JP2007124978A - 哺乳動物の胚または卵子の凍結保存方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 哺乳動物胚の凍結方法は、静磁場及び交流電磁場の両者を作用させた環境下で哺乳動物の胚または卵子を凍結することを含む。
【効果】 従来法では凍結保存に不向きであった体内由来低ランク胚や体外受精胚、性判別操作及びクローン操作などの体外における物理的ダメージを受けた胚であっても、凍結・融解後の受胎率を大幅に向上することができる。また、本発明によれば、凍結・融解による細胞のDNA損傷を軽減できるため、未受精卵子を凍結保存する際に本発明を適用することにより、凍結・融解後の卵子の品質を高めることができ、該卵子を受精させ、得られた受精卵又は胚を着床させる場合の受胎率が向上する。
【選択図】 なし
Description
CASアルコールバス式緩慢凍結プログラムフリーザー
アルコールバスのサイズは縦25 cm、横35 cm、深さ20 cmとし、その周囲に0.5〜15mT(5〜150G)の静磁場と0.05〜0.5mT(0.5〜5G)の電磁場空間を作り出す装置を配置した。交流電磁場は、アルコールバスの周囲にコイル線をめぐらせ、交流電流を流すことにより形成される構造になっている。出力装置は静磁場のみの空間と静磁場と電磁場が組み合わされた空間を作り出すことが可能であり、周波数(6〜30Hz)を変化させることによりさまざまな強さで目的の物質に曝磁させることができる。また、凍結作業時の冷却速度もコントロールすることもできる。
牛胎子繊維芽細胞は妊娠49日齢の黒毛和種胎子から樹立された。回収された細胞は10% 牛胎子血清(以下FBS,Filtron,Australia)を含むダルベッコの修飾イーグル培地 (以下D-MEM,Gibco BRL,USA)培地中で数回継代培養し、0.25%トリプシン(Gibco BRL,USA)処理により細胞を回収した後セルバンカー(Nippon Zenyaku Kyoto Co. Ltd., Kooriyama, Japan)に浮遊させ、-80℃のディープフリーザー内で凍結保存した。凍結保存された細胞は10cmプラスチックシャーレ(Falcon,USA)に播種し、1度継代して再び対数増殖期に増殖した状態で実験に用いた。
0.25%トリプシン処理により剥離回収した牛胎子繊維芽細胞を牛胚用緩慢凍結液(非特許文献1)に浮遊させ、0.25mlプラスチックストロー(Straw 1/4 cc, Specialty products Inc., TX)に2 x 106個/mlの濃度で封入した。CAS-F区および対照区(磁場なし)の緩慢凍結プログラムフリーザー(以下Control-F,EYELA,東京理化社製)の凍結プログラムは次のように設定した。それぞれの-5℃に維持したメタノールバス中にストローを投入し、細いピンセットで植氷した後、そのまま15分間維持した。その後、-32.5℃まで-0.5〜-0.6℃/分のスピードで温度を下降させ、すみやかに液体窒素中に保管した。CAS-F区のストローはメタノールバス中に投入してから液体窒素中に保管する直前まで常時、静磁場のみあるいは静磁場+電磁場空間で曝磁させた。その際の静磁場の強さは約20G、交流電磁場の強さは約2Gであった。また、交流電磁場の周波数は6Hzであった。
凍結・融解後の牛胎子繊維芽細胞のDNA損傷評価はComet assayを用いて行った。25〜30℃の温湯中で融解した牛胎子繊維芽細胞は洗浄後、1x105個/mlになるように濃度を調整し、Comet LMAgarose (1%低温融解アガロース; Trevigen, MD)と1:10の割合で混合した。直ちにCometSlide (Trevigen)上に75μlの細胞懸濁液をのせサンプルエリアを完全に覆うようにピペットの先端で広げた。スライドは4℃・暗所で10分間放置した後、10% DMSO(v/v)を含むLysis Solution (Trevigen)に浸し4℃で30〜60分間静置した。さらにアルカリ性溶液(pH > 13)に浸し、室温・暗所に20分間放置した。電気泳動(1 Volt/cm,300mM,60分間)は500mM EDTAを含むアルカリ性溶液中で行った。電気泳動終了後、70%エタノールに5分間浸し、風乾後SYBR Green (Trevigen)染色を行い、蛍光顕微鏡で無作為に選抜したComet状の細胞の写真を撮った。Comet状細胞はCASP software(非特許文献6)を用いて全長を計算し、パラメーター化されたComet頭部先端から尾部末端の値を比較した。
統計処理はStudent's t検定とを用いて行った。
CAS-Fで凍結された体細胞の融解後のDNA損傷度は,静磁場のみおよび静磁場+電磁場区ともに、Control-Fより有意に小さかった(静磁場181+/-28,静磁場+電磁場173+/-20およびControl-F 203+/-45,P<0.01)。また、静磁場+電磁場区のDNA損傷度は静磁場のみ曝磁させた区より有意に小さかった(P<0.05,図1)。これらのことから、静磁場のみ、さらには静磁場+交流電磁場への曝磁は体細胞に何らかの影響を与え対照区と比較して凍害を軽減することが示された。
供胚牛への過剰排卵処置は発情徴候確認後、黄体期である発情周期の中期からFollicle Stimulating Hormone(FSH,アントリンR-10,川崎製薬、Japan)を3日あるいは4日間漸減的に投与し、Prostaglandin(PGF2α,プロナルゴンF、ファルマシア・アップジョン、Japan)投与により発情誘起を行った。人工授精はスタンディング発情を確認した日の夕方に行い、胚回収は発情確認から7日目に行った。実験には、国際受精卵移植学会(International Embryo Transfer Society,IETS)が定めるランク1の胚を供した。
回収・選抜された胚を0.1Mシュクロース添加修飾リン酸緩衝液(PBS)中に入れ、シャーレ(Corning,USA)底面に付着させることにより保定した。金属刃(AB Technology,USA)を装着したマイクロマニピュレーター(AB Technology,USA)を用いて胚の5〜10細胞を透明帯ごと分離した。この5〜10個の分離細胞をサンプリングし、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification、栄研化学、Japan、非特許文献7)法による性判別を行った。バイオプシーを行った胚は、5% 子牛血清(CS,Invitrogen,USA)添加した発生培地中で培養し、性判別終了後直ちにCAS-F(静磁場+電磁場)あるいはControl-Fにより凍結した。耐凍剤は牛胚用緩慢凍結液(非特許文献1)を用い、参考例1と同様の冷却プログラムで凍結した。
数日間液体窒素中で凍結保存した性判別胚は、空気中で約10秒間保持した後、25〜30℃温湯中に投入することで融解を行った。ストローから5% FBS(Hyclone,USA)添加ダルベッコのリン酸緩衝液(以下D-PBS,Invitrogen,USA)中へ押し出された胚は、同液で数回洗浄した後、5% CS添加発生培地中で培養を行い、融解後24時間目の生存率を観察した。
融解後24時間目の胚のDNA断片化評価は、DNAの3‘OH末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT)を用いてビオチンで標識したdUTPをとりこませ、このビオチンを発色させるTUNEL法(TdT-mediated dUTP nick end labeling)を用いて行った。生存している胚を1mg/ml Polyvinyl Alcohol(以下PVA)を含むPBS(以下PVA-PBS)で洗浄し、4% パラホルムアルデヒドを含むPBS中で、その後0.1% Triton X-100溶液中でそれぞれ1時間ずつ固定した。PVA-PBS中で胚を洗浄後、TUNEL reaction medium(Roche,Swiss)中で1時間培養した。PVA-PBSで洗浄した胚は、50μg/ml RNase処置を1時間行い、0.5% Propidium Iodide染色後、蛍光顕微鏡でDNA断片化評価および総細胞数をカウントした。
受胚牛は、ホルスタイン種未経産牛の発情日を0日目とした7日目にCAS-FあるいはControl-Fで凍結保存された性判別胚を融解後直ちに黄体側の子宮角へダイレクト移植を行い、超音波妊娠診断装置(50S Tringa,Pie Medical,Netherlands)を用いて30日目の受胎率を観察した。
統計処理はStudent's t検定とχ2検定を用いて行った。
静磁場+電磁場空間において性判別胚を凍結し、融解後24時間目の生存率と細胞数を表1に示した。CAS-F,Control-F区の融解後24時間目の生存率はそれぞれ100%(20/20)、74%(20/27)でありCAS-F区が高い値を示した。また、細胞数もCAS-F区が130±22個とControl-F区(83±16個)と比較して有意に高い値を示した(P<0.01)。さらに凍結融解後のDNA断片化率についてもCAS-F区が有意に低い値を示した(CAS-F 7+/-2%、Control-F 24+/-10%、P<0.01)。CAS-Fで凍結した性判別胚の30日目における受胎率は、79%(15/19)とControl-F区(45%、9/20)と比較して高い傾向にあった(表2)。
Claims (8)
- 静磁場及び交流電磁場の両者を作用させた環境下で哺乳動物の胚または卵子を凍結することを含む、哺乳動物の胚または卵子の凍結方法。
- 前記交流電磁場の周波数が1Hz〜30Hzである請求項1記載の方法。
- 前記静磁場の強さが5G〜150Gである請求項1又は2記載の方法。
- 前記交流電磁場の強さが0.5G〜5Gである請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記凍結を、アルコールバス中で行なう請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記胚が受精卵若しくはクローン卵又はそれらが卵割して脱出胚盤胞期胚になるまでの間の胚である請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記胚または卵子がウシ由来である請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記胚が性判別胚である請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
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