CN109323907A - 一种骨软骨组织快速脱钙试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨软骨组织快速脱钙试剂盒及其制备方法。所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒包括甲溶液、乙溶液和浓盐酸；甲溶液、乙溶液和浓盐酸的体积比为1:1:(0.1—0.3)；每4mL所述甲溶液的配制方法是：将0.8—1.2g柠檬酸钠加入4mL生理盐水中，充分溶解后即得；每4mL乙溶液的配制方法是：取体积百分比浓度为4％的多聚甲醛2.5—3.5mL，然后加入0.5—1.5mL甲酸，使总体积为4mL，即得。本发明所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒配制简便、脱钙时间短、脱钙充分且不损伤组织，可广泛应用于临床和科研中骨软骨组织脱钙。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨软骨组织快速脱钙试剂盒及其制备方法。
背景技术
骨组织是由细胞、基质和纤维构成的一种质地坚硬的结缔组织，骨组织中沉积的无机盐以羟基磷灰石形式存在，其主要成分为磷酸钙和碳酸钙。在临床、教学和科研中，对骨组织直接进行切片较为困难。若要观察骨及软骨组织中软骨结构、骨胶原纤维、细胞等情况，则必须对骨组织进行脱钙处理，除去组织中的钙质，同时又要保护骨组织和软骨组织的正常形态、多糖及骨细胞结构，达到“组织保真”目的。因此脱钙是骨软骨组织切片中极为常用的技术，也是至关重要的环节，脱钙方法恰当与否将直接影响骨与软骨组织结构完整性、细胞抗原活性和组织染色效果。
脱钙技术广泛应用于骨关节炎、风湿性关节炎等多种疾病的临床和基础科学研究。以小鼠膝关节为例，正确的脱钙处理后，进一步对其进行梯度脱水、透明、石蜡包埋、切片，进而可进行后续苏木素-伊红(HE)染色、番红固绿染色及免疫组化、免疫荧光等多种实验检测，以对分析膝关节组织结构、细胞形态、胞外基质蛋白、软骨细胞抗原表达等情况。因此，脱钙技术是一系列科学研究的先决条件和关键步骤。
然而目前临床及基础科研中常用的脱钙液均存在明显缺陷和不足；如普遍使用的乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液虽然基本不对骨软骨组织结构造成损害，但存在脱钙速度十分缓慢(以10％EDTA为例，使小鼠膝关节完全脱钙至少需要4周，大鼠至少需要8周)、脱钙过程中需要多次更换脱钙液、脱钙后组织会变硬等缺点；而硝酸类的脱钙液虽然脱钙速度较快(以10％硝酸溶液为例，大、小鼠膝关节完全脱钙需12-24小时)，但该类脱钙液对组织结构及细胞抗原结构损害较大，且存在脱钙后细胞核不能着色等缺点；另外含甲酸、铬酸及醋酸类的脱钙液也普遍存在脱钙时间长、不易判断脱钙终点、及易使组织脱钙过度等缺陷。
综上所述，骨软骨组织不能高效率、高质量脱钙是临床及科研中亟待解决的难题。传统脱钙液普遍存在脱钙时间和脱钙效果两方面不可兼得的弊端，严重限制了临床和科研检测的进程，影响了实验检测结果的真实性。因此如何突破目前骨组织及软骨组织脱钙技术的困境，同时探索更为合适的脱钙方法是非常迫切的科学问题。
发明内容
本发明旨在针对现有传统脱钙液的脱钙时间过长及对组织损伤较大等缺陷，提供一种新型骨软骨组织快速脱钙试剂盒及其制备方法，该新型脱钙试剂盒脱钙快速，且具有保证骨软骨组织正常结构、细胞形态、细胞抗原活性及组织染色等优良特点，适用于各种骨组织和软骨组织的相关实验。
为实现本发明的技术目的，本发明提供的技术方案为：
所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒包括甲溶液、乙溶液和浓盐酸；甲溶液、乙溶液和浓盐酸的体积比为1:1:(0.1—0.3)，优选为1:1:0.2；每4mL所述甲溶液的配制方法是：将0.8—1.2g，优选为1g柠檬酸钠加入4mL生理盐水中，充分溶解后即得；每4mL乙溶液的配制方法是：取体积百分比浓度为4％的多聚甲醛2.5—3.5mL，优选为3mL，然后加入0.5—1.5mL，优选为1mL甲酸，使总体积为4mL，即得。
上述骨软骨组织快速脱钙试剂盒的制备方法包括如下步骤：
(1)配制甲溶液：每4mL所述甲溶液的配制方法是将0.8—1.2g，优选为1g柠檬酸钠加入4mL生理盐水中，充分溶解后即得；
(2)配制乙溶液：每4mL乙溶液的配制方法是取体积百分比浓度为4％的多聚甲醛2.5—3.5mL，优选为3mL，然后加入0.5—1.5mL，优选为1mL甲酸，使总体积为4mL，即得；
(3)将甲溶液与乙溶液混合后，加入浓盐酸，混匀，即得骨软骨组织快速脱钙液；所述甲溶液、乙溶液和浓盐酸的体积比为1:1:(0.1—0.3)，优选为1:1:0.2。
下面对本发明作进一步说明：
本发明所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒中，柠檬酸钠具有良好的pH调节及缓冲性能，其他配伍成分与柠檬酸钠可组成良好的pH缓冲剂，维持脱钙液pH值于相对稳定范围，且柠檬酸钠对钙离子、镁离子等金属离子具有良好的络合能力；
加用甲醛，使得脱钙液兼有组织固定作用，甲醛穿透能力较强，固定均匀，保护及避免骨组织和骨髓组织受脱钙液的破坏和侵蚀，甲醛固定后的骨细胞核染色较为清晰，能弥补配伍中酸类组分引起的核着色不良的缺陷；
甲酸虽脱钙缓慢，但对组织损害较少，能使骨组织和骨髓组织膨胀、脂质溶解，促进配伍中脱钙液渗入骨组织和骨髓组织，有利于钙盐析出，进一步加快整体脱钙速度；
盐酸除可加快整体脱钙速度，还能使组织略收缩，限制甲酸对组织的膨胀作用，且浓度合适的盐酸能最大限度维持骨组织和骨髓组织的结构完整及组织中细胞抗原免疫活性。
以小鼠膝关节实验为例，利用本发明所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒对小鼠膝关节组织进行脱钙，完全脱钙的时间为6-7小时，以此时间标准，无脱钙过度情况出现；针刺脱钙关节组织，无阻力感则认为脱钙完成，随后将脱钙后的组织置于流水中冲洗，以终止脱钙液的作用。
与现有技术相比，本发明所述的骨软骨组织快速脱钙试剂盒可在极短时间内(6-7小时)使小鼠膝关节软骨完全脱钙。脱钙过程中无需更换脱钙液，无需置于摇床摇荡，也无需置于37℃或4℃等特定环境，室温放置即可。脱钙后组织经冲水，常规梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片后，可进行多种实验操作。该新型脱钙试剂盒在不破坏骨组织和软骨组织结构、细胞免疫抗原活性及组织染色的同时，大大缩短了制片时间，并保证了切片质量，彻底解决了常规脱钙液脱钙时间和脱钙效果不可兼得的缺陷。新型脱钙液配制简便、经济，实用性强，是一种广泛适用于临床和科研中骨软骨组织脱钙的有力工具。
总之，本发明通过几种不同组分及组分浓度的合适配伍，配制成新型骨软骨组织快速脱钙试剂盒，解决了传统脱钙液脱钙时间长、脱钙效果差及后续部分实验染色失败等常见问题。本发明所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒配制简便、脱钙时间短、效果明显，可广泛应用于临床和基础科研中骨软骨组织脱钙。
附图说明
图1为新型脱钙试剂盒与传统EDTA脱钙液脱钙的小鼠膝关节软骨HE染色对比图，a为新型脱钙液脱钙的关节软骨HE染色代表图，b为传统EDTA脱钙液脱钙的关节软骨HE染色代表图；
图2为新型脱钙试剂盒与传统EDTA脱钙液脱钙的小鼠膝关节软骨番红固绿染色对比图，a为新型脱钙液脱钙的关节软骨番红固绿染色代表图，b为传统EDTA脱钙液脱钙的关节软骨番红固绿染色代表图；
图3为新型脱钙试剂盒与传统EDTA脱钙液脱钙的小鼠膝关节软骨免疫组化(检测Aggrecan，即蛋白聚糖的表达)对比图，a为新型脱钙液脱钙的关节软骨Aggrecan表达情况，b为传统EDTA脱钙的关节软骨Aggrecan表达情况；
图4为新型脱钙试剂盒与传统EDTA脱钙液脱钙的小鼠膝关节软骨免疫组化(检测MMP-13，即基质金属蛋白酶-13的表达)对比图，a为新型脱钙液脱钙的关节软骨MMP-13表达情况，b为传统EDTA脱钙的关节软骨MMP-13表达情况。
具体实施方式
实施例1
所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒包括甲溶液、乙溶液和浓盐酸；甲溶液、乙溶液和浓盐酸的体积比为1:1:(0.1—0.3)，优选为1:1:0.2；每4mL所述甲溶液的配制方法是：将0.8—1.2g，优选为1g柠檬酸钠加入4mL生理盐水中，充分溶解后即得；每4mL乙溶液的配制方法是：取体积百分比浓度为4％的多聚甲醛2.5—3.5mL，优选为3mL，然后加入0.5—1.5mL，优选为1mL甲酸，使总体积为4mL，即得。
上述骨软骨组织快速脱钙试剂盒的制备方法包括如下步骤：
(1)配制甲溶液：每4mL所述甲溶液的配制方法是将0.8—1.2g，优选为1g柠檬酸钠加入4mL生理盐水中，充分溶解后即得；
(2)配制乙溶液：每4mL乙溶液的配制方法是取体积百分比浓度为4％的多聚甲醛2.5—3.5mL，优选为3mL，然后加入0.5—1.5mL，优选为1mL甲酸，使总体积为4mL，即得；
(3)将甲溶液与乙溶液混合后，加入浓盐酸，混匀，即得骨软骨组织快速脱钙液；所述甲溶液、乙溶液和浓盐酸的体积比为1:1:(0.1—0.3)，优选为1:1:0.2。
实施例2实验
(1)取小鼠膝关节，小心剔去周围附着组织，置于适量4％多聚甲醛中固定24h(股骨、胫骨呈90-120°角)；
(2)将固定后的关节组织置于流水中冲洗10分钟，PBS浸泡10分钟，洗去固定液后，用吸水纸吸去膝关节组织周围多余液体；
(3)将膝关节组织置于实施例1所述脱钙液中；
(4)膝关节组织置于新配制好的新型脱钙液中6小时后，每半小时针刺股骨或胫骨，直至针刺无阻力感则为脱钙完全(小鼠膝关节组织约6-7小时脱钙完全)；
(5)将脱钙后的膝关节组织置于流水中，洗去脱钙液；
(6)将冲水后的膝关节组织依次置于30％、50％、70％、80％、95％Ⅰ、95％Ⅱ、100％Ⅰ、100％Ⅱ酒精中进行梯度脱水，每道酒精2小时；依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中进行组织透明，每道二甲苯30分钟；依次置于石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ中进行组织浸蜡，每道石蜡1小时；
(7)将浸蜡后的膝关节组织石蜡包埋、切片。根据实验需求，对脱蜡后的切片进行HE染色、番红固绿染色、免疫组化等实验操作；
(8)以附图1为例，经过新型脱钙试剂盒处理的关节组织石蜡切片后进行HE染色，结果显示切片完整，各组织层次排列规律，色泽鲜明，细胞内部细微结构清晰，细胞核着色明显，骨纤维形态结构保留，软骨细胞排列有序，形态完整；
(9)以附图2为例，经过新型脱钙试剂盒处理的关节组织石蜡切片后进行番红固绿染色，结果显示切片中软骨表面胶原纤维层、软骨下骨皮质和骨小梁均呈绿色，软骨基质大部分着红色，颜色鲜艳，软骨与软骨下骨界限明显，潮线清晰；
(10)以附图3,4为例，对经新型脱钙试剂盒处理的关节组织石蜡切片后进行免疫组织化学染色，结果显示与常规EDTA脱钙相比，新型脱钙液处理的关节组织中Aggrecan(蛋白聚糖)及MMP-13(基质金属蛋白酶-13)的表达相当，且染色均匀，背景色较浅，细胞核呈蓝色，阳性细胞呈深浅不一的棕色，细胞核、质分界明显。
对比实例
采用传统EDTA脱钙液对小鼠膝关节组织进行脱钙处理，其余步骤同以上实施例。通过对比分析，经新型脱钙试剂盒脱钙的小鼠膝关节软骨组织HE染色、番红固绿染色与经EDTA脱钙液脱钙的组织相比无差异；免疫组化实验结果显示二者保留软骨组织正常细胞免疫抗原活性，均有相当的MMP-13和Aggrecan的阳性细胞数量(图3、4)，证实新型脱钙液并未影响细胞抗原活性。另一方面，新型脱钙试剂盒较传统EDTA脱钙液能在极短时间内完成相同组织的脱钙过程，大大缩减了实验操作等待时间，并避免传统EDTA脱钙液定期更换脱钙液以维持脱钙能力的缺陷。
Claims (7)
1.一种骨软骨组织快速脱钙试剂盒，其特征在于，所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒包括甲溶液、乙溶液和浓盐酸；甲溶液、乙溶液和浓盐酸的体积比为1:1:(0.1—0.3)；每4mL所述甲溶液的配制方法是：将0.8—1.2g柠檬酸钠加入4mL生理盐水中，充分溶解后即得；每4mL乙溶液的配制方法是：取体积百分比浓度为4％的多聚甲醛2.5—3.5mL，然后加入0.5—1.5mL甲酸，使总体积为4mL，即得。
2.如权利要求1所述的骨软骨组织快速脱钙试剂盒，其特征在于，所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒中甲溶液、乙溶液和浓盐酸的体积比为1:1:0.2。
3.如权利要求1所述的骨软骨组织快速脱钙试剂盒，其特征在于，每4mL所述甲溶液的配制方法是：将1g柠檬酸钠加入4mL生理盐水中，充分溶解后即得；每4mL乙溶液的配制方法是：取体积百分比浓度为4％的多聚甲醛3mL，然后加入1mL甲酸，即得。
4.如权利要求1至3任一项所述骨软骨组织快速脱钙试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)配制甲溶液：每4mL所述甲溶液的配制方法是将0.8—1.2g柠檬酸钠加入4mL生理盐水中，充分溶解后即得；
(2)配制乙溶液：每4mL乙溶液的配制方法是取体积百分比浓度为4％的多聚甲醛2.5—3.5mL，然后加入0.5—1.5mL甲酸，使总体积为4mL，即得。
(3)将甲溶液与乙溶液混合后，加入浓盐酸，混匀，即得骨软骨组织快速脱钙液；所述甲溶液、乙溶液和浓盐酸的体积比为1:1:(0.1—0.3)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，每4mL所述甲溶液的配制方法是：将1g柠檬酸钠加入4mL生理盐水中，充分溶解后即得。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，每4mL乙溶液的配制方法是：取体积百分比浓度为4％的多聚甲醛3mL，然后加入1mL甲酸，即得。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述甲溶液、乙溶液和浓盐酸的体积比为1:1:0.2。
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