CN111879590A - 肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，它是利用PBS缓冲溶液快速解冻冰冻切片后的剩余肾组织并溶解OCT胶后，重新制成石蜡切片，利用该石蜡切片行特殊染色并进行光镜检查，以弥补光镜检查无肾小球或肾小球过少的情况，本发明步骤简单、操作快捷方便、染色效果佳，能够有效避免患者二次肾活检，减少患者痛苦及经济负担。
Description
技术领域
本发明涉及肾脏病理检查技术领域，具体涉及一种利用肾活检免疫荧光OCT胶包埋冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法。
背景技术
肾活检是肾脏病的诊断的金标准，全称为“肾穿刺活检术”，通常情况下叫做肾穿刺。由于肾脏疾病的种类繁多，病因及发病机制复杂，许多肾脏疾病的临床表现与肾脏的组织学改变并不完全一致。为了明确疾病的病理，进一步确诊患者所患的具体病种，这时就需要做肾穿刺活检术！肾活检的方法是采用肾穿刺针从肾脏取下一条或几条小的组织，通过病理检查，以对肾脏疾病做出正确的诊断。
目前，肾穿刺取出肾组织后，一般分为三部分，一部分肾组织制作成石蜡切片，用于光学显微镜（光镜）检查；一部分肾组织经OCT包埋后迅速冰冻，之后再制成冰冻切片经免疫荧光染色，用于免疫病理检查；另一部分肾组织经戊二醛固定液固定后，用于电子显微镜（电镜）检查，其中，用于免疫病理检查用的冰冻切片紧紧为该冰冻组织的一部分，剩余冰冻组织冰冻存储，目前，光镜检查、免疫病理检查及电镜检查对于肾脏病理诊断缺一不可，尤其是光镜检查最为重要，直接影响患者最终病理诊断。
光镜检查，需要将肾组织制作成石蜡切片，实际工作中光镜检查用的石蜡切片会出现无肾小球或肾小球数量过少的情况，直接影响肾活检病理的诊断工作及准确性，进而影响临床工作的进行，无法根据病人确切的病理情况制定准确的治疗方案。如果需要确诊，患者必须接受二次肾活检，这给患者的精神和经济都带来巨大压力。
发明内容
综上所述，为了克服现有技术问题的不足，本发明提供了一种肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，它是通过解冻冰冻切片后的剩余肾组织并溶解OCT胶后，重新制成石蜡切片，利用该石蜡切片行特殊染色并进行光镜检查，以弥补光镜检查无肾小球或肾小球过少的情况，从而避免患者二次肾活检，减少患者痛苦及经济负担。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，其中：包括以下步骤：
第一步、肾活检免疫荧光冰冻剩余组织储存
肾穿刺取出的一部分肾组织，经OCT胶包埋后，及时迅速利用冰冻切片机对冰冻肾组织进行切片供免疫荧光标记染色，剩余未切片的冰冻肾组织，快速用OCT胶再次封闭包埋放入冻存管中-80℃超低温冰箱储存；
第二步、制作石蜡切片
（1）解冻冰冻肾组织并溶解OCT胶
将第一步储存在-80℃超低温冰箱内的冰冻肾组织取出，室温条件下，迅速放入PBS缓冲溶液中，使冰冻肾组织解冻并快速充分溶解OCT胶；
（2）固定
将肾组织从PBS缓冲溶液中取出，迅速放入10%中性缓冲甲醛固定液中固定，固定2~4小时；
（3）脱水
将固定后的肾组织放入梯度酒精内进行脱水处理；
（4）透明
利用二甲苯对脱水后的肾组织进行透明处理；
（5）浸蜡
将透明处理后的肾组织放入熔化的石蜡液中浸渍2小时；
（6）包埋
将肾组织从熔化的石蜡液中取出，并将其迅速贴附于包埋盒内，石蜡液包埋后置于速冻台上，使石蜡凝固；
（7）石蜡切片
采用石蜡切片机将石蜡包埋的肾组织切片，切片厚度2μm，将石蜡切片放入恒温水浴锅内展片，恒温水浴锅温度控制在45~48℃，之后将石蜡切片从水浴锅内捞出，放入干燥箱内烤片，干燥箱设定烤片温度70-80℃，烤片时间为30~40分钟；
（8）染色
对步骤（7）中烤片后的石蜡切片进行特殊染色处理；
（9）脱水
先将步骤（8）中染色后的石蜡切片放入无水乙醇中浸泡，对石蜡切片进行脱水处理；
（10）透明与封片
将脱水后的石蜡切片放入二甲苯中浸泡，之后，采用全自动封片机将石蜡切片直接封片；至此完成石蜡切片的制作。
本发明的技术方案还可以是这样实现的：第二步、制作石蜡切片的步骤（1）中，所述的PBS缓冲液pH值为7.2-7.6。
本发明的技术方案还可以是这样实现的：第二步、制作石蜡切片的步骤（1）中，准备三个装有PBS缓冲液的容器，将冰冻肾组织依次浸没在三个容器内的PBS缓冲液中，每个容器浸泡一分钟。
本发明的技术方案还可以是这样实现的：第二步、制作石蜡切片的步骤（2）中，所述的10%中性缓冲甲醛包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛溶液及蒸馏水，配置时，先将0.4g磷酸二氢钠与0.65g磷酸氢二钠充分溶解于100ml蒸馏水中制成混合溶液，然后将10ml甲醛溶液加入到混合溶液中并混合均匀。
本发明的技术方案还可以是这样实现的：第二步、制作石蜡切片的步骤（3）中，准备装有70%酒精的容器A，准备装有80%酒精的容器B，准备装有90%酒精的容器C，准备装有95%酒精的容器D，准备装有95%酒精的容器E，准备装有无水乙醇的容器F，准备装有无水乙醇的容器G，将固定后的肾组织依次浸泡在容器A、容器B、容器C、容器D、容器E、容器F、容器G中，每个容器浸泡30分钟。
本发明的技术方案还可以是这样实现的：第二步、制作石蜡切片的步骤（4）中，准备两个装有二甲苯的容器，将脱水后的肾组织依次浸泡在两个容器中的二甲苯内，每个容器浸泡10分钟。
本发明的技术方案还可以是这样实现的：第二步、制作石蜡切片的步骤（5）中，准备三个装有石蜡液的容器，将脱水后的肾组织依次浸泡在三个容器内的石蜡液中，每个容器浸泡40分钟。
本发明的有益效果为：
1、本发明是通过解冻冰冻切片后的剩余肾组织并溶解OCT胶后，重新制成石蜡切片，利用该石蜡切片行特殊染色并进行光镜检查，以弥补光镜检查无肾小球或肾小球过少的情况，从而避免患者二次肾活检，减少患者痛苦及经济负担。
2、本发明的第一步、肾活检免疫荧光冰冻剩余组织储存中，将剩余未切片的冰冻肾组织，快速用OCT胶再次封闭包埋放入冻存管中-80℃超低温冰箱储存，-80℃超低温存储，能够有效延长肾组织标本保存时间，保持组织形态结构，为以后工作需要备用。
3、本发明利用PBS缓冲液快速解冻冰冻肾组织并使OCT胶溶解，方便快捷，室温条件下就能实现冰冻肾组织解冻及OCT胶溶解，没有温度要求及时间特殊要求，使冰冻肾组织快速恢复至最佳状态，有效的提高冰冻肾组织解冻及OCT胶溶解效率，提高重制石蜡切片的效率，本发明使用PBS缓冲液作为冰冻肾组织解冻复温及OCT胶溶解的媒介，PBS缓冲液与0.9%生理盐水相比具有更强的缓冲能力，而且，本发明PBS缓冲液的pH值为7.2-7.6，人体pH值为7.35-7.45，则PBS缓冲液的pH值与人体pH值相近，能够为肾组织细胞提供一个较稳定的酸碱环境，减少细胞损伤。
4、冰冻肾组织解冻及溶解OCT胶过程中，溶解的OCT胶会使PBS缓冲液的浓度降低，进而影响解冻及OCT胶溶解效率，因此，本发明在解冻冰冻肾组织并溶解OCT胶时，将冰冻肾组织依次浸没在三个容器内的PBS缓冲液中，每个容器浸泡一分钟，此种方式能够有效的保证PBS的纯度，提高解冻及OCT胶溶解效率，在能使OCT胶充分溶解并将肾组织清洗干净。
5、本发明采用10%中性缓冲甲醛固定液对肾组织进行固定，10%中性缓冲甲醛固定液为日常病理常用固定液，易获取，经其固定的重制冰余肾组织各项特殊染色效果佳，色彩对比鲜明，与常规石蜡切片肾小球病理改变表现无差异。
6、本发明在对固定后的肾组织进行脱水处理时，采用70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精及无水乙醇对肾组织进行脱水处理，肾组织脱出的水分会对酒精产生稀释作用，导致酒精浓度降低，影响脱水效果，因此，本发明采用两个装有95%酒精的容器，经80%酒精脱水后的肾组织依次浸没在两个装有95%酒精的容器内，之后再将肾组织依次浸没在两个装有无水乙醇的容器中，利用此种脱水方式，能够保证脱水用酒精的浓度，达到更好的脱水效果及提高脱水效率，使肾组织中的水分完全脱除干净，保证后续透明步骤的透明效果及染色步骤的染色效果。
7、本发明的透明过程中，肾组织中的酒精与二甲苯进行置换，为后续浸蜡步骤做准备，肾组织中置换出的酒精会影响容器中的二甲苯的纯度，影响透明效果，因此，本发明将脱水后的肾组织依次浸泡在两个装有二甲苯的容器中，每个容器浸泡10分钟，此种方式保证二甲苯的纯度，保证透明效果，使肾组织中的酒精完全置换为二甲苯，从而保证浸蜡效果。
8、本发明步骤简单、操作快捷方便、染色效果佳，非常适用于肾活检光镜检查组织无球或肾小球过少无法病理诊断的情况，避免患者二次肾活检，减少患者痛苦及经济负担。
附图说明
图1为膜性肾病冰冻剩余肾组织重制石蜡切片与常规石蜡切片染色比较示意图；
A、冰冻剩余组织重制石蜡切片HE染色(×400)；B、冰冻剩余组织重制石蜡切片PAS染色(×400)；C、冰冻剩余组织重制石蜡切片Masson染色(×400)；D、冰冻剩余组织重制石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；E、常规石蜡切片PAS染色HE染色(×400)；F、常规石蜡切片PAS染色(×400)；G、常规石蜡切片Masson染色(×400)；H、常规石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；
图2为狼疮性肾炎冰冻剩余肾组织重制石蜡切片与常规石蜡切片染色比较示意图；
A、冰冻剩余组织重制石蜡切片HE染色(×400)；B、冰冻剩余组织重制石蜡切片PAS染色(×400)；C、冰冻剩余组织重制石蜡切片Masson染色(×400)；D、冰冻剩余组织重制石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；E、常规石蜡切片PAS染色HE染色(×400)；F、常规石蜡切片PAS染色(×400)；G、常规石蜡切片Masson染色(×400)；H、常规石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；
图3为糖尿病肾病冰冻剩余肾组织重制石蜡切片与常规石蜡切片染色比较示意图；
A、冰冻剩余组织重制石蜡切片HE染色(×400)；B、冰冻剩余组织重制石蜡切片PAS染色(×400)；C、冰冻剩余组织重制石蜡切片Masson染色(×400)；D、冰冻剩余组织重制石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；E、常规石蜡切片PAS染色HE染色(×400)；F、常规石蜡切片PAS染色(×400)；G、常规石蜡切片Masson染色(×400)；H、常规石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；
图4为新月体性肾小球肾炎冰冻剩余肾组织重制石蜡切片与常规石蜡切片染色比较示意图；
A、冰冻剩余组织重制石蜡切片HE染色(×400)；B、冰冻剩余组织重制石蜡切片PAS染色(×400)；C、冰冻剩余组织重制石蜡切片Masson染色(×400)；D、冰冻剩余组织重制石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；E、常规石蜡切片PAS染色HE染色(×400)；F、常规石蜡切片PAS染色(×400)；G、常规石蜡切片Masson染色(×400)；H、常规石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；
图5为淀粉样变性肾病冰冻剩余肾组织重制石蜡切片与常规石蜡切片染色比较示意图；
A、冰冻剩余组织重制石蜡切片PAS染色(×400)；B、冰冻剩余组织重制石蜡切片Masson染色(×400)；C、冰冻剩余组织重制石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；D、冰冻剩余组织重制石蜡切片刚果红染色； E、常规石蜡切片PAS染色 (×400)；F、常规石蜡切片Masson染色(×400)；G、常规石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；H、常规石蜡切片刚果红染色；
图6为血栓性微血管病肾损害冰冻剩余肾组织重制石蜡切片与常规石蜡切片染色比较示意图；
A、冰冻剩余组织重制石蜡切片HE染色(×400)；B、冰冻剩余组织重制石蜡切片PAS染色(×400)；C、冰冻剩余组织重制石蜡切片Masson染色(×400)；D、冰冻剩余组织重制石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；E、常规石蜡切片PAS染色HE染色(×400)；F、常规石蜡切片PAS染色(×400)；G、常规石蜡切片Masson染色(×400)；H、常规石蜡切片PASM染色套染Mssson染色(×400)；。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例一
本实施例以膜性肾病病变患者肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片为例，膜性肾病病变肾小球呈弥漫性分布，抗原抗体免疫复合物主要沉积于肾小球毛细血管壁，光镜下变化主要是肾小球基底膜增厚的病变。具体操作步骤如下：
一种肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，其中：包括以下步骤：
第一步、肾活检免疫荧光冰冻剩余组织储存
肾穿刺取出的一部分肾组织，经OCT胶包埋后，及时迅速利用冰冻切片机对冰冻肾组织进行切片供免疫荧光标记染色，剩余未切片的冰冻肾组织，快速用OCT胶再次封闭包埋放入冻存管中-80℃超低温冰箱储存；
第二步、制作石蜡切片
（1）解冻冰冻肾组织并溶解OCT胶
将第一步储存在-80℃超低温冰箱内的冰冻肾组织取出，室温条件下，迅速放入PBS缓冲溶液中，使冰冻肾组织解冻并快速充分溶解OCT胶，所述的PBS缓冲液pH值为7.2-7.6。
操作时，准备三个装有PBS缓冲液的容器，将冰冻肾组织依次浸没在三个容器内的PBS缓冲液中，每个容器浸泡一分钟。
（2）固定
先配置10%中性缓冲甲醛固定液，配置时，先将0.4g磷酸二氢钠与0.65g磷酸氢二钠充分溶解于100ml蒸馏水中制成混合溶液，然后将10ml甲醛溶液加入到混合溶液中并混合均匀。
然后，将肾组织从PBS缓冲溶液中取出，迅速放入10%中性缓冲甲醛固定液中固定，固定2~4小时；
（3）脱水
将固定后的肾组织放入酒精内进行脱水处理；
准备装有70%酒精的容器A，装备装有80%酒精的容器B，装备装有90%酒精的容器C，装备装有95%酒精的容器D，装备装有95%酒精的容器E，装备装有无水乙醇的容器F，装备装有无水乙醇的容器G，将固定后的肾组织依次浸泡在容器A、容器B、容器C、容器D、容器E、容器F、容器G中，每个容器浸泡30分钟。
（4）透明
利用二甲苯对脱水后的肾组织进行透明处理；
准备两个装有二甲苯的容器，将脱水后的肾组织依次浸泡在两个容器中的二甲苯内，每个容器浸泡10分钟。
（5）浸蜡
将透明处理后的肾组织放入熔化的石蜡液中浸渍2小时；
准备三个装有石蜡液的容器，石蜡液温度为58-60℃，将脱水后的肾组织依次浸泡在三个容器内的石蜡液中，每个容器浸泡40分钟。
（6）包埋
将肾组织从熔化的石蜡液中取出，并将其迅速贴附于包埋盒内，包埋后置于速冻台上，使石蜡凝固；
（7）石蜡切片
采用石蜡切片机将石蜡包埋的肾组织切片，切片厚度2μm，将石蜡切片放入恒温水浴锅内展片，恒温水浴锅温度控制在48℃，之后将石蜡切片从水浴锅内捞出，放入干燥箱内烤片，干燥箱设定烤片温度70℃，烤片时间为40分钟；
（8）染色
对步骤（7）中烤片后的石蜡切片进行特殊染色处理；
对步骤（7）中烤片后的石蜡切片分别进行HE染色处理、PAS染色处理、Masson染色处理、PASM染色套染 Masson染色处理。
苏木素-伊红染色（HE染色）：细胞核显紫蓝色，细胞质显红色，可观察细胞的种类和数量。过碘酸雪夫反应（PAS染色）：对糖原和糖蛋白染成紫红色，可显示肾小球和肾小管的基底膜以及增生的系膜基质等细胞外基质，并根据基底膜的轮廓判断固有细胞的种类。马松三色染色（Masson染色）：基底膜和Ⅲ型胶原显绿色，免疫复合物或血浆、纤维蛋白显红色。六胺银染色（PASM染色）：基底膜和系膜基质以及Ⅳ型胶原显黑色。
PASM染色套染 Masson染色处理，即将PASM与Masson两种染色用于同一切片，可使免疫复合物的沉积定位显示更精确。
（9）脱水
先将步骤（8）中染色后的石蜡切片放入无水乙醇中浸泡，对石蜡切片进行脱水处理；
准备两个装有无水乙醇的容器，然后，将步骤（8）中染色后的石蜡切片依次浸泡在两个容器中，每个容器各30秒。
（10）透明与封片
将脱水后的石蜡切片放入二甲苯中浸泡，之后，采用全自动封片机将石蜡切片直接封片；至此完成石蜡切片的制作。
操作时，准备两个装有二甲苯的容器，然后将脱水后的石蜡切片依次浸泡在两个容器中，每个容器浸泡1分钟，最后，采用全自动封片机将石蜡切片直接封片。
将封片后的石蜡切片在光学显微镜下观察并拍照。膜性肾病病变肾小球呈弥漫性分布，抗原抗体免疫复合物主要沉积于肾小球毛细血管壁，光镜下变化主要是肾小球基底膜增厚的病变，根据基底膜的病变严重程度，分为五期（Ⅰ期，Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅳ期，Ⅴ期）。
如图1所示，本实施例制作的冰冻剩余组织石蜡切片的光学显微镜照片四种染色完全达到上述各种染色要求，且与常规石蜡切片对比染色表现的膜性肾病病理改变效果一致（图1-A与图1-E、图1-B与图1-F、图1-C与图1-G、图1-D与图1-H对比）。通过本实施例利用膜性肾病的免疫荧光冰冻剩余组织制作的石蜡切片进行的特殊染色，切片完整、无皱褶。Masson染色可见上皮下大量嗜复红蛋白沉积（图1-C中红色部分，图1-G中红色部分）；PASM染色套染 Masson染色可见肾小球基底膜增厚（图1-D中黑色部分，图1-H中黑色部分）。冻剩余组织重制石蜡切片染色病理改变符合Ⅱ期膜性肾病的病理改变，与常规光镜检查石蜡切片染色效果无差异，能够满足该疾病病理诊断要求。
实施例二
重复实施例一，有以下不同点：
本实施例以狼疮性肾炎病变患者肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片为例，重复实施例一的操作步骤，利用狼疮性肾炎病变患者的冰冻剩余组织重制石蜡切片后，将封片后的石蜡切片在光学显微镜下观察并拍照。狼疮性肾炎病变较复杂，光镜表现不单一根据病理改变可分为Ⅰ～Ⅴ型。
如图2所示，本实施例制作的冰余组织石蜡切片的光学显微镜照片四种染色完全达到上述各种染色要求，且与常规石蜡切片对比染色表现的狼疮性肾炎病理改变效果一致（图2-A与图2-E、图2-B与图2-F、图2-C与图2-G、图2-D与图2-H对比）。通过本实施例利用狼疮性肾炎的免疫荧光冰冻剩余组织制作的石蜡切片进行的特殊染色，切片完整、无皱褶。PAS染色可见肾小球系膜细胞和内皮细胞弥漫增生（图2-B）；Masson染色可见系膜区、内皮下大量嗜复红蛋白沉积（图2-C）。冻剩余组织重制石蜡切片染色病理改变符和毛细血管内增生性狼疮肾炎(Ⅳ型LN)的病理改变，与常规光镜检查石蜡切片染色效果无差异，能够满足该疾病病理诊断要求。
实施例三
重复实施例一，有以下不同点：
本实施例以糖尿病肾病患者肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片为例，重复实施例一的操作步骤，利用糖尿病肾病患者的冰冻剩余组织重制石蜡切片后，将封片后的石蜡切片在光学显微镜下观察并拍照。糖尿病肾病每一阶段病变如毛细血管袢肥大、基底膜增厚、系膜基质增生、K-W结节、肾小囊玻璃滴状病变及肾小球纤维素样帽状病变。
如图3所示，本实施例制作的冰余组织石蜡切片的光学显微镜照片四种染色完全达到上述各种染色要求，且与常规石蜡切片对比染色表现的糖尿病肾病病理改变效果一致（图3-A与图3-E、图3-B与图3-F、图3-C与图3-G、图3-D与图3-H对比）。通过本实施例利用糖尿病肾病的免疫荧光冰冻剩余组织制作的石蜡切片进行的特殊染色，切片完整、无皱褶。PAS染色可见肾小球系膜细胞和基质中重度增生,以系膜基质为主（图3-B）；Masson染色与PASM染色套染 Masson染色可见k-w结节,毛细血管周边袢可见瘤样扩张,可见纤维素毛改变及囊滴,基底膜增厚。（图3-C、图3-D）。冻剩余组织重制石蜡切片染色病理改变符和结节性糖尿病肾小球硬化症的病理改变，与常规光镜检查石蜡切片染色效果无差异，能够满足该疾病病理诊断要求。
实施例四
重复实施例一，有以下不同点：
本实施例以新月体性肾小球肾炎患者肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片为例，重复实施例一的操作步骤，利用新月体性肾小球肾炎患者的冰冻剩余组织重制石蜡切片后，将封片后的石蜡切片在光学显微镜下观察并拍照。新月体性肾小球肾炎光镜下检查绝大多数肾小球（＞50%）有新月体形成，病变肾小球毛细血管袢严重破坏，早期可见节段性纤维素样坏死，后期也可见基底膜断裂。
如图4所示，本实施例制作的冰余组织石蜡切片的光学显微镜照片四种染色完全达到上述各种染色要求，且与常规石蜡切片对比染色表现的新月体性肾小球肾炎病理改变效果一致（图4-A与图4-E、图4-B与图4-F、图4-C与图4-G、图4-D与图4-H对比）。通过本实施例利用新月体性肾小球肾炎的免疫荧光冰冻剩余组织制作的石蜡切片进行的特殊染色，切片完整、无皱褶。HE染色、PAS染色、Masson染色与PASM染色套染 Masson染色均可见＞50%新月体形成（图4-A、图4-B、图4-C、图4-D）；Masson染色肾小球毛细血管袢坏死（图4-C）。冻剩余组织重制石蜡切片染色病理改变符和新月体性肾小球肾炎的病理改变，与常规光镜检查石蜡切片染色效果无差异，能够满足该疾病病理诊断要求。
实施例五
重复实施例一，有以下不同点：所述的第二步、制作石蜡切片的步骤（8）中，染色时，对步骤（7）中烤片后的石蜡切片分别进行PAS染色处理、Masson染色处理、PASM染色套染Masson染色处理、刚果红染色处理。
刚果红染色处理可见肾小球、肾间质、血管壁砖红色阳性物质沉积，刚果红染色是病理诊断淀粉样蛋白公认方法。
本实施例以淀粉样变性肾病患者肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片为例，重复实施例一的操作步骤，利用淀粉样变性肾病患者的冰冻剩余组织重制石蜡切片后，将封片后的石蜡切片在光学显微镜下观察并拍照。淀粉样变性肾病淀粉样蛋白主要沉积于肾小球系膜区和毛细血管基底膜、肾小管基底膜和小动脉壁，严重时沉积于肾间质，沉积部位可见均质PAS淡然物质。早期PASM染色套染 Masson染色可见节段睫毛状结构。
如图5所示，本实施例制作的冰余组织石蜡切片的光学显微镜照片四种染色完全达到上述各种染色要求，且与常规石蜡切片对比染色表现的淀粉样变性肾病病理改变效果一致（图5-A与图5-E、图5-B与图5-F、图5-C与图5-G、图5-D与图5-H对比）。通过本实施例利用淀粉样变性肾病的免疫荧光冰冻剩余组织制作的石蜡切片进行的特殊染色，切片完整、无皱褶。PAS染色可见肾小球系膜细胞轻度增生,系膜区增宽，系膜区、内皮下、肾间质、小动脉管壁均可见均质PAS淡染物质沉积（图5-A）；Masson染色可见淀粉样蛋白呈蓝绿色（图5-B，图5-F）；PASM染色套染 Masson染色可见淀粉样蛋白呈浅灰色（图5-C，图5-G）；刚果红染色可见肾小球、肾间质、血管壁砖红色阳性物质沉积，刚果红染色是病理诊断淀粉样蛋白公认方法（图5-D,图5-H）。冻剩余组织重制石蜡切片染色病理改变符和淀粉样变性肾病的病理改变，与常规光镜检查石蜡切片染色效果无差异，能够满足该疾病病理诊断要求。
实施例六
重复实施例一，有以下不同点：
本实施例以血栓性微血管病肾损害患者肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片为例，重复实施例一的操作步骤，利用血栓性微血管病肾损害患者的冰冻剩余组织重制石蜡切片后，将封片后的石蜡切片在光学显微镜下观察并拍照。血栓性微血管病以内皮细胞损伤为主，进而出现肾小球毛细血管、细动脉、小叶间动脉乃至弓状动脉血栓形成、管壁增厚、官腔狭窄的特殊病理形态。
如图6所示，本实施例制作的冰余组织石蜡切片的光学显微镜照片四种染色完全达到上述各种染色要求，且与常规石蜡切片对比染色表现的血栓性微血管病病理改变效果一致（图6-A与图6-E、图6-B与图6-F、图6-C与图6-G、图6-D与图6-H对比）。通过本实施例利用血栓性微血管病的免疫荧光冰冻剩余组织制作的石蜡切片进行的特殊染色，切片完整、无皱褶。PAS染色可见肾小球内皮细胞增生肿胀、小动脉内皮细胞肿胀（图6-B，图6-F）；PASM染色套染 Masson染色可见肾小球基底膜增厚，呈分层状改变（图6-D，图6-H）。冻剩余组织重制石蜡切片染色病理改变符和血栓性微血管病的病理改变，与常规光镜检查石蜡切片染色效果无差异，能够满足该疾病病理诊断要求。
要说明的是，以上所述实施例是对本发明技术方案的说明而非限制，所属技术领域普通技术人员的等同替换或者根据现有技术而做的其它修改，只要没超出本发明技术方案的思路和范围，均应包含在本发明所要求的权利范围之内。
Claims (7)
1.一种肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步、肾活检免疫荧光冰冻剩余组织储存
肾穿刺取出的一部分肾组织，经OCT胶包埋后，及时迅速利用冰冻切片机对冰冻肾组织进行切片供免疫荧光标记染色，剩余未切片的冰冻肾组织，快速用OCT胶再次封闭包埋放入冻存管中-80℃超低温冰箱储存；
第二步、制作石蜡切片
（1）解冻冰冻肾组织并溶解OCT胶
将第一步储存在-80℃超低温冰箱内的冰冻肾组织取出，室温条件下，迅速放入PBS缓冲溶液中，使冰冻肾组织解冻并快速充分溶解OCT胶；
（2）固定
将肾组织从PBS缓冲溶液中取出，迅速放入10%中性缓冲甲醛固定液中固定，固定2~4小时；
（3）脱水
将固定后的肾组织放入梯度酒精内进行脱水处理；
（4）透明
利用二甲苯对脱水后的肾组织进行透明处理；
（5）浸蜡
将透明处理后的肾组织放入熔化的石蜡液中浸渍2小时；
（6）包埋
将肾组织从熔化的石蜡液中取出，并将其迅速贴附于包埋盒内，石蜡液包埋后置于速冻台上，使石蜡凝固；
（7）石蜡切片
采用石蜡切片机将石蜡包埋的肾组织切片，切片厚度2μm，将石蜡切片放入恒温水浴锅内展片，恒温水浴锅温度控制在45~48℃，之后将石蜡切片从水浴锅内捞出，放入干燥箱内烤片，干燥箱设定烤片温度70-80℃，烤片时间为30~40分钟；
（8）染色
对步骤（7）中烤片后的石蜡切片进行特殊染色处理；
（9）脱水
先将步骤（8）中染色后的石蜡切片放入无水乙醇中浸泡，对石蜡切片进行脱水处理；
（10）透明与封片
将脱水后的石蜡切片放入二甲苯中浸泡，之后，采用全自动封片机将石蜡切片直接封片；至此完成石蜡切片的制作。
2.根据权利要求1所述的肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，其特征在于：第二步、制作石蜡切片的步骤（1）中，所述的PBS缓冲液pH值为7.2-7.6。
3.根据权利要求1所述的肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，其特征在于：第二步、制作石蜡切片的步骤（1）中，准备三个装有PBS缓冲液的容器，将冰冻肾组织依次浸没在三个容器内的PBS缓冲液中，每个容器浸泡一分钟。
4.根据权利要求1所述的肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，其特征在于：第二步、制作石蜡切片的步骤（2）中，所述的10%中性缓冲甲醛包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛溶液及蒸馏水，配置时，先将0.4g磷酸二氢钠与0.65g磷酸氢二钠充分溶解于100ml蒸馏水中制成混合溶液，然后将10ml甲醛溶液加入到混合溶液中并混合均匀。
5.根据权利要求1所述的肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，其特征在于： 第二步、制作石蜡切片的步骤（3）中，准备装有70%酒精的容器A，准备装有80%酒精的容器B，准备装有90%酒精的容器C，准备装有95%酒精的容器D，准备装有95%酒精的容器E，准备装有无水乙醇的容器F，准备装有无水乙醇的容器G，将固定后的肾组织依次浸泡在容器A、容器B、容器C、容器D、容器E、容器F、容器G中，每个容器浸泡30分钟。
6.根据权利要求1所述的肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，其特征在于： 第二步、制作石蜡切片的步骤（4）中，准备两个装有二甲苯的容器，将脱水后的肾组织依次浸泡在两个容器中的二甲苯内，每个容器浸泡10分钟。
7.根据权利要求1所述的肾活检免疫荧光冰冻剩余组织重制石蜡切片的方法，其特征在于： 第二步、制作石蜡切片的步骤（5）中，准备三个装有石蜡液的容器，将脱水后的肾组织依次浸泡在三个容器内的石蜡液中，每个容器浸泡40分钟。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN103674677A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-03-26 | 哈尔滨医科大学 | 一种脑组织快速冰冻切片的制备方法 |
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-
2020
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN103674677A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-03-26 | 哈尔滨医科大学 | 一种脑组织快速冰冻切片的制备方法 |
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| Title |
|---|
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| 郑燕璇 等: "肾穿组织免疫荧光及HE染色方法的改 良", vol. 8, no. 8, pages 81 - 82 * |
| 郑燕璇 等: "肾穿组织免疫荧光及HE染色方法的改良", 《中国医学创新》, vol. 8, no. 30, pages 81 - 82 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN112798378A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-05-14 | 四川大学华西医院 | 一种免疫荧光干片恢复剂及其应用 |
| CN112798378B (zh) * | 2021-01-29 | 2023-03-24 | 四川大学华西医院 | 一种免疫荧光干片恢复剂及其应用 |
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