EA005217B1 - Липополисахарид бактерий e. coli штамма dsm 6601 и способ его получения - Google Patents
Липополисахарид бактерий e. coli штамма dsm 6601 и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- EA005217B1 EA005217B1 EA200200997A EA200200997A EA005217B1 EA 005217 B1 EA005217 B1 EA 005217B1 EA 200200997 A EA200200997 A EA 200200997A EA 200200997 A EA200200997 A EA 200200997A EA 005217 B1 EA005217 B1 EA 005217B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- oligosaccharide
- nucleus
- strain
- lipoid
- coli strain
- Prior art date
Links
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims abstract description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 26
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 4
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 claims description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims 2
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 claims 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims 1
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 claims 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 alditol acetates Chemical class 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- XLEYFDVVXLMULC-UHFFFAOYSA-N 2',4',6'-trihydroxyacetophenone Chemical compound CC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O XLEYFDVVXLMULC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- VOBNSQKMDIOJTQ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethyl phosphono hydrogen phosphate Chemical compound NCCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O VOBNSQKMDIOJTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VUEOQWDVOXEFDJ-UHFFFAOYSA-N 2-pyridin-2-ylacetic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)CC1=CC=CC=N1 VUEOQWDVOXEFDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение касается липополисахарида (LPS) из Е. coli DSM 6601. Этот LPS отличается от известных LPS из Е. coli, в частности, фосфорилированным остатком сахара ядра и степенью полимеризации О-цепи. Липоид А соответствует структурно и биологически обычному для E.coli типу. Описанный LPS подходит не только для идентификации несущих его коли-штаммов, но и придает им также пониженную патогенность при сохранении своего иммуномодулирующего влияния.
Description
Изобретение касается новых липополисахаридов из Е.сой.
Под эндотоксинами понимают бактериальные структурные компоненты, которые, в отличие от экзотоксинов, не выделяются живыми бактериями, но главным образом освобождаются после аутолиза. В случае так называемых классических эндотоксинов речь идет о термостабильных липополисахаридах (далее ЬР8) из наружных клеточных мембран грамотрицательных бактерий. ЬР8 состоят из так называемого липоида А, олигосахарида ядра, а также специфической О-цепи, причем липоид А отвечает за токсичное действие ЬР8.
Эндотоксины стимулируют в макроорганизме продукцию медиаторов иммунной ситемы, например интерлейкина 1, (1Ь-1) и фактора некроза опухоли (ΤΝΕα).
В отношении состава эндотоксинов бактерий кишечной группы и, в частности, Е.соН. уже проведен ряд исследований, причем было установлено, что 8/В-мутанты, как правило, содержат только повторения, то есть повторяющееся звено О-цепи (ср. фиг. 1). Исходят из того, что в этих случаях ген, который кодирует фермент полимеризации О-цепи, является дефектным и поэтому будет передавать только повторяющееся звено на олигосахарид ядра. ЬР8структуры подобного типа, но отличной структуры часто находятся также в патогенных для человека микроорганизмах, например №188епа, У|Ьпо, Сарту1оЬас1ет, НейсоЬас1ег и т.д. Эти микроорганизмы имеют ЬР8, которые дают им возможность лишать хозяина иммунной защиты путем особой молекулярной мимикрии и т.п., благодаря наличию сиалиновых кислот и содержащих сиалиновые кислоты олигосахаридов, подобных гликопротеинам и гликолипидам млекопитающих. Для Е.сой Ό8Μ 6601 был установлен О6-Серотип. Эта структура исследована и опубликована Р.ЕЛапккоп е! а1., СатЬойубт. Век. 131 (1984) 277-283. Структура соответствует формуле, представленной на фиг.
2.
Различные исследовательские группы изучали липоид А колибактерий. При этом было установлено, что структура липоида А, как правило, существует в гексаацильной форме и совпадает для всех серотипов из Е.сой (фиг. 3). Структура гексаацильной связи была опубликована в 1984 г. Τΐι. В1е!ксйе1 е! а1., 81гпс1пге аиб сопПгтайоп оГ !йе йр1б А сотропеп! оГ йроро1укассйайбек; НапбЬоок оГ Епбо!охшк (Ргос!ог, В., еб.), Уо1.1, СйетГйу оГ Епбо!охш (Е. Τ11. В1е!ксйе1, еб.), Е1кеу1ег, Атк!егбат (1984), рр. 187-220 и соответствует изображению на фиг. 3.
Специфическая О-цепь и липоид А связаны друг с другом через олигосахарид ядра. До настоящего времени известны пять различных олигосахаридов ядра у Е.сой. Здесь также производится ссылка на О.Но1к! е! а1., Сйетюа1 к!гис!ше оГ !йе соге геДоп оГ йроро1укассйапбе, в: Вас!епа1 Епбо!ох1с Ь1роро1укассйапбек, Уо1.1, Моткоп Ό.8. апб Вуап, ЬЬ (ебк.), Воса Ва!оп, РЬ, И8А (1992) рр. 135-170 (ср. фиг. 4).
При исследованиях ЬР8 из штамма Ό8Μ 6601 Е.сой было обнаружено, что липоид А в структуре гексаацильной формы также соответствует липоиду А, описанному для Е. сой.
Исследования в отношении высвобождения 1Ь-1 и ΤΝΕα в моноцитах человека подтверждают, что липоид А обладает такой же активностью и поэтому соответствует с высокой вероятностью известной структуре липоида А Е.сой (ср. фиг. 5, 6). Это предположение подтверждалось химическими анализами.
В структуре специфического О-антигена Ό8Μ 6601 Е. сой поражает тот факт, что очевидно в цепи регулярно существует только единственное „повторяющееся звено (ср. фиг. 1). Отсюда можно заключить, что речь идет о 8/В-мутанте у штамма Ό8Μ 6601, что является чрезвычайно необычным для человеческого изолята. Однако, как показывают серологические анализы, структура этого повторяющегося звена соответствует основному образцу О-цепи Е.сой О6.
Область ядра у штамма Ό8Μ 6601 соответствует известной В1-структуре. Структурные особенности состоят в том, что аналитически было установлено 8 фосфатных остатков на молекулу ЬР8, причем, как правило, на липоид А выпадают только 2 фосфатных остатка. В дальнейшем было обнаружено нестехиометрическое содержание пирофосфоэтаноламина.
Таким образом, обобщение позволяет установить, что ЬР8 штамма Ό8Μ 6601 значительно отличается от до сих пор известного ЬР8 из Е.сой, в частности, в фосфорилированной сахаридной части ядра и по степени полимеризации О-цепи. Липоид А структурно и биологически соответствует обычному для Е.сой типу, что подчеркивает роль этого вещества в биологической активности. Описанный ЬР8 предназначен не только для идентификации несущего его колиштамма, но и придает ему также пониженную патогенность при сохранении иммуномодулирующего действия. Тот факт, что О-цепь имеет β-гликозидную связь вместо αгликозидной, впервые стало возможным однозначно увидеть на примере 8/В-мутанта Ό8Μ 6601 для Е.сой.
В случае липополисахарида (ЬР8) из Е. сой Ό8Μ 6601 речь идет о новой гладкошероховатой (8/В)-структуре, которая, с одной стороны, состоит из до сих пор известных частей структур (О-специфическая цепь, олигосахарид ядра и липоид А), с другой стороны, впервые и полностью структурно охарактеризована в представленной здесь комплексной форме (ср. фиг. 7). О-специфическая цепь, состоящая только из единственного повторения (по вторяющееся звено) серотипа О6, имеет βгликозидную связь с олигосахаридом ядра и, таким образом, иначе связана в пределах О-цепи (α-гликозидно). Олигосахарид ядра включает К1-структуру, химическое состояние которой подтверждается серологическими исследованиями с К1-специфическими антителами. Компонент липоида А обладает характерной определенной для липоида А Е. сой химической конституцией.
ЬР8 из штамма Ό8Μ 6601 Е.соН обладает удивительной гомогенностью. Гетерогенность может быть установлена только в отношении заместителей фосфатов (РР и Р-Е1и νδ. Р и Р), что впервые описывается в этой форме. Посредством комплексных ΝΜΚ-анализов можно четко определить Р-Е1и-заместитель в олигосахариде ядра К1-олигосахарида ядра в позиции 2 второй гептозы (Нер).
Окончательная структура ЬР8 штамма Ό8Μ 6601 представлена на фиг. 7.
В дальнейшем изобретение более подробно поясняется с помощью примеров:
Пример 1. Получение ЬР8
ЬР8 получали из промытой и высушенной бактериальной массы после модифицированной экстракции фенол/вода; как указано О.Аез1рйа1 е! а1., Вас(ег1а1 ЫророРъассйапбех. Ехбасйои \νίΐ1ι Рйепо1-Аа!ет аиб Еибйет Аррйсабопз о£ 1йе Ртосебите, Ме111. СагЬойубг. Сйет., Уо1. V (1965) рр.83-91.
г лиофилизированных бактерий, которые перед этим дважды промывали дистиллированной водой, экстрагировали по Аез1рйа1 и 1апи в соответствии с модифицированной инструкцией. Модификация состояла в дополнительной ферментативной обработке (ДНКазой, РНКазой, протеиназой К) водного экстракта, которая служит для удаления случайных чужеродных белков и ДНК/РНК-составных частей. Далее к водной фазе (около 1,2 л) при комнатной температуре примешивали 20 мг ДНКазы (рибонуклеаза А, бычья поджелудочная железа, 81дта) и 20 мг ДНКазы (ДНКаза I, бычья поджелудочная железа, степень II, 8фта), смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 ч. Далее добавляли 20 мг протеиназы К (Ттйпасйшт а1Ьит, Воейппдег, Мапп11еш1), затем перемешивали 12 ч. Полученную суспензию трижды подвергали диализизу через 15 л дистиллированной воды при 4°С в течение 24 ч и затем лиофилизировали. Ферментсодержащий экстракт промывали в дистиллированной воде до тех пор, пока не была достигнута окончательная концентрация около 50 мг/мл. Суспензию три раза центрифугировали с ультразвуком в холоде (155.000 х г, 4°С, 4 ч). Осадок (ЬР8) помещали в 150 мл дистиллированной воды и еще один раз подвергали диализу через воду в течение трёх дней и после этого лиофилизировали (выход ЬР8: 1,45 г, 3.1% м/м).
Пример 2. Анализ ЬР8 из штамма Ό8Μ 6601 Е.соН.
Гексозамин (НехХ) (обозначаемый здесь как глюкозамин + галактозамин, О1сХ+ОаЬХ) определяли по модифицированному тесту Моргана-Эльсона (8!готшдег, ЕЬ, Рагк,
ЕТ.Тйотрзоп. К.Е. 1. Вю1. Сйет. 234, 3263-3268 (в 1959)), и кроме того также посредством НРЬ8 (Р1СО-ТАС, АаГетз). В противоположность тесту Моргана-Эльсона при этом методе анализа можно не только определить количественно и по-отдельности ΟΚΝ и ОаШ, но также можно параллельно установить еще и наличие С1сХ фосфата, 2-этаноламина (Е!п) и 2-этаноламинфосфата (Е!п-Р), которые часто встречаются в ЬР8. Газожидкостную хроматографию (ОС) проводили на νηπηη 3700 ОС или Не\\1е11 Раскагб (НР 5890 серия II) газовом хроматографе на капиллярной колонке (заполненной диоксидом кремния 8РВ-5®, 30 м, 8ире1со). Комбинированную газожидкостную хроматографию/массспектрометрию (СС-Μδ) проводили в массспектрометре (НР модель 5989), который оснащен НР-1 капиллярной колонкой (30 м, Не\\1еО Раскагб). ОС- и соответственно СС-Μδ анализы применяли для определения нейтрального сахара (О1с, Оа1, Нер, Μаη) в качестве их алдитолацетатов (8а^атбекет, 1.8., 81опеткет, ЕНДеапез,
А. Апа1. Сйет. 37, 1602-1604 (в 1967)), а также для качественного и количественного определения жирных кислот в качестве производных сложных эфиров жирных кислот и метилового эфира после сильного метанолиза (2М НО^еОН, 120°С, 16 ч) (Аойеп^еЬет, Н.-А. апб К1е!зсйе1, Е.Тй., Апа1уз1з о£ 11роро1узассйапбе (йр1б А) £айу ас1бз, 1. Μ^с^оЬ^о1. Μеίй. 11, (1990) 195-211) и экстракции с хлороформом. Оба ОС-метода анализа начинали при 150°С (изотерма для 3 мин) и посредством линейного температурного градиента повышали от 5°С/мин до 320°С. Фосфат определяли по Ьо^ту е! а1. (Ьо^ту, О.Н., КоЬетб, Ν.Κ., Ьешег, Κ.Υ., Аи, Μ.ΚΕ. Еатг, А.Ь, 1. Вю1. Сйет. 207, 1-17 (1954)) и 2-кето-3-дезокси-О-маннооктулозоновую кислоту (Кбо) посредством теста тиобарбитуровой кислоты (Аа^аνбека^, МС. & 8аз1ате,
1..1)., 1. Вю1. Сйет. 234, 1945-1950 (1959)).
Получение и очистка свободного липоида А и олигосахарида ядра
ЬР8 (258,8 мг) суспендировали в 25 мл 0,1 М №ОАс/НОАс (рН 4.4) и подвергали мягкому кислотному гидролизу при 100°С в течение 1 ч. Затем экстрагировали три раза липофильную часть (липоид А) из гидролизата с 25 мл хлороформа (выход 23,2 мг). Далее липоид А из органической фазы очищали с помощью препаративной слоевой хроматографии (Р8С) (2 мм Р8С силикагеля 60 пластин, ЕМетск, Оаатз1аб!), хроматографировали с хлороформом-метанолом-водой 100:75:15 (объем/объем/объем) и вы деляли погружением в дистилированную воду. Таким образом получали 6 фракций, из которых основная фракция (К|=0.4) представляла собой очищенный дифосфорилированный гексаациллипоид А (ОРНБА-Ес66О|). Очищенный ИРНЬАЕс6601 (выход 2,06 мг) растворяли в хлороформметаноле 8:2 (объем/объем) и обрабатывали перед ΜΆΤΌΙ-ΤΘΕ-Μ8 с ионообменником (АтЬег1йе ΙΚΆ 120, Н+-форма). Аликвоту (250 г) очищенного ПРНЬА-Ес6601 использовали для биологических экспериментов.
Водную фазу экстракции хлороформа лиофилизировали (выход: 272 мг) и далее очищали олигосахарид с помощью ΤδΚ-колонки [3,5 х 90 см, Τ8Κ Н^-40(8), Е.Мегск] в пиридине - уксусной кислоте - воде 8:20:2000 (объем/объем/объем). Отдельные фракции олигосахаридов (пул А, В, С и И) анализировали с помощью ОС-М8 и ΝΜΒ-спектроскопии. Далее очищали основные фракции (пул А, #28-41; 49,05 мг), которые содержали как составные части сахара О-цепи (Мап, ОаШас), так и такие же части олигосахарида ядра (Нер, Кбо). Другие фракции содержали моносахариды, не исследованные ближе артефакты Ибо (ангидро- и лактон) и, наконец, соль. В основной фракции Τ8Κразделения все составные части олигосахарида ядра (Ибо, Оа1, Нер) и О-цепи (Мап, ОаШАс) были обнаружены не только при ОС-М8анализе, но и при NΜΒ-анализе. Поэтому обработку продолжали далее.
Кроме того, в первую очередь проверяли, подходит ли для очистки олигосахарида до гомогенности аналитическая анионно-обменная хроматография при высоком давлении НРАЕС (й1дй ргеккиге ашоп ехсйапде сйгота!одгарйу). Для этого применяли специфическую НРЬСметодику для анализа комплексных структур сахара (ΌΙΟΝΕΧ-система) с аналитической СагЬоРас РА1 колонкой; (4,6 мм х 250 мм) и линейными градиентами соли (5 мин при 0, затем при 50 мин на 0,52 №ОАс) при скорости тока 1 мл/мин. Элюат определяли с помощью пульсамперометрического детектора (РАО) на восстановительном эквиваленте (молекула сахара). Таким образом получали четыре олигосахаридные фракции, которые далее очищали с помощью семипрепаративной НРАЕС аналогичным способом.
Семипрепаративную НРАЕС осуществляли с помощью СагЬоРас РА1 колонки [(9 мм х 250 мм) Эюпех система] с такими же градиентами соли, как при аналитической НРАЕС (5 мин при 0, затем 50 мин на 0,5М №1ОАс) и скорости тока 4 мл/мин. Нанесение олигосахарида (42 мг; пул А из ΤδΚ-колонки) при семипрепаративной НРАЕС осуществляли в двух аналогичных НРАЕС-направлениях. Элюат собирали в фракции каждую минуту, и их по отдельности исследовали с помощью аналитической НРАЕС. Таким образом, с помощью семипрепаративной НРАЕС получали две основных фракции (фрак ция I, время удержания 1К ~ 12 мин и фракция II, 1К ~ 15 мин). Обе НРАЕС-фракции должны были обессоливать перед МАТП1-ТОЕ-М8 и NΜΒанализом с помощью Ο-10-колонки (2,5 х 120 см) (выход: фракция I 4,68 мг; фракция II 4,39 мг).
Усиленная матрицей лазерная десорбция/ионизация времяпролетной (МАЬПЕТОЕ) масс-спектрометрии
Усиленную матрицей лазерную десорбцию/ионизацию времяпролетной (МАЬПЕТОЕ) масс-спектрометрии проводили в Вгикег-Ке11ехп времяпролетном спектрометре (Вгикег-Егапхеп Апа1убк, Вгетеп), а также в линейной конфигурации и в отрицательном режиме при ускоряющем напряжении 20 кВ и запаздывающей экстракции ионов. Пробы вначале растворяли в хлороформе (липоид А) или дистиллированной воде (олигосахаридные фракции) в концентрации 10 мкг/мкл, и 2 мкл их аликвоты растворяли в 2 мкл раствора матрицы, состоящего из 0,5 м 2,4,6-тригидроксиацетофенона (А1бпсй. 81ешйепп) в метаноле. Аликвоты (0,5 мкл) этой смеси наносили на металлический держатель и высушивали феном.
NΜΚ.-спектроскопия
Одномерный (1Ό) 1Н и 31РЖМК- и двухмерный (2Ό) NΜΒ-спектры получали на Вгикег Ауапсе ΌΚΧ-600 спектрометре (Вгикег, Кйеш81ебеп) и 13С NΜΒ-спектры на Вгикег АМХ-360спектрометре при 300 К в 2Н2О. Перед каждым измерением пробы дважды лиофилизировали с дейтеризированной водой (2Н2О). В качестве внешнего контрольного сигнала использовали ацетон (8Н 2,225 частей на миллион, 8С 31,45 частей на миллион) или 85% Н3РО4 (δρ 0 частей на миллион). Для получения NΜК-данных использовали стандартное программное обеспечение Вгикег (X\VINNΜК. 1.3). Продолжительность перемешивания для ТОС8У (1о(а1 согге1а1еб кресйоксору - общей коррелированной спектроскопии) и соответственно ΝΟΕ8Υ (Νυс1еаг Оуегйаикег епйапсетеШ кресйоксору ядерной супер-увеличенной спектроскопии) составляла 100 и соответственно 500 мс.
Серологические анализы
Серологические анализы проводили как вестерн-блоттинг анализы, которые разрабатывали с тремя различными антителами.
1. Поликлональную анти-О6-антисыворотку (кролик) получали от штамма Э8М 6601 Е. сой (серотип О6:К5:Н1) в Институте гигиены в Гамбурге (профессор Бокемюль).
2. Поликлональную анти-Е.сой К1антисыворотку (кролик, внутреннее обозначение: Κ299/658) получали иммунизацией с мутантами шероховатой формы, один из которых имел КГ-ядро (анти-КГ).
3. Использовали моноклональное антитело (^N1-222-5, внутреннее обозначение Е 167), которое широко перекрестно реагирует против всех олигосахаридов ядра Е. сой с минимальной структурой (>Кб).
Таблица. Анализ компонентов, экстрагированных из Е. со11 ЬР8 из штамма ΌδΜ 6601
Компонент
Углеводы б1с1Мь
Са1Ы Нех№ КРо Мал 6а1 61с ЦО-Нер Полярные группы Р
ЕМ-Р головные
Количество компонента нмоль/мг (моль/1_Р8)а 1. Анализ
283 (1.8)
139 (0.9)
591 (3.8)
248 (1.6)
321 (2.1)
474 (3.0) 1069 (6.9)
566 (3.6)
2. Анализ п.Ь.
п.Ь.
589 (2.9)
242 (1.2)
383 (1.9)
557 (2.8)
1291 (6.4)
442 (2.2)
Жирные кислоты
12:0
14:0 14:0(3-ОН) 16:0
1188 (7.6) (0.5)
1146 (5.7) П.Ь.
130 (0.8)
156 (1.0)
460 (3.0) следы
162 (0.8)
201 (1.0)
504 (2.5) следы
Молярное соотношение отдельных компонентов (в скобках) было стандартным благодаря наличию СаШАс и С1сИАс в О-цепи, при значении миристиновой кислоты (14:0) (1.0 моль 14:0/моль ЬР8).
Ь С1сИ определено с помощью анализатора аминокислоты. Значение получено из суммы С1с\ и СИс\-6Р.
с ΝοχΝ определено по Могдап-Екоп
п.Ь. не определено.
Полученные согласно описанному способу ЬР8-препараты подвергали электрофорезу на полиакриаламидном геле (РАСЕ) вместе со сравниваемыми ЬР8 (ср. фиг. 1). Для получения δΌδ-РАСЕ-анализа ЬР8 обрабатывали 16% полиакриламидным гелем (И.К., Баеттб, С1еауаде ой 51гис1ига1 рго!еш8 биппд аккетЫу ой йеаб ой ЬаЛейорйаде Т4, №1Шге. 227, 680-685 (1970)). ЬР8-полосы окрашивали с помощью чувствительного щелочного метода серебрения ( С.М. Т§а1 апб Ргаксй, С.Е., А 5еп51йуе кйуег йаш йог бе!есйпд 11роро1у8ассйапбе8 ш ро1уасгу1ат1бе де18, Апа1. Вюсйет., 119, 1982, 115-119).
Результат исследований представлен на фиг. 1.
Пример 3. Биологическая активность
а) 1Ь-1-активность
1Ь-1-активность определяли с помощью анализа ΜNС-пролиферации в надосадочной жидкости культуры. Моноциты человека (ΜΝ0) изолировали из периферической крови добровольных доноров (8 х 105 МЫС/200 мл) и их переводили на стекло и одновременно перемещали с тестовым веществом. Для тестирования биологической активности ш уйго клетки вначале стимулировали с ЬР8 (10 нг/мл). После периода инкубации продолжительностью 8 ч исследовали 150 мл надосадочной жидкости культуры на высвобождение цитокинов. ТС-1благодаря ЙБ-1. Сравнением кривой действия дозы надосадочной жидкости культуры с кривой стандарта в пробит-анализе определяли биологическую активность в надосадочной жидкости культуры. ЬР8 из известных эндотоксически активных штаммов бактерий (8а1топе11а йгебепаи) служит как ссылка (положительный контроль) и поэтому представлен на фиг. 5.
Ь) ΤΝΕα-активность
ΤΝΕα-активность в надосадочной жидкости культуры определяли анализом цитотоксичности с помощью ΤΝΕ-чувствительной клеточной линии Ь929. Сравнение кривой действия дозы надосадочной жидкости культуры с кривой стандарта в пробит-анализе позволяет определить ΤΝΕ-активность. Также здесь в качестве положительного контроля служит известный эндотоксически активный ЬР8 из 8а1топе11а йгебепаи. Результаты представлены графически на фиг. 6.
Результаты показывают, что в отношении ЙБ-1- и ΤΝΕα-выделения нет никаких значительных различий между ЬР8 из 8а1топе11а йлебепаи, который служит в качестве стандарта и положительного контроля, и ЬР8, обнаруженном в штамме ΌδΜ 6601 (фиг. 5 и 6 изображения внизу). Это подтверждается также тем, что липоид А штамма ΌδΜ 6601 имеет почти одинаковую активность по покрытию как и высоко очищенный липоидом А из Е. сой (фиг. 5 и 6, изображения сверху).
Claims (3)
1 ЬР8 препарат 1 (фенол/вода-экстракт ϋΜ 11,82)
1 2 3 4 5 6 7
Фиг. 1. 8Б8-РА0Е ЕзсНспсЫа со11 Б8М 6601
1. Липополисахарид бактерий Е.сой штамма ΌδΜ 6601, содержащий 8 фосфатных остатков и 0,5 моль Р-Е1п в расчете на молекулу, имеющий структуру, представленную на фиг. 7.
2 ЬР8 препарат 2
3 ЬР8 препарат 3
4 свободно
5 Е. со11 О111 ЬР8
6 Рзеиботопаз аегидтоза тип Фишера 2 ЬР8
7 8а1топе11а ттпезоШ К60 ЬР8
Стрелки указывают на ЬР8 полосы олигосахарида ядра и «повторяющееся звено» (К/8-мутант, полоса А) и соответственно на ЬР8 со сложным олигосахаридом ядра (полоса В).
2. Способ получения липополисахарида по п.1, заключающийся в том, что промытую и высушенную бактериальную массу Е.сой штамма ΌδΜ 6601 подвергают экстракции смесью фенол/вода и полученный экстракт обрабатывают РНКазой, ДНКазой и протеиназой К.
3. Применение липополисахарида бактерий Е.сой штамма ΌδΜ 6601 по п.1, в частности полученного в соответствии с п.2, для модулирования иммунной системы человека и животных, изменения биологической активности других микроорганизмов, получения иммуномодулирующих лекарственных средств для человека и животных, а также в качестве маркера или эталонного вещества для микробиологической или медицинской диагностики ш уйго, в качестве иммуностимулятора для вакцинации человека и животных, в качестве основного материала для биотехнологического синтеза и изготовления иммуномодулирующих веществ.
активность определяли с помощью анализа пролиферации фибробластов в надосадочной жидкости культуры. Необходимые для этого фибробласты получали из крайней плоти человека.
Пролиферация этих фибробластов повышалась
16 % разделительный гель
—>3)-й-Мап-( I —>4)-В-Мап-С1—>3}-α·άΐοΝΑε-(1 —>4)-а-<Эа1ЫАс-(1 —>
Г β-СНс
Фиг. 2. Структура О-антигена Е. со11 О6 цитировано из: 1апззоп, Р.Е., ЬтбЪегд, В., Ьоппдгеп, 1., Ог1еда. С, 8уепзоп, 8.В. (1984) СагЪойубг. Кез., 131, 277-283.
Все сахара находятся в Б-пиранозной форме.
В противоположность опубликованной 1апззоп е1 а1. структуре О-цепи Е.со11 06 первое «повторяющееся звено» 8/К-мутанта Е.со11 Б8М 6601 связано ргликозидически и впервые определено в настоящей заявке на патент, вместе с местом замещения на расположенной в стороне глюкозе (01с111) олигосахарида ядра (см. фиг. 4).
Фиг. 3. Структура гексаацильного липоида А Езсйег1сЫа со11 ('/.аНппдег. и., Ьтбпег, В., апб Е. ТЕ. К1е1зсНе1. Мо1еси1аг з1гнс1нге о! 1ίρίά А, 111е епбо1о\1с сеп1ег о! Ъас!епа1 11роро1узассйапбез, Α6ν. СагЪойубг. СЕет. ВюсЕет., 50 (1994)211-276)
Цифры в кружках обозначают число атомов углерода настоящей жирной кислоты. Свободная гидроксигруппа О1сЫ (II) представляет место связывания для Кбо (I) олигосахарида ядра.
рр
II а<^Ч1-^)-а-Оа141_>2>а-<Э1с,-(1_»3>а431с'Ч1->3>1^(-1>НСр1-(1->.3)-Ьх1-Г».Нгр1Ч1^5)-а-К11о,-(2^6) _> Σίροίά А Т |* 1 I2
О-КеПе—> 3>₽-О1с“ Ых-О-Нер β.ΚΛ,
Фиг. 4. Структура основного каркаса углевода главной фракции в олигосахариде ядра Е.со11 К1:
цитировано из: V^ηод^абоν, Е.У., νап бег Бг1й, К., Тйотаз-Оа1ез, ЕЕ., МезЬЕот, 8., Вгабе, Н.-, апб О. Но1з1 (1999) Еиг. 1. Вюсйет., 261, 629-639.
Все сахара представлены в Б-пиранозной форме. Ь,Б-Нер, Ь-глицеро-Б-манно-гептоза; Кбо Бманно-окт-2-улозоновая кислота, Р, фосфат.
Замещение О-цепи на расположенной в стороне глюкозе (01с111), вместе с ее аномерией, впервые определено и изображено в настоящей заявке на выдачу патента
Фиг. 5. Зависимость от дозы высвобождения 1Ь1 из моноцитов человека, индуцируемое с помощью: 1. липода А Езсйепсй1а сой (слева вверху) или липоидом А из штамма Б8М 6601 Е.со11 (справа вверху) и 2. ЬР8 из 8.!пебепаи (слева внизу) и Езс11епс1на со11 штамм Б8М 6601 (справа внизу).
Фиг. 6. Зависимость от дозы высвобождения ΤΝΕα из моноцитов человека, индуцируемое с помощью: 1. липоида А Езс11епс1на со11 (слева вверху) или липоида А из штамма Б8М 6601 Е.со11 (справа вверху); и 2.
ЬР8 из 8.!пебепаи (слева внизу) и ЕзсйепсЫа сой штамм Б8М 6601 (справа внизу).
Фиг. 7. Структура сложного липополисахарида (ЬР8) из Е. со11 Б8М 6601.
В олигосахариде ядра фосфатные заместители Ри Е1п в обеих гептозах Нер1 и Нер11 не являются стехиметрическими и поэтому обозначены закрашенными линиями.
Позиция и аномерное связывание КОо1 с липоидом А происходит по аналогии с другими БРЗ-структурами Е. со11, таким же образом, как позиция и аномерное связывание КОо.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10013539A DE10013539B4 (de) | 2000-03-20 | 2000-03-20 | Lipopolysaccharide aus Escherichia coli, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendungen |
| PCT/EP2001/003153 WO2001070756A2 (de) | 2000-03-20 | 2001-03-20 | Lipopolysaccharide aus escherichia coli |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200200997A1 EA200200997A1 (ru) | 2003-04-24 |
| EA005217B1 true EA005217B1 (ru) | 2004-12-30 |
Family
ID=7635468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200200997A EA005217B1 (ru) | 2000-03-20 | 2001-03-20 | Липополисахарид бактерий e. coli штамма dsm 6601 и способ его получения |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6833451B2 (ru) |
| EP (1) | EP1266023A2 (ru) |
| JP (1) | JP2003528175A (ru) |
| KR (1) | KR20030047878A (ru) |
| CN (1) | CN1436245A (ru) |
| AP (1) | AP2002002622A0 (ru) |
| AU (2) | AU2001273899B2 (ru) |
| BG (1) | BG107115A (ru) |
| BR (1) | BR0109392A (ru) |
| CA (1) | CA2402544A1 (ru) |
| CZ (1) | CZ20023469A3 (ru) |
| DE (1) | DE10013539B4 (ru) |
| EA (1) | EA005217B1 (ru) |
| EE (1) | EE200200537A (ru) |
| HK (1) | HK1053148A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20020682A2 (ru) |
| HU (1) | HUP0204540A3 (ru) |
| IL (1) | IL151785A0 (ru) |
| IS (1) | IS6517A (ru) |
| MX (1) | MXPA02009215A (ru) |
| NO (1) | NO20024480L (ru) |
| NZ (1) | NZ520968A (ru) |
| PL (1) | PL368447A1 (ru) |
| SK (1) | SK13492002A3 (ru) |
| UA (1) | UA75068C2 (ru) |
| WO (1) | WO2001070756A2 (ru) |
| YU (1) | YU71202A (ru) |
| ZA (1) | ZA200207408B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10017727B2 (en) | 2005-11-28 | 2018-07-10 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and culture, fermented plant extract, fermented plant extract composition, method for producing lipopolysaccharide and lipopolysaccharide |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030031684A1 (en) * | 2001-03-30 | 2003-02-13 | Corixa Corporation | Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA) |
| DE10328669B4 (de) * | 2003-06-26 | 2005-12-01 | Pharma-Zentrale Gmbh | Plasmidfreier Klon des E. coli Stammes DSM 6601 |
| US20050238651A1 (en) * | 2003-11-25 | 2005-10-27 | Gurtner Gregory J | Treatment of inflammatory bowel disease |
| US20050191276A1 (en) * | 2003-11-25 | 2005-09-01 | Gregory Gurtner | Treatment of inflammatory bowel disease through induction of indoleamine 2.3-dioxygenase |
| WO2006025995A2 (en) * | 2004-07-27 | 2006-03-09 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods using md-2 mutants and chimeric proteins |
| CN100354428C (zh) * | 2005-01-13 | 2007-12-12 | 丁友玲 | 隧道式干热灭菌设备测试用内毒素指示剂的制备方法 |
| US9664677B2 (en) | 2010-04-19 | 2017-05-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymer-nanostructure composition for selective molecular recognition |
| US20130066064A1 (en) * | 2010-05-20 | 2013-03-14 | Glaxosmithkline Biologicals S.A, | Novel process |
| CN105137073A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-12-09 | 中国兽医药品监察所 | 牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条 |
| PL432842A1 (pl) * | 2020-02-10 | 2021-08-16 | Uniwersytet Warszawski | LPS do zastosowania w indukowaniu u osobnika tolerancji na alergeny pokarmowe wywołujące alergie pokarmowe zależne od IgE |
| CA3171408A1 (en) * | 2020-03-13 | 2021-09-16 | Martine Caroff | Detoxified lipopolysaccharides (lps), naturally non-toxic lps, and uses thereof |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19844191A1 (de) * | 1998-09-28 | 2000-03-30 | Pharma Zentrale Gmbh | Lipopolysaccharide aus Escherichia coli |
-
2000
- 2000-03-20 DE DE10013539A patent/DE10013539B4/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-20 BR BR0109392-4A patent/BR0109392A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-03-20 EP EP01940260A patent/EP1266023A2/de not_active Withdrawn
- 2001-03-20 UA UA2002108256A patent/UA75068C2/uk unknown
- 2001-03-20 HU HU0204540A patent/HUP0204540A3/hu unknown
- 2001-03-20 IL IL15178501A patent/IL151785A0/xx unknown
- 2001-03-20 JP JP2001568957A patent/JP2003528175A/ja active Pending
- 2001-03-20 EE EEP200200537A patent/EE200200537A/xx unknown
- 2001-03-20 AU AU2001273899A patent/AU2001273899B2/en not_active Ceased
- 2001-03-20 AU AU7389901A patent/AU7389901A/xx active Pending
- 2001-03-20 SK SK1349-2002A patent/SK13492002A3/sk unknown
- 2001-03-20 MX MXPA02009215A patent/MXPA02009215A/es unknown
- 2001-03-20 CA CA002402544A patent/CA2402544A1/en not_active Abandoned
- 2001-03-20 PL PL01368447A patent/PL368447A1/xx unknown
- 2001-03-20 EA EA200200997A patent/EA005217B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-03-20 KR KR1020027012241A patent/KR20030047878A/ko active IP Right Grant
- 2001-03-20 CZ CZ20023469A patent/CZ20023469A3/cs unknown
- 2001-03-20 CN CN01806916A patent/CN1436245A/zh active Pending
- 2001-03-20 US US10/239,254 patent/US6833451B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-03-20 AP APAP/P/2002/002622A patent/AP2002002622A0/en unknown
- 2001-03-20 YU YU71202A patent/YU71202A/sh unknown
- 2001-03-20 WO PCT/EP2001/003153 patent/WO2001070756A2/de not_active Application Discontinuation
- 2001-03-20 NZ NZ520968A patent/NZ520968A/en unknown
-
2002
- 2002-08-20 HR HRP20020682 patent/HRP20020682A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2002-08-21 IS IS6517A patent/IS6517A/is unknown
- 2002-09-16 ZA ZA200207408A patent/ZA200207408B/xx unknown
- 2002-09-18 BG BG107115A patent/BG107115A/bg unknown
- 2002-09-19 NO NO20024480A patent/NO20024480L/no not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-06-18 HK HK03104380.7A patent/HK1053148A1/zh unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10017727B2 (en) | 2005-11-28 | 2018-07-10 | Gen-Ichiro Soma | Method for fermentation and culture, fermented plant extract, fermented plant extract composition, method for producing lipopolysaccharide and lipopolysaccharide |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1181691A (en) | Vaccinal complex containing a specific antigen and vaccine containing it | |
| FI110164B (fi) | Menetelmä oligosakkaridin valmistamiseksi depolymeroimalla antigeeninen polysakkaridi | |
| Wilson et al. | Role of competition for nutrients in suppression of Clostridium difficile by the colonic microflora | |
| Gottschalk | The chemistry and biology of sialic acids and related substances | |
| Rietschel et al. | Chemical structure and biologic activity of bacterial and synthetic lipid A | |
| US5952313A (en) | LPS antagonists and methods of making and using the same | |
| EP0319253A3 (en) | Sialic acid glycosides, antigens, immunoadsorbents, and methods for their preparation | |
| EA005217B1 (ru) | Липополисахарид бактерий e. coli штамма dsm 6601 и способ его получения | |
| CN101896197B (zh) | 来自艰难梭菌的新型多糖免疫原 | |
| JP4043533B2 (ja) | 低分子量リポポリサッカライド | |
| CA2265696C (en) | Method for purifying gbs toxin/cm101 | |
| JPH08245702A (ja) | 高分子量リポポリサッカライド | |
| Stevens et al. | Biological and chemical characterization of endotoxin from Capnocytophaga sputigena | |
| Wang et al. | Cell envelope of an iron-oxidizing bacterium: studies of lipopolysaccharide and peptidoglycan | |
| CN107184972B (zh) | 一种结核杆菌OS-tb寡糖缀合物及其制备方法与应用 | |
| Bock et al. | Interaction of viruses, bacteria and bacterial toxins with host cell surface glycolipids. Aspects on receptor identification and dissection of binding epitopes | |
| RU2260053C2 (ru) | Способ выделения биологически активной фракции (баф), содержащей s-липополисахариды (s-лпс) из грамотрицательных бактерий, баф для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями, производящими эндотоксичные s-лпс, фармацевтическая композиция, способы индукции протективного иммунитета и улучшения состояния пациента при состояниях, требующих повышения иммунного статуса | |
| Acosta et al. | Chemical nature of the interaction between macrophage fusion factor and macrophage membranes | |
| RU2068270C1 (ru) | Антиген менингококков группы в | |
| Diamantstein et al. | Effect of N 6‐(Δ2‐isopentenyl)‐adenosine on thymus and spleen in relation to antibody formation in mice | |
| Varbanets et al. | Characterization of the lipipolysaccharides of Pseudomonas chlororaphis | |
| Hasløv et al. | Immunosuppressive effects induced by the polysaccharide moiety of some bacterial lipopolysaccharides | |
| Overend | Maurice Stacey, CBE 8 April 1907—9 October 1994: Elected FRS 1950 | |
| Beynon | Structural studies of Escherichia coli K26 and K46-50 using chemical and microbiological methods | |
| GB2088399A (en) | Lipopolysaccharide Containing Compounds as Immunotherapeutic Agent for Tumors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |