CN105988002A - Mst1和磷酸化mst1作为子宫内膜容受性检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，包括将人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEK293T细胞维持培养于含有10％FBS和青链霉素双抗的DMEM/F12培养液中培养；免疫印记实验；免疫共沉淀；免疫组织化学；染色体免疫共沉淀(ChIP)/PCR分析MST1对HOXA10转录活性的调节；人绒毛膜癌细胞(BeWo)细胞球黏附实验的步骤。本发明方便快捷检测MST1和MST1磷酸化修饰在子宫内膜组织中的表达水平，将能直接反映出子宫内膜的容受性状态。
Description
技术领域
本发明属于妇产科学领域，特别涉及一种子宫内膜容受性检测的方法。
背景技术
胚胎的成功着床离不开容受性发育良好的母体内膜。在月经周期后期，受卵巢分泌的雌、孕激素的影响，正常子宫内膜产生一系列形态、生化方面的规律性变化，发育形成容受性内膜，为胚胎种植做准备。但在IVF-ET周期中，子宫腺肌病、薄型子宫内膜以及不明原因反复种植失败患者的子宫内膜容受性发育缺陷，造成胚胎种植失败，也是制约IVF-ET临床妊娠率进一步提高的重要原因。同时，随着十八大三中全会明确提出开放“单独二胎”政策，将有近百万个符合政策的高龄妇女或“失独家庭”准备生育二胎。由于高龄或多次人流术后造成子宫内膜损伤，这部分妇女的子宫内膜容受性降低，反复着床失败现象较为常见。需对这部分患者建立较为方便可靠的内膜容受性检测方法，并进一步分析子宫内膜容受性降低原因，以期采取个体化治疗措施。
如何评价子宫内膜容受性是否适合胚胎移植，临床现有的指标主要分为：子宫内膜形态学和超声学指标，但仍然无法准确、有效预测异常子宫内膜的容受性。胞饮突的出现标志着子宫内膜的最佳容受期。研究表明，胞饮突缺乏的患者，胚胎移植后种植反复失败；胞饮突越丰富的患者妊娠率越高。胞饮突被认为是子宫内膜容受性的超微结构性标记，可以准确反应子宫内膜的容受性，但是其检测需要扫描电镜观察，制备过程复杂，很难在临床大规模开展。
目前研究普遍认为，转录因子HOXA10是子宫内膜容受性关键性转录调控因子和标志性分子。在子宫内膜容受性的建立过程中，种植“窗口期”形成，HOXA10等分子调控子宫内膜上皮细胞的增殖与分化，确保胚胎的正确定位和黏附。而HOXA10基因敲除小鼠不孕，表现出着床障碍，而排卵正常。机制研究表明HOXA10基因缺陷导致内膜胞饮突形成缺乏，整合素β3的表达降低和子宫内膜免疫功能紊乱，影响内膜容受性的建立。临床资料分析子宫腺肌病和反复种植失败患者显示子宫内膜中HOXA10的表达量降低，以及其下游调控胚胎着床的关键基因ITGB3和IGFBP-1等表达异常。
近期，通过酵母双杂交筛选和免疫共沉淀技术我们发现子宫内膜组织中丝苏氨酸激酶MST1与HOXA10生理性相互结合；腺病毒介导的MST1过表达、基因沉默和体外磷酸化实验证实MST1介导了雌孕激素引起的子宫内膜细胞中HOXA10蛋白T376位苏氨酸的磷化修饰作用；当HOXA10蛋白第376位苏氨酸突变为赖氨酸时，HOXA10的对β3-integrin启动子的转录激活做用丧失，表明HOXA10的磷酸化修饰对其转录活性具有重要调控作用；进一步胚胎与子宫内膜细胞粘附实验表明转录因子HOXA10T376位苏氨酸残基磷酸化修饰参与子宫内膜细胞中容受性标志分子β3-integrin的表达而增加胚胎与内膜间的粘附作用；给予孕1.5天孕鼠宫角注射HOXA10T376突变腺病毒能明显抑制小鼠胚胎的着床；在此基础上，我们成功制备了针对HOXA10蛋白第376位苏氨酸残基特异性的磷酸化单克隆抗体。临床样本与小鼠围种植期子宫内膜组织免疫印迹实验证实MST1、磷酸化MST1及HOXA10第376位苏氨酸残基磷酸化修饰水平能够更好的反映子宫内膜容受性的变化状况。
综合文献与我们的研究结果，子宫内膜容受性的状态不仅可以通过MST1和HOXA10蛋白表达量的变化，更可以结合MST1和HOXA10蛋白磷酸化水平综合加以评估。方便快捷检测MST1和HOXA10在子宫内膜组织中的表达及修饰水平，将能直接反映出子宫内膜的容受性状态，这也将为子宫内膜容受性低下的快速诊断提供新的手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，以解决现有技术中存在的无法准确、有效预测异常子宫内膜的容受性问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)细胞培养
将人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEK293T细胞维持培养于含有10％FBS和青链霉素双抗的DMEM/F12培养液中，待细胞长至90％汇集时，用质量体积比为0.25％胰酶细胞消化液常规消化传代，在37℃、5％CO2、饱和湿度中培养；
(2)免疫印记实验
步骤(1)处理的Ishikawa或HEK293T细胞经预冷的PBS漂洗后，加入细胞裂解缓冲液，刮取收集细胞，4℃旋转裂解30min；12000g离心30min后收集上清；经Bradford法测定蛋白质浓度后，取总蛋白进行10％SDS-PAGE胶电泳分离，并按常规方法转印至PVDF膜上，加入以下相应抗体：anti-Myc-HRP,anti-Flag-HRP,anti-MST1,Phospho-MST1(Thr183),anti-phosphothreonine,anti-phosphoserine,anti-HOXA10,anti-β-actin,anti-GAPDH，进行相关蛋白表达与磷酸化修饰检测；
(3)免疫共沉淀
HEK293T细胞长至80％汇集后，采用脂质体FuGENE 6将Myc-HOXA10和/或Flag-MST1cDNA转入HEK293T细胞，48小时后收集细胞总蛋白，分别与c-MycBeads和/或Flag M2Beads4℃缓慢摇动孵育过夜，Beads经预冷的RIPA buffer洗3次，每次5分钟后，离心收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃加热5分钟，离心，取上清进行10％SDS-PAGE电泳，蛋白经转移至硝酸纤维素膜上后按Western blotting常规操作进行分析蛋白间相互作用情况；
Ishikawa细胞总蛋白经ProteinA/G agarose 4℃缓慢旋转孵育2h，5000g、4℃离心1min后收集上清，分别加入HOXA10抗体与Rabbit IgG，4℃缓慢旋转孵育4h后，再加入ProteinA/G，在4℃缓慢旋转孵育过夜，次日5000g、4℃离心1min收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃金属浴加热5分钟，冰上静置5min，离心后取上清进行10％SDS-PAGE胶电泳分离，按照常规方法转印到PVDF膜上，加入Anti-MST1抗体进行MST1蛋白检测，以明确Ishikawa细胞中MST1与HOXA10相互结合情况；
(4)免疫组织化学
收集临床病人分泌中晚期子宫内膜组织，固定并石蜡包埋；石蜡切片常规脱蜡至水，经EDTA抗原修复后；PBST漂洗3次，每次5min，滴加3％H2O2-纯甲醇溶液,37℃30min灭活内源性过氧化物酶；PBST漂洗3次，每次5min，滴加5％山羊血清37℃封闭30min；甩去多余的液体，滴加1:100稀释的兔抗MST1抗体和Phospho-MST1(Thr183)抗体，4℃孵育过夜，PBST漂洗3次，每次5min,滴加1:400生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30min；PBST漂洗4次，每次5min，按DAB显色试剂盒所述方法进行显色，室温显色5–15min后蒸馏水洗涤终止显色，脱水、透明、封片后于显微镜下进行观察人子宫内膜组织中MST1及磷酸化MST1的细胞定位及表达改变情况并拍照；
(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)/PCR分析MST1对HOXA10转录活性的调节
(6)人绒毛膜癌细胞(BeWo)细胞球黏附实验
利用人绒毛膜癌BeWo细胞系建立体外细胞球培养体系作为体外胚胎粘附于内膜细胞单层上的模型。
进一步的，所述步骤(5)的具体方法如下：
培养的Ishikawa接种于Ф10cm细胞培养皿中，待细胞长至60％汇集时，分别感染Ad-LacZ腺病毒、Ad-HOXA10、Ad-HOXA10(T376A)、Ad-MST1和Ad-MST1与Ad-HOXA10腺病毒(MOI＝50)，6h后更换培养液以去除腺病毒，37℃，5％CO2培养箱中培养；72h后，细胞经PBS漂洗后，加入甲醛至终浓度为1％，室温交联15min，加入终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联反应10min；预冷的PBS漂洗细胞两次，加入裂解液裂解细胞，3000rpm离心3min后，弃上清；加入核裂解液重悬细胞沉淀，冰上超声震荡，以获取500-2000bp的染色质片段；超声后裂解产物4℃，10000rpm离心15min，取上清；加入蛋白A/G-琼脂糖，4℃旋转孵育2h以去除非特异性结合的染色质片段；分别加入兔抗HOXA10抗体和兔IgG，4℃旋转孵育过夜，加入蛋白A/G-琼脂糖，室温孵育2h，离心收集并漂洗琼脂颗粒，65℃水浴30min打开交联，加入洗脱液室温孵育15min，去除琼脂颗粒，保留洗脱液；洗脱液加入终浓度为0.3M NaCl和RNase，65℃水浴5h后，酒精沉淀DNA；加入蛋白酶K，45℃孵育2h后用酚-氯仿提纯CHIP DNA；以纯化的DNA片段为模板进行PCR扩增及测序；PCR扩增特异性β3-integrin启动子的序列为：5’-AATGCCCTTGGCTGAGAGGAAG-3’和5’-TTCCTAGCTACACCTCGTTTGCG-3’(GenBank accession no.AF020552)。
进一步的，所述步骤(6)的具体方法如下：
a.用无水乙醇配置浓度为10mg/mL的poly-HEMA溶液，37℃摇床摇过夜，以充分溶解，溶液于常温下保存；
b.构建悬浮培养环境：用10mg/mL的poly-HEMA溶液包被细胞培养孔板，待用；c.胰酶消化生长至融合度为90％的BeWo单层细胞，进行细胞计数，稀释细胞密度为1x105个细胞/mL，将细胞接种于预先用poly-HEMA处理过的60mm的细胞培养皿中，放入37℃，5％CO2培养箱中进行细胞的悬浮培养，并随时观察培养细胞是否成团；
d.将Ishikawa细胞消化接种于十二孔细胞培养板中，待细胞融合度为80％时，感染50MOI MST1和/或20MOI HOXA10腺病毒进行相应基因的过表达，48hr后，将已培养成球的BeWo细胞球接种于处理过的Ishikawa细胞单层之上，两者共培养1.5hr，预热至37℃的含钙和镁离子的PBS轻轻漂洗十二孔板两次，4％多聚甲醛室温固定30min，统计粘附的细胞球数，并计算细胞的粘附效率。
进一步的，所述步骤(1)中，青链霉素双抗为100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
进一步的，所述步骤(2)中，细胞裂解缓冲液为50.0mmol/L Tris pH＝7.6,150.0mmol/L NaCl,0.1％SDS,1.0％NP-40,Protease Inhibitor Cocktail,Phosphatase Inhibitor Cocktail(Sigma)。
进一步的，所述anti-pHOXA10抗体的制备方法是：多肽抗原信息：磷酸化肽(C-RSVHL(pT)DRQVK)，对照肽(C-RSVHLTDRQVK)进行免疫小鼠，按常规流程制备单克隆抗体。
进一步的，裂解液为20mM Tris-HCl pH 8.0，85mM KCl，1mM EDTA，0.5mM EGTA，0.5％NP40，protease inhibitor cocktail。
进一步的，核裂解液为50mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA，1％SDS，andprotease inhibitor cocktail。
进一步的，洗脱液为1％SDS，0.1M NaHCO3。
本发明的有益效果是：本发明方便快捷检测MST1和HOXA10在子宫内膜组织中的表达及修饰水平，将能直接反映出子宫内膜的容受性状态。临床样本与小鼠围种植期子宫内膜组织免疫印迹实验证实MST1、磷酸化MST1及HOXA10第376位苏氨酸残基磷酸化修饰水平能够更好的反映子宫内膜容受性的变化状况子宫内膜容受性的状态不仅可以通过MST1和HOXA10蛋白表达量的变化，更可以结合MST1和HOXA10蛋白磷酸化水平综合加以评估。方便快捷检测MST1和HOXA10在子宫内膜组织中的表达及修饰水平，将能直接反映出子宫内膜的容受性状态，这也将为子宫内膜容受性低下的快速诊断提供新的手段。
附图说明
图1是MST1与HOXA10相互结合；
图2是MST1磷酸化HOXA10第376位苏氨酸残基；
图3是MST1磷酸化HOXA10促进胚胎黏附；
图4是MST1和HOXA10及其蛋白磷酸化修饰在围种植期孕鼠子宫组织中高表达；
图5是MST1和磷酸化MST1在反复种植失败患者子宫内膜组织中低表达。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。
一种磷酸化HOXA10作为子宫内膜容受性检测的方法，包括以下步骤：
(1)细胞培养
人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEK293T细胞维持培养于含10％FBS和青链霉素双抗(100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM/F12培养液中(GibcoBRL/Invitrogen)，待细胞长至90％汇集时，用质量体积比为0.25％的胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTA，Gibco BRL/Invitrogen)常规消化传代，37℃、5％CO2、饱和湿度中培养。
(2)免疫印记实验(Western Blot)
Ishikawa或HEK293T细胞经预冷的PBS漂洗两次后，加入500μL细胞裂解缓冲液[50.0mmol/L Tris pH＝7.6,150.0mmol/L NaCl,0.1％SDS,1.0％NP-40,Protease Inhibitor Cocktail,Phosphatase Inhibitor Cocktail(Sigma)]，刮取收集细胞，4℃旋转裂解30min；12000g离心30min后收集上清；经Bradford法测定蛋白质浓度后，取30μg的总蛋白进行10％SDS-PAGE胶电泳分离，并按常规方法转印至PVDF膜上(Millipore)，加入相应抗体[anti-Myc-HRP(1:5000,Invitrogen),anti-Flag-HRP(1:5000,sigma),anti-MST1(1:1000,CellSignaling Technology),Phospho-MST1(Thr183)(1:1000,Cell SignalingTechnology),anti-phosphothreonine(1:1000,sigma),anti-phosphoserine(1:1000,sigma),anti-HOXA10(1:1000,Santa Cruz),anti-β-actin(1:10,000,Abcam),anti-GAPDH(1:10,000,Abcam)]进行相关蛋白表达与磷酸化修饰检测。
(3)免疫共沉淀
HEK293T细胞长至80％汇集后，采用脂质体FuGENE 6将3μg Myc-HOXA10和/或Flag-MST1cDNA转入HEK293T细胞，48小时后收集细胞总蛋白，分别与c-MycBeads(Invitrogen)和/或Flag M2Beads(Sigma)4℃缓慢摇动孵育过夜。Beads经预冷的RIPA buffer洗3×5分钟后，离心收集Beads，加入30μL 2×SDS上样缓冲液，95℃加热5分钟，离心，取上清进行10％SDS-PAGE电泳。蛋白经转移至硝酸纤维素膜上后按Western blotting常规操作进行分析蛋白间相互作用情况。
1mg Ishikawa细胞总蛋白经ProteinA/G agarose 4℃缓慢旋转孵育2h，5000g、4℃离心1min后收集上清，分别加入2μg HOXA10抗体(H-90，Santa Cruz)与2μg Rabbit IgG，4℃缓慢旋转孵育4h后，再加入30μL ProteinA/G，在4℃缓慢旋转孵育过夜。次日5000g、4℃离心1min收集Beads。加入50μL 2×SDS上样缓冲液，95℃金属浴加热5分钟，冰上静置5min，离心后取上清进行10％SDS-PAGE胶电泳分离，按照常规方法转印到PVDF膜上，加入Anti-MST1抗体进行MST1蛋白检测，以明确Ishikawa细胞中MST1与HOXA10相互结合情况。
(4)免疫组织化学
收集临床病人分泌中晚期子宫内膜组织，固定并石蜡包埋。石蜡切片常规脱蜡至水，经EDTA抗原修复后；PBST漂洗3×5min，滴加3％H2O2-纯甲醇溶液,37℃30min灭活内源性过氧化物酶；PBST漂洗3×5min，滴加5％山羊血清37℃封闭30min；甩去多余的液体，滴加1:100稀释的兔抗MST1抗体和Phospho-MST1(Thr183)抗体。4℃孵育过夜，PBST漂洗3×5min,滴加1:400生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30min；PBST漂洗4×5min，按DAB显色试剂盒所述方法进行显色(于1mL蒸馏水中加入试剂盒中的A、B、C试剂各1滴,混匀后滴加到组织片上)，室温显色5–15min后蒸馏水洗涤终止显色。脱水、透明、封片后于显微镜下进行观察人子宫内膜组织中MST1及磷酸化MST1的细胞定位及表达改变情况并拍照。
(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)/PCR分析MST1对HOXA10转录活性的调节以HOXA10已知靶基因β3-integrin为例详述实验方法。培养的Ishikawa接种于Ф10cm细胞培养皿中，待细胞长至60％汇集时，分别感染Ad-LacZ腺病毒、Ad-HOXA10、Ad-HOXA10(T376A)、Ad-MST1和Ad-MST1与Ad-HOXA10腺病毒(MOI＝50)，6h后更换培养液以去除腺病毒，37℃，5％CO2培养箱中培养；72h后，细胞经PBS漂洗后，加入甲醛至终浓度为1％，室温交联15min，加入终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联反应10min；预冷的PBS漂洗细胞两次，加入1mL裂解液(20mM Tris-HCl pH 8.0，85mM KCl，1mM EDTA，0.5mM EGTA，0.5％NP40，protease inhibitor cocktail)裂解细胞，3000rpm离心3min后，弃上清。加入500μL核裂解液(50mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA，1％SDS，and protease inhibitor cocktail)重悬细胞沉淀，冰上超声震荡，以获取500-2000bp的染色质片段；超声后裂解产物4℃，10000rpm离心15min，取上清。加入30μL蛋白A/G-琼脂糖(Protein A/G–Agarose，Invitrogen)4℃旋转孵育2h以去除非特异性结合的染色质片段；分别加入5μg兔抗HOXA10抗体和兔IgG，4℃旋转孵育过夜，加入30μL蛋白A/G-琼脂糖，室温孵育2h，离心收集并漂洗琼脂颗粒，65℃水浴30min打开交联，加入洗脱液(1％SDS，0.1M NaHCO3)室温孵育15min，去除琼脂颗粒，保留洗脱液。洗脱液加入终浓度为0.3M NaCl和RNase，65℃水浴5h后，酒精沉淀DNA；加入蛋白酶K 45℃孵育2h后用酚-氯仿提纯CHIP DNA；以纯化的DNA片段为模板进行PCR扩增及测序。PCR扩增特异性β3-integrin启动子的序列为：5’-AATGCCCTTGGCTGAGAGGAAG-3’和5’-TTCCTAGCTACACCTCGTTTGCG-3’(GenBank accession no.AF020552)。
(6)人绒毛膜癌细胞(BeWo)细胞球黏附实验
利用人绒毛膜癌BeWo细胞系建立体外细胞球培养体系作为体外胚胎粘附于内膜细胞单层上的模型。具体方法简述如下：
(1)用无水乙醇配置浓度为10mg/mL的poly-HEMA溶液(sigma货号：041M0024U)，37℃摇床摇过夜，以充分溶解，溶液于常温下保存。
(2)构建悬浮培养环境：用10mg/mL的poly-HEMA溶液包被细胞培养孔板，以6孔板为例：6孔细胞培养板中每孔加入2mL配置好的终浓度为10mg/mL的poly-HEMA，待乙醇挥发干燥后再重复操作两次，挥发干燥后无菌保存待用，使用之前用无菌PBS清洗3次，超净台紫外灯下照射30min，待用。
(3)胰酶消化生长至融合度为90％的BeWo单层细胞，进行细胞计数，稀释细胞密度为1x105个细胞/mL，将细胞接种于预先用poly-HEMA处理过的60mm的细胞培养皿中，放入37℃，5％CO2培养箱中进行细胞的悬浮培养，并随时观察培养细胞是否成团。
(4)将Ishikawa细胞消化接种于十二孔细胞培养板中，待细胞融合度为80％时，感染50MOI MST1和/或20MOI HOXA10腺病毒进行相应基因的过表达。48hr后，将已培养成球的BeWo细胞球接种于处理过的Ishikawa细胞单层之上，两者共培养1.5hr。预热至37℃的含钙和镁离子的PBS轻轻漂洗十二孔板两次，4％多聚甲醛室温固定30min，统计粘附的细胞球数，并计算细胞的粘附效率。
anti-pHOXA10抗体的制备方法是：多肽抗原信息：磷酸化肽(C-RSVHL(pT)DRQVK)，对照肽(C-RSVHLTDRQVK)进行免疫小鼠，按常规流程制备单克隆抗体。
Claims (9)
1.一种MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)细胞培养
将人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEK293T细胞维持培养于含有10％FBS和青链霉素双抗的DMEM/F12培养液中，待细胞长至90％汇集时，用质量体积比为0.25％胰酶细胞消化液常规消化传代，在37℃、5％CO2、饱和湿度中培养；
(2)免疫印记实验
步骤(1)处理的Ishikawa或HEK293T细胞经预冷的PBS漂洗后，加入细胞裂解缓冲液，刮取收集细胞，4℃旋转裂解30min；12000g离心30min后收集上清；经Bradford法测定蛋白质浓度后，取总蛋白进行10％ SDS-PAGE胶电泳分离，并按常规方法转印至PVDF膜上，加入以下相应抗体：anti-Myc-HRP,anti-Flag-HRP,anti-MST1,Phospho-MST1(Thr183),anti-phosphothreonine,anti-phosphoserine,anti-HOXA10,anti-β-actin,anti-GAPDH，进行相关蛋白表达与磷酸化修饰检测；
(3)免疫共沉淀
HEK293T细胞长至80％汇集后，采用脂质体FuGENE 6将Myc-HOXA10和/或Flag-MST1 cDNA转入HEK293T细胞，48小时后收集细胞总蛋白，分别与c-MycBeads和/或Flag M2Beads4℃缓慢摇动孵育过夜，Beads经预冷的RIPA buffer洗3次，每次5分钟后，离心收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃加热5分钟，离心，取上清进行10％ SDS-PAGE电泳，蛋白经转移至硝酸纤维素膜上后按Western blotting常规操作进行分析蛋白间相互作用情况；
Ishikawa细胞总蛋白经ProteinA/G agarose 4℃缓慢旋转孵育2h，5000g、4℃离心1min后收集上清，分别加入HOXA10抗体与Rabbit IgG，4℃缓慢旋转孵育4h后，再加入ProteinA/G，在4℃缓慢旋转孵育过夜，次日5000g、4℃离心1min收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃金属浴加热5分钟，冰上静置5min，离心后取上清进行10％ SDS-PAGE胶电泳分离，按照常规方法转印到PVDF膜上，加入Anti-MST1抗体进行MST1蛋白检测，以明确Ishikawa细胞中MST1与HOXA10相互结合情况；
(4)免疫组织化学
收集临床病人分泌中晚期子宫内膜组织，固定并石蜡包埋；石蜡切片常规脱蜡至水，经EDTA抗原修复后；PBST漂洗3次，每次5min，滴加3％H2O2-纯甲醇溶液,37℃30min灭活内源性过氧化物酶；PBST漂洗3次，每次5min，滴加5％山羊血清37℃封闭30min；甩去多余的液体，滴加1:100稀释的兔抗MST1抗体和Phospho-MST1(Thr183)抗体，4℃孵育过夜，PBST漂洗3次，每次5min,滴加1:400生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30min；PBST漂洗4次，每次5min，按DAB显色试剂盒所述方法进行显色，室温显色5–15min后蒸馏水洗涤终止显色，脱水、透明、封片后于显微镜下进行观察人子宫内膜组织中MST1及磷酸化MST1的细胞定位及表达改变情况并拍照；
(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)/PCR分析MST1对HOXA10转录活性的调节
(6)人绒毛膜癌细胞(BeWo)细胞球黏附实验
利用人绒毛膜癌BeWo细胞系建立体外细胞球培养体系作为体外胚胎粘附于内膜细胞单层上的模型。
2.如权利要求1所述的MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：所述步骤(5)的具体方法如下：
培养的Ishikawa接种于Ф10cm细胞培养皿中，待细胞长至60％汇集时，分别感染Ad-LacZ腺病毒、Ad-HOXA10、Ad-HOXA10(T376A)、Ad-MST1和Ad-MST1与Ad-HOXA10腺病毒(MOI＝50)，6h后更换培养液以去除腺病毒，37℃，5％CO2培养箱中培养；72h后，细胞经PBS漂洗后，加入甲醛至终浓度为1％，室温交联15min，加入终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联反应10min；预冷的PBS漂洗细胞两次，加入裂解液裂解细胞，3000rpm离心3min后，弃上清；加入核裂解液重悬细胞沉淀，冰上超声震荡，以获取500-2000bp的染色质片段；超声后裂解产物4℃，10000rpm离心15min，取上清；加入蛋白A/G-琼脂糖，4℃旋转孵育2h以去除非特异性结合的染色质片段；分别加入兔抗HOXA10抗体和兔IgG，4℃旋转孵育过夜，加入蛋白A/G-琼脂糖，室温孵育2h，离心收集并漂洗琼脂颗粒，65℃水浴30min打开交联，加入洗脱液室温孵育15min，去除琼脂颗粒，保留洗脱液；洗脱液加入终浓度为0.3M NaCl和RNase，65℃水浴5h后，酒精沉淀DNA；加入蛋白酶K，45℃孵育2h后用酚-氯仿提纯CHIP DNA；以纯化的DNA片段为模板进行PCR扩增及测序；PCR扩增特异性β3-integrin启动子的序列为：5’-AATGCCCTTGGCTGAGAGGAAG-3’和5’-TTCCTAGCTACACCTCGTTTGCG-3’(GenBank accession no.AF020552)。
3.如权利要求1所述的MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：所述步骤(6)的具体方法如下：
a.用无水乙醇配置浓度为10mg/mL的poly-HEMA溶液，37℃摇床摇过夜，以充分溶解，溶液于常温下保存；
b.构建悬浮培养环境：用10mg/mL的poly-HEMA溶液包被细胞培养孔板，待用；
c.胰酶消化生长至融合度为90％的BeWo单层细胞，进行细胞计数，稀释细胞密度为1x105个细胞/mL，将细胞接种于预先用poly-HEMA处理过的60mm的细胞培养皿中，放入37℃，5％CO2培养箱中进行细胞的悬浮培养，并随时观察培养细胞是否成团；
d.将Ishikawa细胞消化接种于十二孔细胞培养板中，待细胞融合度为80％时，感染50MOI MST1和/或20MOI HOXA10腺病毒进行相应基因的过表达，48hr后，将已培养成球的BeWo细胞球接种于处理过的Ishikawa细胞单层之上，两者共培养1.5hr，预热至37℃的含钙和镁离子的PBS轻轻漂洗十二孔板两次，4％多聚甲醛室温固定30min，统计粘附的细胞球数，并计算细胞的粘附效率。
4.如权利要求1所述的MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，青链霉素双抗为100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
5.如权利要求1所述的MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，细胞裂解缓冲液为50.0mmol/L Tris pH＝7.6,150.0mmol/L NaCl,0.1％SDS,1.0％NP-40,Protease Inhibitor Cocktail,Phosphatase Inhibitor Cocktail(Sigma)。
6.如权利要求1所述的MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：所述anti-pHOXA10抗体的制备方法是：多肽抗原信息：磷酸化肽(C-RSVHL(pT)DRQVK)，对照肽(C-RSVHLTDRQVK)进行免疫小鼠，按常规流程制备单克隆抗体。
7.如权利要求2所述的MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：裂解液为20mM Tris-HCl pH 8.0，85mM KCl，1mM EDTA，0.5mM EGTA，0.5％NP40，protease inhibitor cocktail。
8.如权利要求2所述的MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：核裂解液为50mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA，1％SDS，andprotease inhibitor cocktail。
9.如权利要求2所述的MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：洗脱液为1％ SDS，0.1M NaHCO3。
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