CN110106245B

CN110106245B - 一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法

Info

Publication number: CN110106245B
Application number: CN201811462914.4A
Authority: CN
Inventors: 郑建波; 贾永义; 顾志敏; 程顺; 迟美丽; 刘士力; 蒋文枰
Original assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2038-12-03
Also published as: CN110106245A

Abstract

本发明提供一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法，属于原位杂交技术领域，包括，反义RNA探针制备和纯化：选择igf3基因来构建并合成RNA探针；翘嘴鲌性腺组织的冰冻切片制备；以及冰冻切片的mRNA原位杂交。本发明在翘嘴鲌中建立了冰冻切片mRNA原位杂交的方法来研究相关基因在性腺中的表达模式，能够清晰地描述翘嘴鲌性别相关基因在性腺中的表达定位，对于性别调控基因的鉴定具有重要的意义。

Description

一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法

技术领域

本发明属于原位杂交技术领域，具体涉及一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法。

背景技术

翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)俗称白鱼、白条，隶属鲤科、鲌亚科、鲌属，为中上层大型广温性淡水鱼类，是我国分布最广的经济鱼类之一。太湖流域的翘嘴红鲌品质优良，与银鱼、白虾并称“太湖三白”而名闻天下。近年来，随着翘嘴红鲌人工养殖、繁殖技术的成熟及推广，该鱼已经成为中国特别是长江三角洲地区的主要名特淡水养殖品种。翘嘴鲌雌雄个体的体型、生长速度存在较大差异，具有显著的性别异形特征，鉴定翘嘴鲌性别决定关键调控基因、阐明性别决定与分化的作用机制，进而发展翘嘴鲌性别控制育种技术，对于提高翘嘴鲌养殖产业的发展具有重要意义和应用价值。目前应用于翘嘴鲌性别相关基因分子生物学方面的技术与方法较少，原位杂交组织(或细胞)化学(In situHybridization Histochemistry，ISHH)简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法，广泛应用于实验室分析mRNA在生物组织内的分布和富集程度。因此建立适用于翘嘴鲌性腺组织的冰冻切片mRNA原位杂交技术，对性别决定相关基因进行组织定位和功能研究，有助于加快揭示与阐明翘嘴鲌性别决定与分化的分子作用机制，从而推动翘嘴鲌育种技术的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反义RNA探针的穿透性强，杂交信号好，能够清晰地描述翘嘴鲌性别相关基因在性腺中的表达定位的适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

本发明提供一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法，包括，

反义RNA探针制备和纯化：选择igf3基因来构建并合成RNA探针；

翘嘴鲌性腺组织的冰冻切片制备；以及

冰冻切片的mRNA原位杂交。igf3基因仅在翘嘴鲌卵巢和精巢中特异的表达，并始于性别决定分化早期，在性腺发育过程中持续高表达，在性别分化和性腺发育中的作用比其他igf基因更重要。

具体地，上述反义RNA探针制备用

正向引物为：5’-AGCAGAATTCATGCCATCAGACGGAATGCC-3’，

反向引物为：5’-GTTGCTCGAGTCGGATGTGGGAGATAAATGT-3’。

反义RNA探针制备和纯化包括如下步骤：

1)以逆转录得到的翘嘴鲌性腺组织cDNA为模板，利用所述引物通过PCR反应扩增得到igf3基因的部分ORF序列，回收目的片段；

2)片段与载体双酶切后进行纯化；

3)将酶切后的载体和目的片段于14～18℃水浴中连接，随后转化、测序，通过序列分析鉴定到正确的重组质粒；

4)以重组质粒酶切得到线性化的重组质粒为模板，转录带地高辛标记的反义RNA探针，纯化。

上述反义RNA探针序列如SEQ ID NO.3所示。

翘嘴鲌性腺组织的冰冻切片制备包括如下步骤：

1)固定、脱水：将剥离后的性腺组织固定，漂洗，随后在蔗糖溶液中脱水过夜；如果组织块较大，可适当延长固定时间，但不超过48h；

2)包埋、切片：将经步骤1)处理得到的组织放置于OCT包埋剂内，-20℃包埋，冷冻好后即可切片。

步骤2)中蔗糖溶液浓度为18～21％的蔗糖-1×DEPC-PBS溶液。为了保证脱水效果，务必将材料完全浸没于蔗糖溶液中。

优选的，切片的厚度为10-20μm。

冰冻切片的mRNA原位杂交包括如下步骤：

1)igf3mRNA探针杂交：将冰冻切片固定后用三乙醇胺溶液，然后用杂交缓冲液进行预杂交，再加入含探针的杂交液进行杂交；

2)探针洗脱及抗体孵育：将杂交后切片漂洗，然后移至含有anti-DIG-AP的BufferB2中孵育；

3)抗体洗脱与显色：将孵育后切片漂洗，然后滴加显色溶液，避光显色，待信号清晰明显时，用ddH₂O终止显色反应，封片，然后拍照；

优选的，100ml 0.1M三乙醇胺溶液配方为：10ml pH8.0、1M DEPC-TEA，90ml DEPC-ddH₂O，250μl乙酸酐；切片用多聚甲醛后固定，浸入乙酸酐和三乙醇胺中是为了增强反义RNA探针的穿透性，提高杂交信号。

优选的，Buffer B2配方为：900μl Buffer B1，100μl sheep serum。

igf3基因在精巢中表达，而在卵巢中不表达。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明在翘嘴鲌中建立了冰冻切片mRNA原位杂交的方法来研究相关基因在性腺中的表达模式，能够清晰地描述翘嘴鲌性别相关基因在性腺中的表达定位，对于性别调控基因的鉴定具有重要的意义。

本发明采用了上述技术方案提供一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1是本发明实施例1中翘嘴鲌igf3基因在精巢组织中的冰冻切片mRNA原位杂交分析的示意图；

图2是本发明实施例1中翘嘴鲌igf3基因在卵巢组织中的冰冻切片mRNA原位杂交分析的示意图。

具体实施方式

下面，结合具体实施例对本发明一实施方式的一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法作进一步说明。

实施例1：

一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法，包括，

1、反义RNA探针制备和纯化

1)引物设计：根据翘嘴鲌igf3基因编码区序列设计构建igf3探针载体的引物序列，正反向引物分别带有EcoRI和Xhol酶切位点，如下所示：

正向引物：5’-AGCAGAATTCATGCCATCAGACGGAATGCC-3’

反向引物：5’-GTTGCTCGAGTCGGATGTGGGAGATAAATGT-3’；

2)ORF扩增：以逆转录得到的翘嘴鲌性腺组织cDNA为模板，利用上述引物通过PCR反应扩增得到igf3基因的部分ORF序列，PCR方法为94℃4min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃1min，32cycle；72℃延伸7min，利用Axygen凝胶回收试剂盒纯化目的片段；

3)片段与载体双酶切：将目的片段和pBluescriptII SK载体用EcoRI和Xhol进行双酶切处理，反应体系如表1所示，加完试剂后混合充分，37℃水浴中消化4h，结束后进行纯化；

表1双酶切反应体系

组分	体积
		目的片段或载体	3μg
10×H Buffer	7μl
		EcoRI	3.5μl
Xhol	3.5μl
		ddH<sub>2</sub>O	补充至70μl

4)连接、转化及重组质粒鉴定：将酶切后的载体和目的片段于16℃水浴中连接，随后转化、测序，通过序列分析鉴定到正确的重组质粒；

5)重组质粒的线性化和转录：选择EcoRI或Xhol对质粒进行单酶切，37℃水浴酶切4h，得到线性化的重组质粒，并用Axygen的Cleanup试剂盒进行纯化。随后以此为模板，转录带地高辛标记的反义RNA探针，具体体系如表2所示，加完试剂后混合均匀，37℃水浴反应2.5h，紧接着加入2μl RNA酶free的DNaseI消化质粒模板，37℃孵育20min，之后加入2μl的0.2M EDTA，冰上静置待消化反应终止；

表2转录RNA探针反应体

6)反义探针纯化：消化结束后，使用Mini Quick Spin RNAColumns(Roche)对RNA探针进行纯化，并对纯化产物进行电泳和浓度检测，最后剩余样品加入等体积去离子甲酰胺，轻混分装后置于-80℃保存。

其中上述反义RNA探针序列如SEQ ID NO.3所示，即为：ATGCCATCAGACGGAATGCCAACCTGTCATGCCAGACACATTCAGATGCTTAGAGGATTCATGCTGAAGGTGCCCAGCTGGCGAAGTGTGTGCGTCCTCTACTCCCTGTACTGCGTCCTGATTCTGCCAGACGCTGGCGAAGCGGTCAAAGCGCGCTGTGGACGGGAACTAGTCGCTGACCTGGAGTTTGTGTGTGGAGACCGTGGCTTTTACAGAGGCAAACCTGGAGCAGCCCGTAGCGGCGGTCCTCGCTCTCGTGGGAAAGGGATCGTCGAGCAGTGTTGCGTACGGGGATGTGACCTCCAGCATTTGGAGTCGTATTGTGCCAAACCCAAGAGAGTGCGCCGTGACATCCCTGCATCTCTGCAGCAGACTGTGGAAGATCAGTTTTGGCTGGTGTTTCAGCAGCGATACCAGAAGCTTGCAGGGATGAAGAGAGGTGAGAAAGCCACATCTCATAGACTCAGAGAGCGGACGCTCTTCCGGTGGAACAGAGTTTCAGTATTACTAAACACCAACACACCCAACCGACCCCCTTCAACACACCAACATCCTGCCACTGAGAGAATGAGATCAAGACCAACATTTATCTCCCACATCCGATAG。

2、翘嘴鲌性腺组织的冰冻切片

1)取材、固定、脱水：使用手术剪对需要切片的组织进行剥离，并置于RNase-free2ml离心管中漂洗，4％PFA4℃固定过夜(如果组织块较大，可适当延长固定时间，但不超过48h)，固定结束后，用DEPC-PBS漂洗2遍，每次5min，随后在20％蔗糖溶液中4℃脱水过夜(20g蔗糖加入50ml 1×DEPC-PBS溶液中)，为了保证脱水效果，务必将材料完全浸没于蔗糖溶液中；

2)包埋、切片：事先打开冰冻切片机，将温度设定到-20℃，降温过程中折叠锡箔纸小盒，随后加入适量的OCT包埋剂，将材料放置于OCT包埋剂内，-20℃包埋，待冷冻好后可以直接切片或者置于-80℃保存，用OCT将材料固定到垫架上，先修片，后切片，一般设置切片的厚度为10-20μm，将切片尽量展开，用载玻片的毛面去贴片，在显微镜下观察目标区域并用标记笔勾勒出来，在毛面上写上探针类型、日期及编号，将切好的片子放于切片盒中，用塑料袋将切片盒包好置于-80℃保存或直接进行下面的原位杂交实验。

3、冰冻切片的mRNA原位杂交

第一天：igf3mRNA探针杂交

1)切完后，片子在室温中放置30min晾干，于50℃的烘箱中烘烤30min。实验中所有仪器和溶液均为RNase-free；

2)在玻璃缸中倒入4％PFA，室温固定20min；

3)1×DEPC-PBS润洗5min，立刻放入另一个1×DEPC-PBS②漂洗5min；

4)Proteinase K室温处理10min，100ml PK配方为：1ml 0.5M EDTA，5ml 1M Tris-HCl(pH7.4～7.5,DEPC-treated)，10ul 20mg/ml Proteinase K；

5)1×DEPC-PBS润洗，4％PFA再固定10min；

6)1×DEPC-PBS润洗下，再放入1×DEPC-PBS漂洗5min。

7)三乙醇胺(Triethanolamine)处理10min，由于TEA中的乙酸酐(Aceticanhydride)很难溶解，因此处理切片的时候需要用小转子搅拌混匀，其中100ml 0.1M TEA配方为：10ml 1M TEA(pH 8.0,DEPC-treated)，90ml DEPC-ddH₂O，250μl Aceticanhydride；

8)1×DEPC-PBS润洗下，再用1×DEPC-PBS漂洗5min；

9)每个材料用50μl杂交缓冲液进行孵育，放置于杂交盒中室温预杂交1h；

10)igf3探针在85℃下变性5min，立即置于冰上迅速冷却，小心地将杂交缓冲液从一端吸走，加入含探针的杂交液，终浓度为0.1～0.2ng/μl，杂交盒中65℃过夜，为了防止杂交液蒸干，把切片从切片架上取下，用无尘纸巾擦试标记外的全部区域将封口膜剪成标记区域大小，用镊子在膜两端压出凹槽，在膜上滴50-100μl杂交液，用切片的正面区贴膜，正置于湿盒的海绵上；

第二天：探针洗脱及抗体孵育

1)准备4个200ml 0.2×SSC和2个200ml Buffer B1，Buffer B1配方为：20ml 1MTris-HCl(pH7.4-7.5)，6ml 5M NaCl，174ml ddH₂O；

2)65℃金属浴预热0.2×SSC，随后依次洗涤切片，每次20min；

3)0.2×SSC室温下漂洗5min；

4)Buffer B1室温漂洗2次，每次5min；

5)Buffer B2在含有ddH₂O的湿盒中室温封闭切片1h，Buffer B2配方为900μlBuffer B1，100μl sheep serum(inactivated at 56℃for 30min,store at-80℃)；

6)将切片转移至含有anti-DIG-AP(1:5000)的Buffer B2中，4℃孵育过夜；

第三天：抗体洗脱与NBT/BCIP显色

1)准备3个200ml Buffer B1和2个200ml Buffer B3，B3配方为：20ml 1M Tris-HCl(pH 9.5)，4ml 5M NaCl，10ml 1M MgCl₂，1ml 20％TWEEN-20，165ml ddH₂O；

2)Buffer B1室温下洗涤切片3次，每次20min；

3)Buffer B3室温漂洗2次，每次5-10min；

4)将现配的200μl Buffer B4滴于盖玻片，并倒置于载玻片上，湿盒中室温避光显色10min-1天，一般性腺组织的显色时间为5h。Buffer B4的配方为1ml Buffer B3，20μlNBT/BCIP；

5)待信号清晰明显时，用ddH₂O终止显色反应，如果背景较深的话可以用甲醇漂洗15-30min洗脱背景杂信号；

6)Mowiol Mounting Medium进行最后封片，4℃保存或立即拍照，图1是翘嘴鲌igf3基因在精巢组织中的冰冻切片mRNA原位杂交分析的示意图；图2是翘嘴鲌igf3基因在卵巢组织中的冰冻切片mRNA原位杂交分析的示意图。由图1和图2可知：igf3在精巢中信号较强，而在卵巢未能检测到信号，表明该基因在精巢中表达，而在卵巢中不表达。

实施例2：

1.反义RNA探针制备和纯化：

1)以逆转录得到的翘嘴鲌性腺组织cDNA为模板，利用所述引物通过PCR反应扩增得到igf3基因的部分ORF序列，回收目的片段，反义RNA探针制备用正向引物为：5’-AGCAGAATTCATGCCATCAGACGGAATGCC-3’，反向引物为：5’-GTTGCTCGAGTCGGATGTGGGAGATAAATGT-3’；

2)片段与载体双酶切后进行纯化；

2.翘嘴鲌性腺组织的冰冻切片制备：

1)固定、脱水：将剥离后的性腺组织固定，漂洗，随后在浓度为18％的蔗糖-1×DEPC-PBS溶液中脱水过夜；如果组织块较大，可适当延长固定时间，但不超过48h；

2)包埋、切片：将经步骤1)处理得到的组织放置于OCT包埋剂内，-20℃包埋，冷冻好后即可切片，切片的厚度为10-20μm。

3.冰冻切片的mRNA原位杂交：

1)igf3mRNA探针杂交：将冰冻切片固定后用三乙醇胺溶液，然后用杂交缓冲液进行预杂交，再加入含探针的杂交液进行杂交，100ml 0.1M三乙醇胺溶液配方为：10mlpH8.0、1M DEPC-TEA，90ml DEPC-ddH₂O，250μl乙酸酐；

2)探针洗脱及抗体孵育：将杂交后切片漂洗，然后移至含有anti-DIG-AP的BufferB2中孵育，Buffer B2配方为：900μl Buffer B1，100μl sheep serum；

3)抗体洗脱与显色：将孵育后切片漂洗，然后滴加显色溶液，避光显色，待信号清晰明显时，用ddH₂O终止显色反应，封片，然后拍照。

实施例3：

为了提高翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交过程中反义RNA探针的穿透性和后续封片拍照的清晰度，进一步的优化方案为：

翘嘴鲌性腺组织的冰冻切片制备步骤中用100ml 0.1M三乙醇胺溶液配方为：10mlpH8.0、1M DEPC-TEA，1.3ml巴豆醛，88.7ml DEPC-ddH₂O，250μl乙酸酐；巴豆醛的存在能够在三乙醇的三个羟基处各引入一个新的基团，与细胞具有良好的相容性，吸附在细胞表面，对细胞无毒性，提高后续染色过程中组织的着色能力，且在加入含探针的杂交液后，能与反义RNA探针相结合，使得反义RNA探针能渗透到细胞内，增强反义RNA探针的穿透性，增加反义RNA探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号；同时还能够促进乙酸酐和水反应，放出大量的热，生产乙酸，反应过程中，乙酸充当稀释剂，稀释反应放出的热量，使得乙酸酐尽快溶于水中，在处理切片的时候不需要搅拌步骤，避免转子搅拌对切片的损伤，提高后续封片拍照的清晰度。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 浙江省淡水水产研究所

<120> 一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcagaattc atgccatcag acggaatgcc 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttgctcgag tcggatgtgg gagataaatg t 31

<210> 3

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgccatcag acggaatgcc aacctgtcat gccagacaca ttcagatgct tagaggattc 60

atgctgaagg tgcccagctg gcgaagtgtg tgcgtcctct actccctgta ctgcgtcctg 120

attctgccag acgctggcga agcggtcaaa gcgcgctgtg gacgggaact agtcgctgac 180

ctggagtttg tgtgtggaga ccgtggcttt tacagaggca aacctggagc agcccgtagc 240

ggcggtcctc gctctcgtgg gaaagggatc gtcgagcagt gttgcgtacg gggatgtgac 300

ctccagcatt tggagtcgta ttgtgccaaa cccaagagag tgcgccgtga catccctgca 360

tctctgcagc agactgtgga agatcagttt tggctggtgt ttcagcagcg ataccagaag 420

cttgcaggga tgaagagagg tgagaaagcc acatctcata gactcagaga gcggacgctc 480

ttccggtgga acagagtttc agtattacta aacaccaaca cacccaaccg acccccttca 540

acacaccaac atcctgccac tgagagaatg agatcaagac caacatttat ctcccacatc 600

cgatag 606

Claims

1. 一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法，其特征在于：包括，

翘嘴鲌性腺组织的冰冻切片制备；以及

冰冻切片的mRNA原位杂交，mRNA原位杂交用反义RNA探针序列如SEQ ID NO.3所示；

其中，所述翘嘴鲌性腺组织的冰冻切片制备包括如下步骤：

1）固定、脱水：将剥离后的性腺组织固定，漂洗，随后在蔗糖溶液中脱水过夜，所述蔗糖溶液浓度为18~21%的蔗糖-1×DEPC-PBS溶液；

2）包埋、切片：将经步骤1）处理得到的组织放置于OCT包埋剂内，-20℃包埋，冷冻好后即可切片，所述切片的厚度为10-20μm；

所述冰冻切片的mRNA原位杂交包括如下步骤：

1）igf3 mRNA探针杂交：将冰冻切片固定后用三乙醇胺溶液，然后用杂交缓冲液进行预杂交，再加入含探针的杂交液进行杂交；

2）探针洗脱及抗体孵育：将杂交后切片漂洗，然后移至含有anti-DIG-AP的Buffer B2中孵育；所述Buffer B2配方为：900μl Buffer B1，100μl sheep serum，所述Buffer B1配方为：20ml pH 7.4-7.5、1M Tris-HCl，6ml 5M NaCl，174ml ddH₂O；

3）抗体洗脱与显色：将孵育后切片漂洗，然后滴加显色溶液，避光显色，待信号清晰明显时，用ddH₂O终止显色反应，封片，然后拍照。

2. 根据权利要求1所述的一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法，其特征在于：所述100ml 0.1M三乙醇胺溶液配方为：10ml pH8.0、1M DEPC-TEA，90ml DEPC-ddH₂O，250μl乙酸酐。

3.根据权利要求1所述的一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法，其特征在于：所述igf3基因在精巢中表达，而在卵巢中不表达。