清学的調査により確認される化学的調査結果を示す。このリポ
イドＡ-成分は、Ｅ．コリ リポイドＡに特徴的な特定の化学的構成を有する。
【００１３】
Ｅ．コリ菌株 ＤＳＭ６６０１のこのＬＰＳは、意想外の均一性を有する。こ
の形ではじめて記載される、ホスフェート置換基に関する一つの不均一性（ＰＰ
及びＰ-Ｅtn対Ｐ及びＰ）を確認することができるだけである。複雑なＮＭＲ-分
析を用いて、コアオリゴ糖中のＰ-Ｅtn-置換基を、第２ヘプトース（ＨｅｐＩＩ ）の位置２中のＲ１-コアオリゴ糖に明確に割り当てることができた。
の形ではじめて記載される、ホスフェート置換基に関する一つの不均一性（ＰＰ
及びＰ-Ｅtn対Ｐ及びＰ）を確認することができるだけである。複雑なＮＭＲ-分
析を用いて、コアオリゴ糖中のＰ-Ｅtn-置換基を、第２ヘプトース（ＨｅｐＩＩ ）の位置２中のＲ１-コアオリゴ糖に明確に割り当てることができた。
【００１４】
菌株ＤＳＭ６６０１のこのＬＰＳの完全な構造は、図７に記載されている。
【００１５】
次に、実施例につき本発明を詳述する：
例１
ＬＰＳの製造
洗浄され、かつ乾燥された細菌物質から、変更フェノール/水-抽出によりＬＰ
Ｓを取得した；その限りにおいて、O. Westphal. et al., Bacterial Lipopolys
accharides , Extraction with Phenol-Water and Further Applications of th
e Procedure, Meth. Carbohydr. Chem. , Vol. V (1965) pp. 83-91 が参照され
る。
Ｓを取得した；その限りにおいて、O. Westphal. et al., Bacterial Lipopolys
accharides , Extraction with Phenol-Water and Further Applications of th
e Procedure, Meth. Carbohydr. Chem. , Vol. V (1965) pp. 83-91 が参照され
る。
【００１６】
凍結乾燥された細菌（これは予め蒸留水で２回洗浄された）４７ｇを、Westph
al 及びJann により相応して変更された処方に従って抽出した。この変更は、場
合による異種蛋白質及びＤＮＡ／ＲＮＡ-成分を除去するために役立つ引き続く
水性抽出物の酵素処理（ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、プロティナーゼＫ）より成る
。このために、水相（約１.２リットル）に、室温で、それぞれＲＮアーゼ（リ
ボヌクレアーゼＡ、牛パンクレアーゼ、シグマ）２０ｍｇ及びＤＮアーゼ（ＤＮ
アーゼＩ、牛パンクレアーゼ、グレードＩＩ、シグマ）２０ｍｇを加え、この混
合物を室温で３０時間撹拌した。引き続き、プロテイナーゼＫ（Tritirachium a
lbum, Boeringer, Mannheim ) ２０ｍｇを加え、更に１２時間撹拌した。次いで
、この懸濁液を４℃で２４時間、蒸留水１５リットルに対して３回透析させ、そ
の後凍結乾燥させた。この酵素処理された抽出物を、改めて蒸留水中に入れて、
５０ｍｇ/ｌの最終濃度に達成させる。この懸濁液を冷時に３回超遠心した（１
５５０００×ｇ、４℃、４時間）。沈殿物（ＬＰＳ）を蒸留水１５０ｍｌ中に入
れ、もう１度３日間水に対して透析させ、その後凍結乾燥させる（ＬＰＳ収量：
１.４５ｇ、３.１％ｍ/ｍ）。
al 及びJann により相応して変更された処方に従って抽出した。この変更は、場
合による異種蛋白質及びＤＮＡ／ＲＮＡ-成分を除去するために役立つ引き続く
水性抽出物の酵素処理（ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、プロティナーゼＫ）より成る
。このために、水相（約１.２リットル）に、室温で、それぞれＲＮアーゼ（リ
ボヌクレアーゼＡ、牛パンクレアーゼ、シグマ）２０ｍｇ及びＤＮアーゼ（ＤＮ
アーゼＩ、牛パンクレアーゼ、グレードＩＩ、シグマ）２０ｍｇを加え、この混
合物を室温で３０時間撹拌した。引き続き、プロテイナーゼＫ（Tritirachium a
lbum, Boeringer, Mannheim ) ２０ｍｇを加え、更に１２時間撹拌した。次いで
、この懸濁液を４℃で２４時間、蒸留水１５リットルに対して３回透析させ、そ
の後凍結乾燥させた。この酵素処理された抽出物を、改めて蒸留水中に入れて、
５０ｍｇ/ｌの最終濃度に達成させる。この懸濁液を冷時に３回超遠心した（１
５５０００×ｇ、４℃、４時間）。沈殿物（ＬＰＳ）を蒸留水１５０ｍｌ中に入
れ、もう１度３日間水に対して透析させ、その後凍結乾燥させる（ＬＰＳ収量：
１.４５ｇ、３.１％ｍ/ｍ）。
【００１７】
例２
Ｅ．コリ菌株 ＤＳＭ６６０１からのＬＰＳの分析
変更モルガン-エルソン-テスト（Strominger, J. L. Park, J.T. Thompson, R
. E. J. Biol. Chem. 234, 3263-3268 (1959) ）によるが、選択的にＨＰＬＣ（
ＰＩＣＯ-ＴＡＧ、水）をも用いて、ヘキソサミン（ＨｅｘＮ）（ここで、グル
コサミン＋ガラクトサミン、ＧｌｃＮ＋ＧａｌＮを意味する）を測定した。モル
ガン-エルソン-テストとは対照的に、この分析法では、ＧｌｃＮ及びＧａｌＮを
別々に測定し、かつ定量することができるだけではなく、更にＧｌｃＮ-ホスフ
ェート、２-エタノールアミン（Ｅtn）及び２-エタノールアミンホスフェート（
Ｅtn-Ｐ）（これらは屡々ＬＰＳ中に存在する）の存在をも並行して測定するこ
とができる。気-液クロマトグラフィ（ＧＣ）を、Varian 3700 GC又はHewlett P
ackard(HP 5890 Serie III）ガスクロマトグラフで、毛細管カラム（fused-sili
ca SPB-5（Ｒ）、30m、Supelco) 上で実施した。組み合わされた気-液クロマト
グラフ/質量分析（ＧＣ-ＭＳ）を、ＨＰ-１毛細管カラム（３０ｍ、Hewlett Pac
kard）を備えた質量分析計(HP Modell 5890）で行った。ＧＣ-及びＧＣ-ＭＳ分
析が、それらのアルジトールアセテート（Alditolacetate)としての中性糖（Ｇ
ｌｃ、Ｇａｌ、Ｈｅｐ、Ｍａｎ）の測定のために使用され（Sawardeker, J. S.,
Slonerker, J. H. Jeanes, A. Anal. Chem. 37, 1602-1604 (1967)) 、並びに
それらの脂肪酸メチルエステル-誘導体としての脂肪酸の測定及び定量のために
は、強力なメタノール分解（２Ｍ ＨＣｌ／ＭｅＯＨ、１２０℃、１６時間）（
Wollenweber, H. W. and Rietschel, E. Th. ,Analysis of lipopolysaccharide
(lipid A) fatty acids, J. Microbiol. Meth. 11, (1990) 195-211) 及びクロ
ロホルムでの抽出の後に使用された。この双方のＧＣ-分析法では、１５０℃（
３分間等温）で開始し、５℃/ｍｉｎの直線的温度勾配を用いて３２０℃まで高
めた。ホスフェートは、Lowry et al., (Lowry, O. H., Roberts, N. R., Leine
r, K. Y., Wu, M. KＬ. Farr, A. L., J. Biol. Chem. 207, 1-17 (1954) )によ
り、かつ２-ケト-３-デソキシ-Ｄ-マンノ-オクツロソン酸（Ｋｄｏ）は、チオバ
ルビツール酸テストを用いて測定された（Waravdekar, V. C. & Saslaw, L. D.,
J. Biol. Chem. 234, 1945-1950 (1959))。
. E. J. Biol. Chem. 234, 3263-3268 (1959) ）によるが、選択的にＨＰＬＣ（
ＰＩＣＯ-ＴＡＧ、水）をも用いて、ヘキソサミン（ＨｅｘＮ）（ここで、グル
コサミン＋ガラクトサミン、ＧｌｃＮ＋ＧａｌＮを意味する）を測定した。モル
ガン-エルソン-テストとは対照的に、この分析法では、ＧｌｃＮ及びＧａｌＮを
別々に測定し、かつ定量することができるだけではなく、更にＧｌｃＮ-ホスフ
ェート、２-エタノールアミン（Ｅtn）及び２-エタノールアミンホスフェート（
Ｅtn-Ｐ）（これらは屡々ＬＰＳ中に存在する）の存在をも並行して測定するこ
とができる。気-液クロマトグラフィ（ＧＣ）を、Varian 3700 GC又はHewlett P
ackard(HP 5890 Serie III）ガスクロマトグラフで、毛細管カラム（fused-sili
ca SPB-5（Ｒ）、30m、Supelco) 上で実施した。組み合わされた気-液クロマト
グラフ/質量分析（ＧＣ-ＭＳ）を、ＨＰ-１毛細管カラム（３０ｍ、Hewlett Pac
kard）を備えた質量分析計(HP Modell 5890）で行った。ＧＣ-及びＧＣ-ＭＳ分
析が、それらのアルジトールアセテート（Alditolacetate)としての中性糖（Ｇ
ｌｃ、Ｇａｌ、Ｈｅｐ、Ｍａｎ）の測定のために使用され（Sawardeker, J. S.,
Slonerker, J. H. Jeanes, A. Anal. Chem. 37, 1602-1604 (1967)) 、並びに
それらの脂肪酸メチルエステル-誘導体としての脂肪酸の測定及び定量のために
は、強力なメタノール分解（２Ｍ ＨＣｌ／ＭｅＯＨ、１２０℃、１６時間）（
Wollenweber, H. W. and Rietschel, E. Th. ,Analysis of lipopolysaccharide
(lipid A) fatty acids, J. Microbiol. Meth. 11, (1990) 195-211) 及びクロ
ロホルムでの抽出の後に使用された。この双方のＧＣ-分析法では、１５０℃（
３分間等温）で開始し、５℃/ｍｉｎの直線的温度勾配を用いて３２０℃まで高
めた。ホスフェートは、Lowry et al., (Lowry, O. H., Roberts, N. R., Leine
r, K. Y., Wu, M. KＬ. Farr, A. L., J. Biol. Chem. 207, 1-17 (1954) )によ
り、かつ２-ケト-３-デソキシ-Ｄ-マンノ-オクツロソン酸（Ｋｄｏ）は、チオバ
ルビツール酸テストを用いて測定された（Waravdekar, V. C. & Saslaw, L. D.,
J. Biol. Chem. 234, 1945-1950 (1959))。
【００１８】
遊離のリポイドＡ及びコアオリゴ糖の製造及び精製
ＬＰＳ（２５８.８ｍｇ）を、０.１Ｍ ＮａＯＡｃ/ＨＯＡｃ（ｐＨ４.４）２
５ｍｌ中に懸濁させ、１００℃で１時間、温和な酸加水分解にかけた。その後、
加水分解物から親油性部分（リポイドＡ）をクロロホルム２５ｍｌを用いて３回
抽出した（収量２３.２ｍｇ）。有機相からのリポイドＡを、調製用（praeparat
ive)薄層クロマトグラフィ（ＰＳＣ）を用いて更に精製し（２ｍｍＰＳＣシリカ
ゲル６０プレート、Ｅ.Merk,Darmstadt）、これをクロロホルム/メタノール/水
１００：７５：１５（ｖ/ｖ/ｖ）を用いるクロマトグラフィにかけ、蒸留水中に
浸漬することにより展開させた。こうして、６フラクシヨンが得られ、それの主
フラクシヨン（Ｒｆ≒０.４）は、ジホスホリル化された精製ヘキサアシル-リポ
イドＡを表す（ＤＰＨＬＡ-Ｅｃ６６０１）。精製されたＤＰＨＬＡ-Ｅｃ６６０ １ （収量２.０６ｍｇ）を、クロロホルム-メタノール８：２（ｖ/ｖ）中に溶か
し、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳの前に、イオン交換体（Amberlite IRA 120、Ｈ＋-
形）で処理した。精製されたＤＰＨＬＡ-Ｅｃ６６０１の一部分（２５０μｇ）
を生物学的実験のために使用した。
５ｍｌ中に懸濁させ、１００℃で１時間、温和な酸加水分解にかけた。その後、
加水分解物から親油性部分（リポイドＡ）をクロロホルム２５ｍｌを用いて３回
抽出した（収量２３.２ｍｇ）。有機相からのリポイドＡを、調製用（praeparat
ive)薄層クロマトグラフィ（ＰＳＣ）を用いて更に精製し（２ｍｍＰＳＣシリカ
ゲル６０プレート、Ｅ.Merk,Darmstadt）、これをクロロホルム/メタノール/水
１００：７５：１５（ｖ/ｖ/ｖ）を用いるクロマトグラフィにかけ、蒸留水中に
浸漬することにより展開させた。こうして、６フラクシヨンが得られ、それの主
フラクシヨン（Ｒｆ≒０.４）は、ジホスホリル化された精製ヘキサアシル-リポ
イドＡを表す（ＤＰＨＬＡ-Ｅｃ６６０１）。精製されたＤＰＨＬＡ-Ｅｃ６６０ １ （収量２.０６ｍｇ）を、クロロホルム-メタノール８：２（ｖ/ｖ）中に溶か
し、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳの前に、イオン交換体（Amberlite IRA 120、Ｈ＋-
形）で処理した。精製されたＤＰＨＬＡ-Ｅｃ６６０１の一部分（２５０μｇ）
を生物学的実験のために使用した。
【００１９】
クロロホルム抽出の水相を凍結乾燥させ（収量：２７２ｍｇ）、このオリゴ糖
をＴＳＫ-カラム［３.５×９０ｃｍ、ＴＳＫ ＨＷ-４０（Ｓ）、E. Merck］を
用いて、ピリジン-酢酸-水８：２０：２０００（ｖ/ｖ/ｖ）中で更に精製した。
個々のオリゴ糖-フラクシヨン（プールＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を、ＧＣ-ＭＳ及びＮ
ＭＲ-分光分析法を用いて分析した。主フラクシヨン（プールＡ、＃２８-４１；
４９.０５ｍｇ）（これは、Ｏ-鎖の糖成分（Ｍａｎ、ＧａｌＮａｃ）をもコアオ
リゴ糖のそれ（Ｈｅｐ、Ｋｄｏ）をも含有する）を更に精製した。他のフラクシ
ヨンは、単糖類、Ｋｄｏの詳細に調査されなかった副産物（Artefakte) （アン
ヒドロ-及びラクトン）及び最後に塩を含有した。ＴＳＫ-分離の主フラクシヨン
は、ＧＣ-ＭＳ-分析でも、ＮＭＲ-分析でも、コアオリゴ糖（Ｋｄｏ、Gaｌ、Ｈ
ｅｐ）及びＯ-鎖（Ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃ）の全ての成分を示したので、更に後
処理した。
をＴＳＫ-カラム［３.５×９０ｃｍ、ＴＳＫ ＨＷ-４０（Ｓ）、E. Merck］を
用いて、ピリジン-酢酸-水８：２０：２０００（ｖ/ｖ/ｖ）中で更に精製した。
個々のオリゴ糖-フラクシヨン（プールＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を、ＧＣ-ＭＳ及びＮ
ＭＲ-分光分析法を用いて分析した。主フラクシヨン（プールＡ、＃２８-４１；
４９.０５ｍｇ）（これは、Ｏ-鎖の糖成分（Ｍａｎ、ＧａｌＮａｃ）をもコアオ
リゴ糖のそれ（Ｈｅｐ、Ｋｄｏ）をも含有する）を更に精製した。他のフラクシ
ヨンは、単糖類、Ｋｄｏの詳細に調査されなかった副産物（Artefakte) （アン
ヒドロ-及びラクトン）及び最後に塩を含有した。ＴＳＫ-分離の主フラクシヨン
は、ＧＣ-ＭＳ-分析でも、ＮＭＲ-分析でも、コアオリゴ糖（Ｋｄｏ、Gaｌ、Ｈ
ｅｐ）及びＯ-鎖（Ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃ）の全ての成分を示したので、更に後
処理した。
【００２０】
このために、先ず、オリゴ糖を均一まで精製するために、分析的高圧-アニオ
ン-交換-クロマトグラフィ（high pressure anion exchange chromatography, H
PAEC)が好適であるか否かを試験した。更に、複合糖構造（ＤＩＯＮＥＸ-系）の
分析のために、分析用Carbopac ＰＡ１カラム（４.６ｍｍ×２５０ｍｍ）及び直
線的塩-勾配（０℃で５分、次いで５０分間で０.５ＭＮａＯＡｃまで）で１ｍｌ
／ｍｉｎの流速を用いる特異的ＨＰＬＣ-法を使用した。溶離液を、パルス電流
測定検出器（ＰＡＤ）を用いて、還元当量（糖分子）につき検査した。この方法
で、４つのオリゴ糖-フラクシヨンを得ることができ、これらを、半調製用ＰＡ
ＥＣを用いて同様な方法で更に精製した。
ン-交換-クロマトグラフィ（high pressure anion exchange chromatography, H
PAEC)が好適であるか否かを試験した。更に、複合糖構造（ＤＩＯＮＥＸ-系）の
分析のために、分析用Carbopac ＰＡ１カラム（４.６ｍｍ×２５０ｍｍ）及び直
線的塩-勾配（０℃で５分、次いで５０分間で０.５ＭＮａＯＡｃまで）で１ｍｌ
／ｍｉｎの流速を用いる特異的ＨＰＬＣ-法を使用した。溶離液を、パルス電流
測定検出器（ＰＡＤ）を用いて、還元当量（糖分子）につき検査した。この方法
で、４つのオリゴ糖-フラクシヨンを得ることができ、これらを、半調製用ＰＡ
ＥＣを用いて同様な方法で更に精製した。
【００２１】
半調製用ＨＰＡＥＣは、CarboPac ＰＡ１カラム［（９ｍｍ×２５０ｍｍ）Dio
nex System］を用いて、分析用ＨＰＡＥＣにおけると同様な塩勾配（０で５分、
次いで５０分で０.５ＭＮａＯＡｃまで）及び４ｍｌ／ｍｉｎの流速で行った。
半調製用ＨＰＳＥＣ上へのオリゴ糖の施与（４２ｍｇ；ＴＳＫ-カラムからのプ
ールＡ）を、２つの類似のＨＰＡＥＣ-ランで行った。溶離液をそれぞれ１分当
たりのフラクシヨンで集めて、これらを、分析用ＨＰＡＥＣを用いて個々に調査
した。この方法で、半調製用ＨＰＡＥＣを用いて２つの主フラクシヨンが得られ
た（フラクシヨン１、保留時間ｔＲ〜１２分及びフラクシヨンＩＩ、ｔＲ〜１５
分）。双方のＨＰＡＥＣ-フラクシヨンは、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ及びＮＭＲ-
分析の前に、Ｇ-１０-カラム（２.５×１２０ｃｍ）を用いて脱塩しなければな
らなかった（収量：フラクシヨンＩ ４.６８ｍｇ；フラクシヨンＩＩ ４.３９
ｍｇ）。
nex System］を用いて、分析用ＨＰＡＥＣにおけると同様な塩勾配（０で５分、
次いで５０分で０.５ＭＮａＯＡｃまで）及び４ｍｌ／ｍｉｎの流速で行った。
半調製用ＨＰＳＥＣ上へのオリゴ糖の施与（４２ｍｇ；ＴＳＫ-カラムからのプ
ールＡ）を、２つの類似のＨＰＡＥＣ-ランで行った。溶離液をそれぞれ１分当
たりのフラクシヨンで集めて、これらを、分析用ＨＰＡＥＣを用いて個々に調査
した。この方法で、半調製用ＨＰＡＥＣを用いて２つの主フラクシヨンが得られ
た（フラクシヨン１、保留時間ｔＲ〜１２分及びフラクシヨンＩＩ、ｔＲ〜１５
分）。双方のＨＰＡＥＣ-フラクシヨンは、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ及びＮＭＲ-
分析の前に、Ｇ-１０-カラム（２.５×１２０ｃｍ）を用いて脱塩しなければな
らなかった（収量：フラクシヨンＩ ４.６８ｍｇ；フラクシヨンＩＩ ４.３９
ｍｇ）。
【００２２】
マトリックス-アシステッド レーザー脱離/イオン化 飛行時間（ＭＡＬＤＩ
-ＴＯＦ）質量分析法 マトリックス-アッシステッド レーザー脱離/イオン化 飛行時間質量分析（
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ）を、Bruker-ReflexＩＩ飛行時間分析器（Bruker-Fran
zen Analytik, Bremen) を用いて、もっぱら直線的構成及び負のモードで、２０
ｋＶの促進電圧及び”遅延イオン抽出”で記録した。先ず試料をクロロホルム中
に（リポイドＡ）又は蒸留水中に（オリゴ糖-フラクシヨン）１０μｇ/μｌの濃
度で溶かし、その少量分２μｌを０.５Ｍ２,４,６-トリヒドロキシアセトフェノ
ンより成るマトリックス溶液（Aldrich,Steinheim）２μｌと共にメタノール中
に溶かした。この混合物の少量（０.５μｌ）を金属ホールダー上に載せ、ドラ
イヤーで乾燥させた。
-ＴＯＦ）質量分析法 マトリックス-アッシステッド レーザー脱離/イオン化 飛行時間質量分析（
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ）を、Bruker-ReflexＩＩ飛行時間分析器（Bruker-Fran
zen Analytik, Bremen) を用いて、もっぱら直線的構成及び負のモードで、２０
ｋＶの促進電圧及び”遅延イオン抽出”で記録した。先ず試料をクロロホルム中
に（リポイドＡ）又は蒸留水中に（オリゴ糖-フラクシヨン）１０μｇ/μｌの濃
度で溶かし、その少量分２μｌを０.５Ｍ２,４,６-トリヒドロキシアセトフェノ
ンより成るマトリックス溶液（Aldrich,Steinheim）２μｌと共にメタノール中
に溶かした。この混合物の少量（０.５μｌ）を金属ホールダー上に載せ、ドラ
イヤーで乾燥させた。
【００２３】
ＮＭＲ分光分析法
１次元（１Ｄ）１Ｈ及び３１Ｐ-ＮＭＲ-及び２次元（２Ｄ）ＮＭＲ-スペクト
ルを、Bruker Avance DRX-600 Spectrometer (Bruker, Rheinstetten) を用いて
、かつ１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Bruker AMX-360-Spectrometer を用いて、
３００Ｋで、２Ｈ２Ｏ中で記録した。各々の測定の前に、試料を重水素化水（２ Ｈ２Ｏ）で２回凍結乾燥させた。外部参照シグナルとして、アセトン（δＨ２.
２２５ｐｐｍ、δｃ３１.４５ｐｐｍ）又は８５％Ｈ３ＰＯ４（δｐ ０ｐｐｍ
）を用いた。標準ブルカーソフトウエア（ＸＷＩＮＮＭＲ１.３）を、ＮＭＲ-デ
ータの記録のために使用した。ＴＯＣＳＹ（total correlated spectroscopy)
又はＮＯＥＳＹ(Nuclear Overhauser enhancement spectroscopy) の混合時間は
、１００又は５００ｍｓであった。
ルを、Bruker Avance DRX-600 Spectrometer (Bruker, Rheinstetten) を用いて
、かつ１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Bruker AMX-360-Spectrometer を用いて、
３００Ｋで、２Ｈ２Ｏ中で記録した。各々の測定の前に、試料を重水素化水（２ Ｈ２Ｏ）で２回凍結乾燥させた。外部参照シグナルとして、アセトン（δＨ２.
２２５ｐｐｍ、δｃ３１.４５ｐｐｍ）又は８５％Ｈ３ＰＯ４（δｐ ０ｐｐｍ
）を用いた。標準ブルカーソフトウエア（ＸＷＩＮＮＭＲ１.３）を、ＮＭＲ-デ
ータの記録のために使用した。ＴＯＣＳＹ（total correlated spectroscopy)
又はＮＯＥＳＹ(Nuclear Overhauser enhancement spectroscopy) の混合時間は
、１００又は５００ｍｓであった。
【００２４】
血清学的分析
血清学的分析をウエスタン-ブロットとして実施し、これを３種の異なる抗体
を用いて展開させた。
を用いて展開させた。
【００２５】
１. ポリクローナル抗-Ｏ６-抗血清（ウサギ）を、Ｅ．コリ菌株 ＤＳＭ６
６０１（セロタイプＯ６：Ｋ５：Ｈ１）を用いて、Hygieneinstitut Hamburg（P
rof.Bockemuehl）で製造した。
６０１（セロタイプＯ６：Ｋ５：Ｈ１）を用いて、Hygieneinstitut Hamburg（P
rof.Bockemuehl）で製造した。
【００２６】
２. ポリクローナル抗-Ｅ．コリ Ｒ１-抗血清（ウサギ、内部名称：Ｋ２９
９/ｄ５８）を、Ｒ１−コアを有するラフ形-突然変異株を用いる免疫化により得
た（抗-Ｒ１）。
９/ｄ５８）を、Ｒ１−コアを有するラフ形-突然変異株を用いる免疫化により得
た（抗-Ｒ１）。
【００２７】
３. 最小構造より大きい（＞Ｒｄ）全てのＥ．コリ コアオリゴ糖に対して
広く交叉反応するモノクローナル抗体（ＷＮ１-２２２-５、内部名称：Ｆ１６７
）を使用した。
広く交叉反応するモノクローナル抗体（ＷＮ１-２２２-５、内部名称：Ｆ１６７
）を使用した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
ａ：個々の成分のモル割合（括弧内）は、Ｏ-鎖中のＧａｌＮＡｃ及びＧｌｃ
ＮＡｃの存在に基づき、ミリスチン酸の値（１４：０）に対して標準化させた（
１.０モル１４：０/ＬＰＳモル）、 ｂ：ＧｌｃＮを、アミノ酸分析器を用いて測定。値は、ＧｌｃＮとＧｌｃＮ-
６Ｐの合計の結果である、 ｃ：ＨｅｘＮをモルガン-エルソン法で光度測定 ｎ.ｂ.：非測定 。
ＮＡｃの存在に基づき、ミリスチン酸の値（１４：０）に対して標準化させた（
１.０モル１４：０/ＬＰＳモル）、 ｂ：ＧｌｃＮを、アミノ酸分析器を用いて測定。値は、ＧｌｃＮとＧｌｃＮ-
６Ｐの合計の結果である、 ｃ：ＨｅｘＮをモルガン-エルソン法で光度測定 ｎ.ｂ.：非測定 。
【００３０】
記載の方法で得られるＬＰＳ-プレパラートを、比較-ＬＰＳと一緒にポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた（図１参照）。ＬＰＳのＳＤＳ-ＰＡＧＥ-分析
の表示のために、１６％ポリアクリルアミドゲルを用いて操作した（U. K., Lae
mmli, Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteri
ophage T4, Nature, 227, 680-685 (1970)) 。ＬＰＳ-バンドを敏感なアルカリ
銀着色法を用いて着色させた（C.M.Tsai and Frasch, C. F., A sensitiv silve
r stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels, Anal.
Biochem., 119, 1982, 115-119) 。
リルアミドゲル電気泳動にかけた（図１参照）。ＬＰＳのＳＤＳ-ＰＡＧＥ-分析
の表示のために、１６％ポリアクリルアミドゲルを用いて操作した（U. K., Lae
mmli, Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteri
ophage T4, Nature, 227, 680-685 (1970)) 。ＬＰＳ-バンドを敏感なアルカリ
銀着色法を用いて着色させた（C.M.Tsai and Frasch, C. F., A sensitiv silve
r stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels, Anal.
Biochem., 119, 1982, 115-119) 。
【００３１】
この調査の結果が図１に記載されている。
【００３２】
例３
生物学的活性
ａ）ＩＬ-１-活性
培養上澄み中でのＭＮＣ-増殖検定を用いて、ＩＬ-１-活性を測定する。ヒト単
球（ＭＮＣ）を自由意志献血者の末梢血液から単離し（ＭＮＣ８×１０５/２０
０ｍｌ）、これをガラス中に移し、同時に試験物質を加える。この試験管内での
生物学的活性試験のために、細胞を先ず、ＬＰＳで刺激する（１０ｎｇ/ｍｌ）
。８時間のインキュベーシヨン時間の後に、培養上澄みの１５０ｍｌでサイトカ
イン放出について調査した。ＩＬ-１-活性は、培養上澄み中の繊維芽細胞-増殖
検定を用いて測定される。このために必要である繊維芽細胞をヒト包皮から取得
した。この繊維芽細胞の増殖は、ＩＬ-１により上昇された。培養上澄みの用量
作用曲線とプロビット分析での標準の曲線との比較により、培養上澄み中の生物
学的活性が測定される。公知の内毒素活性細菌菌株（サルモネラ フリーデナウ
：Salmonella friedenau) からのＬＰＳが参照（正の対照）として使用され、従
って、図５中に共に提示されている。
球（ＭＮＣ）を自由意志献血者の末梢血液から単離し（ＭＮＣ８×１０５/２０
０ｍｌ）、これをガラス中に移し、同時に試験物質を加える。この試験管内での
生物学的活性試験のために、細胞を先ず、ＬＰＳで刺激する（１０ｎｇ/ｍｌ）
。８時間のインキュベーシヨン時間の後に、培養上澄みの１５０ｍｌでサイトカ
イン放出について調査した。ＩＬ-１-活性は、培養上澄み中の繊維芽細胞-増殖
検定を用いて測定される。このために必要である繊維芽細胞をヒト包皮から取得
した。この繊維芽細胞の増殖は、ＩＬ-１により上昇された。培養上澄みの用量
作用曲線とプロビット分析での標準の曲線との比較により、培養上澄み中の生物
学的活性が測定される。公知の内毒素活性細菌菌株（サルモネラ フリーデナウ
：Salmonella friedenau) からのＬＰＳが参照（正の対照）として使用され、従
って、図５中に共に提示されている。
【００３３】
ｂ）ＴＮＦα−活性
培養上澄み中のＴＮＦα−活性を、ＴＮＦ-敏感なセルラインＬ９２９を用い
る細胞毒性検定で測定する。培養上澄みの用量作用曲線とプロビット分析での標
準の曲線との比較は、ＴＮＦ-活性の測定を可能にする。ここでも、サルモネラ
フリーデナウからの公知の内毒素活性ＬＰＳを正対照として使用する。結果は
図６に図示されている。
る細胞毒性検定で測定する。培養上澄みの用量作用曲線とプロビット分析での標
準の曲線との比較は、ＴＮＦ-活性の測定を可能にする。ここでも、サルモネラ
フリーデナウからの公知の内毒素活性ＬＰＳを正対照として使用する。結果は
図６に図示されている。
【００３４】
この結果は、ＩＬ-１-及びＴＮＦα−放出に関して、標準及び正対照として使
用されたサルモネラ フリーデナウからのＬＰＳと菌株ＤＳＭ６６０１からのＬ
ＰＳとの間に著しい差異が確認できないことを示している（図５及び図６の下部
の図参照）。このことは、菌株ＤＳＭ６６０１のリポイドＡが、高度に精製され
たＥ．コリのリポイドＡと殆ど合同の活性である（図５及び図６の上部の図）こ
とによっても確認される。
用されたサルモネラ フリーデナウからのＬＰＳと菌株ＤＳＭ６６０１からのＬ
ＰＳとの間に著しい差異が確認できないことを示している（図５及び図６の下部
の図参照）。このことは、菌株ＤＳＭ６６０１のリポイドＡが、高度に精製され
たＥ．コリのリポイドＡと殆ど合同の活性である（図５及び図６の上部の図）こ
とによっても確認される。
【図１】
エセリキア コリ ＤＳＭ６６０１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【図２】
Ｅ．コリ Ｏ６のＯ-抗原の構造
【図３】
エセリキア コリのヘキサアシルリポイドＡの構造
【図４】
Ｅ．コリ Ｒ１のコアオリゴ糖中の主フラクシヨンの炭化水素-基本骨格の構
造
造
【図５】
Ｅ．コリのリポイドＡ及びＥ．コリ ＤＳＭ６６０１からのリポイドＡ又はＳ
．フリーデナウ及びＥ．コリＤＳＭ６６０１からのＬＰＳにより誘発されるヒト
単球からの用量依存性ＩＬ-１放出を示す図表
．フリーデナウ及びＥ．コリＤＳＭ６６０１からのＬＰＳにより誘発されるヒト
単球からの用量依存性ＩＬ-１放出を示す図表
【図６】
Ｅ．コリのリポイドＡ及びＥ．コリ ＤＳＭ６６０１からのリポイドＡ又はＳ
．フリーデナウ及びＥ．コリＤＳＭ６６０１からのＬＰＳにより誘発されるヒト
単球からの用量依存性ＴＮＦα−放出を示す図表
．フリーデナウ及びＥ．コリＤＳＭ６６０１からのＬＰＳにより誘発されるヒト
単球からの用量依存性ＴＮＦα−放出を示す図表
【図７】
Ｅ．コリ ＤＳＭ６６０１の完全なリポ多糖（ＬＰＳ）の構造
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ
，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，
ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ
Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ
，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，
ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ
Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ
，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ユルゲン マリンカ
ドイツ連邦共和国 ゼルム パウルスヴィ
ーゼ 11
(72)発明者 ユルゲン シュルツェ
ドイツ連邦共和国 ベルクホルツ−レーブ
リュッケ アリス−ブロッホ−シュトラー
セ ７
(72)発明者 ウルリヒ ゾネンボーン
ドイツ連邦共和国 ボッフム アイヒェン
ヴェーク ６
(72)発明者 ウルリヒ ツェーリンガー
ドイツ連邦共和国 アーレンスブルク テ
オドア−シュトルム−シュトラーセ 34ア
ー
(72)発明者 アルトゥア ウルマー
ドイツ連邦共和国 ニーンヴォールト ド
ルフシュトラーセ 10ベー
(72)発明者 エルンスト テオドア リーチェル
ドイツ連邦共和国 ハンブルク アルスタ
ーブリック 14
Ｆターム(参考） 4B064 AF21 CA02 CA21 CB01 CE08
DA01
4C086 AA01 AA03 EA24 MA01 MA04
ZB26
4C090 AA04 BA76 BC24 BD41 CA43
DA23
Claims (6)
- 【請求項１】 図７に記載の構造を有するリポ多糖（ＬＰＳ）。
- 【請求項２】 ＬＰＳ１分子当たりホスフェート基８個を含有する、請求項
１に記載のＬＰＳ。 - 【請求項３】 ＬＰＳ１分子当たりＰ-Ｅtn０.５モルを含有する、請求項１
又は２に記載のＬＰＳ。 - 【請求項４】 洗浄され、かつ乾燥されたＥ．コリ細菌物質を、公知方法で
フェノール/水-抽出し、こうして得られた抽出物を、ＲＮアーゼ/ＤＮアーゼ及
びプロテイナーゼＫで処理することを特徴とする、請求項１から３までのいずれ
か１項に記載のＬＰＳを取得する方法。 - 【請求項５】 Ｅ．コリ菌株 ＤＳＭ６６０１を使用する、請求項４に記載
の方法。 - 【請求項６】 微生物学、生物工学、分析、診断及び／又は医療目的のため
の、請求項１から３までのいずれかに記載のＥ．コリ菌株 ＤＳＭ６６０１から
のリポ多糖の使用。
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|---|---|
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