CN112649269B - 一种用于Bax和Bcl-2的免疫组织化学染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种用于Bax和Bcl‑2的免疫组织化学染色方法，包括：采用胰酶‑EDTA溶液进行抗原修复。本发明对传统的抗原修复进行改进，通过采用胰酶‑EDTA溶液，使得免疫组化结果图染色背景浅，抗原暴露位点完整，定位准确，非特异性染色少，显色准确，强度表达强弱分明，易于统计表达率和表达强度，同时一抗与抗原结合更加紧密，不易洗脱，可减少相关实验步骤和成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于Bax和Bcl-2的免疫组织化学染色方法。
背景技术
免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。Bcl-2蛋白质家族是细胞凋亡过程中的一类重要调节因子，目前发现其成员个数己超过25个。
Bcl-2蛋白质家族主要通过相互作用使线粒体外膜通透并释放促凋亡因子导致细胞凋亡，所有Bcl-2蛋白质只有定位在线粒体外膜才能发挥调控细胞凋亡的作用。其分为两类：1.效应者：包括Bax等为促凋亡蛋白，一般都含有BH1-BH4结构域，生理状态下大多以未活化的单体形式定位于细胞浆中，内质网等细胞器中也有少量分布，当凋亡刺激传递到细胞后，其构象改变，易位进入线粒体外膜并被激活，活化后的效应者可通过寡聚化形成多聚体并在线粒体外膜上形成孔道。2.保护者：包括Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1等蛋白，为抗凋亡蛋白，通常位于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，一般都含有BH1-BH4 结构域，保护者可与活化后的效应者结合抑制其活性。
传统的免疫组织化学染色方法存在以下不足：1.一抗和二抗结合不紧密，PBS孵育时易洗脱；2.DAB显色定位不准确；3.表达部位不清楚。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于Bax和Bcl-2的免疫组织化学染色方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
为解决上述技术问题所采用的技术方案：
一种用于Bax和Bcl-2的免疫组织化学染色方法，所述染色方法中，包括：采用胰酶-EDTA溶液进行抗原修复。
优选地，所述染色方法，具体包括如下步骤：
S1、取动物组织制成蜡块后切片，再脱蜡，水化处理；
S2、将所述S1得到的切片置于0.1～0.15体积％的胰酶-EDTA溶液中进行抗原修复；
S3、将所述S2得到的切片滴加1～3体积％的过氧化氢溶液进行孵育；
S4、往所述S3得到的切片加入一抗进行孵育；
S5、往所述S4得到的切片加入二抗进行孵育；
S6、对所述S5得到的切片进行DAB染色；
S7、将所述S6得到的切片依次采用苏木素复染、盐酸酒精分化、稀碳酸锂水溶液返蓝操作；
S8、将所述S7得到的切片进行脱水，使透明，封片。
优选地，所述S1具体为：取动物组织制成蜡块后切片，然后将得到的切片在常温下置于二甲苯中浸泡10～12分钟，更换二甲苯后再重复浸泡两次；采用100％，95％，90％，80％，70％体积百分比的乙醇，浓度由高到低依次浸泡3～5分钟，其后蒸馏水浸泡3～5分钟， PBS清洗1～3次，每次3～6分钟。
优选地，所述S2具体为：将所述S1得到的切片置于0.1～0.15 体积％的胰酶-EDTA溶液中，于35～40℃下孵育20～40分钟，其后 PBS清洗1～3次，每次3～6分钟。
优选地，所述S2具体为：将所述S1得到的切片置于0.125体积％的胰酶-EDTA溶液中，于37℃下孵育30分钟，其后PBS清洗2次，每次5分钟。
优选地，所述S4具体为：往所述S3得到的切片滴加一抗，于 35～40℃下孵育20～40分钟，再于1～5℃下孵育10～15小时，然后于室温下静置10～20分钟，其后PBS清洗1～3次，每次3～6分钟；所述一抗为Bax或Bcl-2，浓度为1：(200～300)。一抗：抗体，用于结合器官组织内的抗原。室温指25±5℃，于室温下静置可使抗原抗体结合更加紧密牢靠。
优选地，所述S5具体为：往所述S4得到的切片滴加二抗，于 20～30℃下孵育20～40分钟，其后PBS清洗1～3次，每次3～6分钟；所述二抗为山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG。二抗用于结合一抗。
优选地，所述S7具体为：将所述S6得到的切片滴加苏木素，自来水冲洗后，将切片置于酒精盐酸溶液中洗脱，然后将切片置于稀碳酸锂水溶液中复蓝，再用自来水冲洗。
优选地，所述S8具体为：将所述S7得到的切片依次置于70％， 80％，95％，100％，100％体积百分比的酒精中分别浸泡1～3分钟，1～3分钟，1～3分钟，3～6分钟，3～6分钟；然后将切片置于二甲苯中浸泡3～6分钟，更换二甲苯后再浸泡3～6分钟，然后采用中性树脂封片。
本发明的第二个目的在于提供上述所述的免疫组织化学染色方法在观测动物组织中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明对传统的抗原修复进行改进，通过采用胰酶-EDTA溶液，使得免疫组化结果图染色背景浅，抗原暴露位点完整，定位准确，非特异性染色少，显色准确，强度表达强弱分明，易于统计表达率和表达强度，同时一抗与抗原结合更加紧密，不易洗脱，可减少相关实验步骤和成本。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
图1是本发明本实施例1的免疫组织化学染色结果图；
图2是本发明本实施例2的免疫组织化学染色结果图；
图3是本发明本实施例3的免疫组织化学染色结果图；
图4是本发明本实施例4的免疫组织化学染色结果图；
图5是本发明本实施例5的免疫组织化学染色结果图；
图6是本发明本实施例6的免疫组织化学染色结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于Bax的免疫组织化学染色方法，包括如下步骤：
S1、取猪病毒性肝组织制成蜡块后切片，然后将得到的切片在常温下置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再重复浸泡两次；采用100％，95％，90％，80％，70％体积百分比的乙醇，浓度由高到低依次浸泡3分钟，其后蒸馏水浸泡3分钟，PBS清洗2次，每次5 分钟。
S2、将所述S1得到的切片置于0.125体积％的胰酶-EDTA溶液中，于37℃下孵育30分钟，其后PBS清洗2次，每次5分钟。
S3、将所述S2得到的切片滴加2体积％的过氧化氢溶液进行孵育15分钟；
S4、往所述S3得到的切片滴加浓度为1：250的Bax，于37℃下孵育30分钟，再于4℃下孵育12小时，然后于室温下静置15分钟，其后PBS清洗2次，每次5分钟；
S5、往所述S4得到的切片滴加山羊抗小鼠IgG，于26℃下孵育 30分钟，其后PBS清洗2次，每次5分钟；
S6、对所述S5得到的切片进行DAB染色，显色终止后用自来水冲洗；
S7、将所述S6得到的切片滴加苏木素，自来水冲洗后，将切片置于酒精盐酸溶液中洗脱，然后将切片置于稀碳酸锂水溶液中复蓝，再用自来水冲洗。
S8、将所述S7得到的切片依次置于70％，80％，95％，100％， 100％体积百分比的酒精中分别浸泡2分钟，2分钟，2分钟，5分钟， 5分钟；然后将切片置于二甲苯中浸泡5分钟，更换二甲苯后再浸泡 5分钟，然后采用中性树脂封片。
本实施例的免疫组织化学染色结果图如图1所示，DAB显色定位准确，强弱分明，表达强为深棕色，表达弱为浅棕色。
实施例2
一种用于Bcl-2的免疫组织化学染色方法，包括如下步骤：
S1、取猪病毒性肝组织制成蜡块后切片，然后将得到的切片在常温下置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再重复浸泡两次；采用100％，95％，90％，80％，70％体积百分比的乙醇，浓度由高到低依次浸泡3分钟，其后蒸馏水浸泡3分钟，PBS清洗1次，每次6 分钟。
S2、将所述S1得到的切片置于0.1体积％的胰酶-EDTA溶液中，于35℃下孵育20分钟，其后PBS清洗1次，每次6分钟。
S3、将所述S2得到的切片滴加1体积％的过氧化氢溶液进行孵育20分钟；
S4、往所述S3得到的切片滴加浓度为1：200的Bcl-2，于35℃下孵育20分钟，再于1℃下孵育10小时，然后于室温下静置10分钟，其后PBS清洗1次，每次6分钟；
S5、往所述S4得到的切片滴加山羊抗小鼠IgG，于20℃下孵育 20分钟，其后PBS清洗1次，每次6分钟；
S6、对所述S5得到的切片进行DAB染色，显色终止后用自来水冲洗；
S7、将所述S6得到的切片滴加苏木素，自来水冲洗后，将切片置于酒精盐酸溶液中洗脱，然后将切片置于稀碳酸锂水溶液中复蓝，再用自来水冲洗。
S8、将所述S7得到的切片依次置于70％，80％，95％，100％， 100％体积百分比的酒精中分别浸泡1分钟，1分钟，1分钟，3分钟， 3分钟；然后将切片置于二甲苯中浸泡3分钟，更换二甲苯后再浸泡3分钟，然后采用中性树脂封片。
本实施例的免疫组织化学染色结果图如图2所示，DAB显色定位准确，强弱分明，表达强为深棕色，表达弱为浅棕色。
实施例3
一种用于Bcl-2的免疫组织化学染色方法，包括如下步骤：
S1、取猪病毒性肝组织制成蜡块后切片，然后将得到的切片在常温下置于二甲苯中浸泡12分钟，更换二甲苯后再重复浸泡两次；采用100％，95％，90％，80％，70％体积百分比的乙醇，浓度由高到低依次浸泡5分钟，其后蒸馏水浸泡5分钟，PBS清洗3次，每次3 分钟。
S2、将所述S1得到的切片置于0.15体积％的胰酶-EDTA溶液中，于40℃下孵育40分钟，其后PBS清洗3次，每次3分钟。
S3、将所述S2得到的切片滴加3体积％的过氧化氢溶液进行孵育10分钟；
S4、往所述S3得到的切片滴加浓度为1：300的Bcl-2，于40℃下孵育40分钟，再于5℃下孵育15小时，然后于室温下静置20分钟，其后PBS清洗3次，每次3分钟；
S5、往所述S4得到的切片滴加山羊抗兔IgG，于30℃下孵育40 分钟，其后PBS清洗3次，每次3分钟；
S6、对所述S5得到的切片进行DAB染色，显色终止后用自来水冲洗；
S7、将所述S6得到的切片滴加苏木素，自来水冲洗后，将切片置于酒精盐酸溶液中洗脱，然后将切片置于稀碳酸锂水溶液中复蓝，再用自来水冲洗。
S8、将所述S7得到的切片依次置于70％，80％，95％，100％， 100％体积百分比的酒精中分别浸泡3分钟，3分钟，3分钟，6分钟， 6分钟；然后将切片置于二甲苯中浸泡6分钟，更换二甲苯后再浸泡6分钟，然后采用中性树脂封片。
本实施例的免疫组织化学染色结果图如图3所示，DAB显色定位准确，无非特异性染色。
对比例1(采用传统的染色方法)
一种用于Bax的免疫组织化学染色方法，包括如下步骤：
S1、采用猪病毒性肝进行石蜡切片脱蜡至水；
S2、PBS冲洗，5分钟×2次；
S3、加入pH为6的柠檬酸盐缓冲液，于微波炉内微波辐射10 分钟；
S4、PBS冲洗，5分钟×2次；
S5、3％的过氧化氢溶液孵育15分钟；
S6、PBS冲洗，5分钟×2次；
S7、5％正常山羊血清封闭，于37℃下孵育30分钟；
S8、滴加浓度为1：250的Bax，于37℃下孵育30分钟；
S9、PBS冲洗，5分钟×2次；
S10、滴加山羊抗小鼠IgG，于26℃下孵育30分钟；
S11、PBS冲洗，5分钟×2次；
S12、DAB显色剂显色，适时镜下终止，水冲洗；
S13、复染，苏木精染色；
S14、脱水透明，封片。
本实施例的免疫组织化学染色结果图如图4所示，DAB不显色。
对比例2(采用传统的染色方法)
一种用于Bcl-2的免疫组织化学染色方法，包括如下步骤：
S1、采用猪病毒性肝进行石蜡切片脱蜡至水；
S2、PBS冲洗，5分钟×2次；
S3、加入pH为6的柠檬酸盐缓冲液，于微波炉内微波辐射10 分钟；
S4、PBS冲洗，5分钟×2次；
S5、3％的过氧化氢溶液孵育15分钟；
S6、PBS冲洗，5分钟×2次；
S7、5％正常山羊血清封闭，于37℃下孵育30分钟；
S8、滴加浓度为1：200的Bcl-2，于37℃下孵育30分钟；
S9、PBS冲洗，5分钟×2次；
S10、滴加山羊抗小鼠IgG，于26℃下孵育30分钟；
S11、PBS冲洗，5分钟×2次；
S12、DAB显色剂显色，适时镜下终止，水冲洗；
S13、复染，苏木精染色；
S14、脱水透明，封片。
本实施例的免疫组织化学染色结果图如图5所示，DAB显色强度低，无法统计。
对比例3(采用传统的染色方法)
一种用于Bcl-2的免疫组织化学染色方法，包括如下步骤：
S1、采用猪病毒性肝进行石蜡切片脱蜡至水；
S2、PBS冲洗，3分钟×3次；
S3、加入pH为6.5的柠檬酸盐缓冲液，于微波炉内微波辐射15 分钟；
S4、PBS冲洗，3分钟×3次；
S5、1％的过氧化氢溶液孵育20分钟；
S6、PBS冲洗，3分钟×3次；
S7、5％正常山羊血清封闭，于37℃下孵育30分钟；
S8、滴加浓度为1：300的Bcl-2，于37℃下孵育30分钟；
S9、PBS冲洗，3分钟×3次；
S10、滴加山羊抗小鼠IgG，于26℃下孵育30分钟；
S11、PBS冲洗，3分钟×3次；
S12、DAB显色剂显色，适时镜下终止，水冲洗；
S13、复染，苏木精染色；
S14、脱水透明，封片。
本实施例的免疫组织化学染色结果图如图6所示，DAB不显色。以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (5)
1.一种免疫组织化学染色方法，其特征在于，所述染色方法中，包括：采用胰酶-EDTA溶液进行抗原修复；
所述染色方法，具体包括如下步骤：
S1、取动物组织制成蜡块后切片，再脱蜡，水化处理；
S2、将所述S1得到的切片置于0.1~0.15体积％的胰酶-EDTA溶液中进行抗原修复；
S3、将所述S2得到的切片滴加1~3体积％的过氧化氢溶液进行孵育；
S4、往所述S3得到的切片加入一抗进行孵育；
S5、往所述S4得到的切片加入二抗进行孵育；
S6、对所述S5得到的切片进行DAB染色；
S7、将所述S6得到的切片依次采用苏木素复染、盐酸酒精分化、稀碳酸锂水溶液返蓝操作；
S8、将所述S7得到的切片进行脱水，使透明，封片；
所述S1具体为：取动物组织制成蜡块后切片，然后将得到的切片在常温下置于二甲苯中浸泡10~12分钟，更换二甲苯后再重复浸泡两次；采用100％，95％，90％，80％，70％体积百分比的乙醇，浓度由高到低依次浸泡3~5分钟，其后蒸馏水浸泡3~5分钟，PBS清洗1~3次，每次3~6分钟；
所述S2具体为：将所述S1得到的切片置于0.1~0.15体积％的胰酶-EDTA溶液中，于35~40℃下孵育20~40分钟，其后PBS清洗1~3次，每次3~6分钟；
所述S4具体为：往所述S3得到的切片滴加一抗，于35~40℃下孵育20~40分钟，再于1~5℃下孵育10~15小时，然后于室温下静置10~20分钟，其后PBS清洗1~3次，每次3~6分钟；所述一抗为Bax或Bcl-2；
所述S5具体为：往所述S4得到的切片滴加二抗，于20~30℃下孵育20~40分钟，其后PBS清洗1~3次，每次3~6分钟；所述二抗为山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG。
2.根据权利要求1所述的免疫组织化学染色方法，其特征在于，所述S2具体为：将所述S1得到的切片置于0.125体积％的胰酶-EDTA溶液中，于37℃下孵育30分钟，其后PBS清洗2次，每次5分钟。
3.根据权利要求1所述的免疫组织化学染色方法，其特征在于，所述S7具体为：将所述S6得到的切片滴加苏木素，自来水冲洗后，将切片置于酒精盐酸溶液中洗脱，然后将切片置于稀碳酸锂水溶液中复蓝，再用自来水冲洗。
4.根据权利要求1所述的免疫组织化学染色方法，其特征在于，所述S8具体为：将所述S7得到的切片依次置于70％，80％，95％，100％，100％体积百分比的酒精中分别浸泡1~3分钟，1~3分钟，1~3分钟，3~6分钟，3~6分钟；然后将切片置于二甲苯中浸泡3~6分钟，更换二甲苯后再浸泡3~6分钟，然后采用中性树脂封片。
5.权利要求1-4中任一项所述的免疫组织化学染色方法在观测动物组织中的应用。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN104293823A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-01-21 | 四川农业大学 | 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白的制备方法和应用 |
| CN105988002A (zh) * | 2015-03-03 | 2016-10-05 | 南京鼓楼医院 | Mst1和磷酸化mst1作为子宫内膜容受性检测的方法 |
| CN107290542A (zh) * | 2017-05-05 | 2017-10-24 | 中山大学附属第医院 | 一种改进的免疫组织化学试验方法 |
-
2020
- 2020-12-31 CN CN202011633844.1A patent/CN112649269B/zh active Active
Patent Citations (3)
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| Publication number | Publication date |
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