CN105842037A - 一种同时显示肥大细胞与嗜酸性细胞的染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，提供了一种同时显示肥大细胞与嗜酸性细胞的染色方法，采用甲苯胺蓝染色液和改良瑞氏‑吉姆萨染色液相结合的染色方法，在同一张组织学切片上显示肥大细胞和嗜酸性细胞，肥大细胞的细胞质呈现紫红色或蓝紫色，而嗜酸性细胞的细胞质呈现粉色，其他组织结构为蓝色或淡蓝色。本方法解决了分别染色后因位置结构差异难以准确判定试验结果的难题，本染色方法不仅直观性强，而且是在同一个断面上显示，保证试验结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，提供了一种同时显示肥大细胞与嗜酸性细胞的染色方法。
背景技术
1878年德国学者Paul Ehrlich首次在大鼠的结缔组织中发现了肥大细胞，并发现肥大细胞的细胞质所含的具有独特染色特点的颗粒。肥大细胞是一种包含嗜碱性颗粒、参与炎症和调节免疫反应的多功能效应细胞，而炎症和免疫反应常涉及嗜酸性细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等，因此这些指标也是科学研究中用于诊断疾病的重要参考指标。肥大细胞与嗜酸性细胞染色方法所获得的信息可有助于诊断、鉴别诊断与这两种细胞有关疾病或病变，有助于分析这两种细胞参与的生理调控反应，为进行深入的科学研究提供依据。因此分析这两种细胞的数量和分布规律成为科学研究特别是有关粘膜免疫首选指标，其科学研究应用较为广泛。
以往对嗜酸性细胞的显示是采用瑞氏染色方法，关于肥大细胞的染色方法常采用甲苯胺蓝染色液、中性红染色液或阿尔新蓝染色液进行染色。虽然杨建平创建了改良的甲苯胺蓝染色方法可以特异性的显示子宫内的肥大细胞，染色结果是胞质中有紫红色颗粒分布，但对这两种细胞的显示仍需要在两张组织学切片上分别进行染色后才能显示出来，不能做到在一张组织学切片上同时显示两种细胞，这样就导致多切片之间位置结构差异影响对结果的判断，减低检测的准确性。
发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，创建一种同时显示肥大细胞与嗜酸性细胞的染色方法。采用甲苯胺蓝染色液和改良瑞氏-吉姆萨染色液相结合的染色方法，在同一张组织学切片上显示肥大细胞和嗜酸性细胞，肥大细胞的细胞质呈现蓝紫色或紫红色、嗜酸性细胞的细胞质呈现粉色，其他细胞呈现蓝色或淡蓝色。本方法解决了分别染色因位置结构差异难以准确判定试验结果的难题，本染色方法不仅直观性强，而且是在同一个断面上显示，保证试验结果的准确性。
发明人提供的具体技术方案如下：
一种同时显示肥大细胞与嗜酸性细胞的染色方法，采用甲苯胺蓝染色液和改良瑞氏-吉姆萨染色液相结合的染色方法，其中所述的甲苯胺蓝染色液每150毫升配制方法如下：
配制A液：将1.0-1.2克甲苯胺蓝放入100毫升的蒸馏水内，使甲苯胺蓝完全溶于蒸馏水中；
配制B液：将0.9-1.0克高锰酸钾放入50毫升的蒸馏水内，使高锰酸钾完全溶于蒸馏水中；
将已经配制好的A液在1000℃电磁炉上煮沸10分钟，再将配制好的B液慢慢滴入A液中，形成甲苯胺蓝混合染液；将混合染液煮沸10分钟，使甲苯胺蓝充分被氧化；将经过煮沸的混合染液用蒸馏水补足使该混合染液的总体积为150毫升，室温下使甲苯胺蓝混合染液自然冷却，过滤后即为甲苯胺蓝染色液；
所述改良瑞氏-吉姆萨染色液配制包括瑞氏染色液的配制和吉姆萨染色液的配置，以及pH 6.4的磷酸缓冲液的配制，具体配制方法如下：
瑞氏染色液的配制：将0.2-0.3克Wright’s色素粉剂倒入100毫升的甲醇中，搅拌使Wright’s色素粉剂完全溶解在甲醇液体中，而后将此溶液放入棕色试剂瓶中保存，室温放置30天后可以使用；
之所以瑞氏染色液需要在棕色试剂瓶中保存并室温放置30天后可以使用，原因在于本发明中瑞氏染料由伊红和美蓝的氧化物组成，其溶于甲醇后，解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子，放置30天以上的时间可以使染料溶解、分解更充分，有利于其使用，并提高染色效果；
吉姆萨染色液的配制：将1.8-2.0克Giemsa’s色素粉剂倒入100毫升的甲醇中，搅拌使Giemsa’s色素完全溶解在甲醇中；另将100毫升的甘油液体在水浴锅内加热，水浴锅温度为58-60℃，加热时间持续120-140分钟，将加热后甘油慢慢加入到上述Giemsa’s色素与甲醇的染液中，将三者充分混匀后再放入37℃恒温箱中保存10-11小时，取出混合液体装入棕色试剂瓶中保存，室温放置48小时后可以使用。
与瑞氏染色液配置后需要放置一定时间相同，本发明的吉姆萨染液为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，染液放置48小时后，才能保证染料溶解、分解充分，提高其染色效率。
pH6.4的磷酸缓冲液的配制：将6.63克磷酸二氢钾和56.0克磷酸氢二钠粉剂倒入体积为1000毫升的蒸馏水中，搅拌后使磷酸二氢钾和磷酸氢二钠完全溶解在蒸馏水中，检测溶液的pH值，并用磷酸二氢钾或磷酸氢二钠调整溶液的pH值为6.4。
与现有技术中用甲苯胺蓝进行肥大细胞的染色和采用瑞氏染色液对嗜酸性细胞进行染色是在两张切片上分别进行不同，本发明首创了对肥大细胞与嗜酸性细胞在同一张组织学切片上显示的试验研究，其最主要的不同之处就在于上述提供的染色液，其中本发明所提供的瑞氏染色液与现有的瑞氏染色液相比，提高了Wright’s粉的用量，使得瑞氏染色液浓度增大，同时本发明增加吉姆萨染色液及pH 6.4的磷酸缓冲液与瑞氏染色液按比例配比使用，目的在于增强对嗜酸性细胞细胞质的显色，提高染色的效果，在显微镜下呈现出清晰的粉色，属于本领域的首次创新使用；
而对于甲苯胺蓝染色液而言，本发明除提高染色液浓度之外，还额外添加了高锰酸钾，并利用煮沸的方式使甲苯胺蓝充分氧化，染色时间调整为3-5秒，减少其他组织结构着色，有利于和嗜酸性细胞区分；
综合上述几点改进，实现了对肥大细胞与嗜酸性细胞在同一张组织学切片上显示，填补了现有技术的空白。
发明人在上述基础上更进一步的提供了染色的具体步骤为：
步骤a：石蜡组织学切片脱蜡后复水；
步骤b：嗜酸性细胞染色；
步骤c：肥大细胞染色；
步骤d：分色；
步骤e：脱水、透明、封片、观察。
其中步骤a：石蜡组织学切片脱蜡后复水：
具体步骤包括：将已经制备好厚度为5-8微米的石蜡组织切片经过二甲苯浸泡后除去组织上的石蜡(二甲苯浸泡两次，每次5-10分钟)；然后入二甲苯：无水乙醇(体积比1：1)液体内浸泡5-10分钟；再依次放入无水乙醇、95％酒精、90％酒精、85％酒精、80％酒精、70％酒精、50％酒精、蒸馏水8种液体内分别浸泡5分钟；
步骤b：进行嗜酸性细胞染色
首先制备染色液，将已经配制好的吉姆萨染色液、瑞氏染色液和pH 6.4的磷酸缓冲液按照体积比为1：5：14的比例进行混合形成改良的瑞氏-吉姆萨染色液，用于嗜酸性细胞染色，将步骤a中在蒸馏水中的组织学切片放入该染色液中浸泡染色，时间为10-15分钟，再入蒸馏水冲洗多余染色液；
此步骤的判定标准：普通光学显微镜下400倍放大观察组织内除嗜酸性细胞细胞质被染成分粉色外，其他组织结构均被染成深蓝色即可，而后进入步骤c；
步骤c：进行肥大细胞染色
将步骤b中在蒸馏水中的组织学切片放入配制好的甲苯胺蓝染色液浸染3-5秒，马上入蒸馏水冲洗多余染液；
此步骤的判定标准：普通光学显微镜下400倍放大观察组织内除肥大细胞细胞质被染成紫红色或蓝紫色、嗜酸性细胞细胞质被染成粉色外，其他组织结构均被染成深蓝色，而后进入步骤d；
步骤d：分色
将步骤c中在蒸馏水中的组织学切片放入95％酒精中浸泡30-60秒，除去多余染料，显微镜下观察分色效果；
此步骤的判定标准：普通光学显微镜下400倍放大观察组织内除嗜酸性细胞细胞质染成粉色、肥大细胞的细胞质被染成紫红色或蓝紫色外，其他组织结构均被染成蓝色或淡蓝色即可；在该步骤中，需要控制在95％酒精中浸泡的时间，在上述时间范围内才能确保上述的结果准确无误；
步骤e：脱水、透明、封片、观察
将步骤d中在95％酒精中进行浸泡分色的组织学切片马上放入无水乙醇中浸泡3-5分钟，然后放入二甲苯中浸泡3-5分钟，取出组织学切片，用中性树脂胶将盖玻片盖在组织上，到此步骤即完成肥大细胞和嗜酸性细胞共显示的组织学切片制备。
将步骤e中完成染色的组织学切片放在普通光学显微镜下400倍放大观察，可见到组织内分布的肥大细胞和嗜酸性细胞。嗜酸性细胞的细胞质染成粉色、肥大细胞的细胞质被染成紫红色或蓝紫色外，其他组织结构均被染成蓝色或淡蓝色。
与现有技术相比，步骤b的嗜酸性细胞染色与常规的嗜酸性细胞的单独染色虽然步骤相同，但本方法的嗜酸性细胞染色是采用发明人经过大量试验后确定的改良瑞氏-吉姆萨染色液，该染色液的浓度和配制方法均不同于常规的嗜酸性细胞单独染色，较传统方法更易于掌握分色时间，对嗜酸性细胞的染色效果更佳。
步骤c的肥大细胞染色与常规的肥大细胞的单独染色步骤上虽然相同，但因为是和嗜酸性细胞同在一个切片上显示，所以本方法的染色液的浓度高于常规的肥大细胞的单独染色，而染色时间较常规的肥大细胞的单独染色短，目的是减少其他组织结构着色过深影响后期的判定。
本方法中的步骤b嗜酸性细胞染色和步骤c肥大细胞染色顺序不能改变，这也是填补现有技术的一大空白之处。
综上所述，本发明的发明人首次提供了一种同时显示肥大细胞与嗜酸性细胞的染色方法，采用甲苯胺蓝染色液和改良瑞氏-吉姆萨染色液相结合的染色方法，在一张组织学切片上同时显示肥大细胞和嗜酸性细胞，解决了分别染色造成着色程度不均一及位置结构差异大的难题，本染色方法的直观性强，而且是在同一个断面上显示。
附图说明
图1为实施例1中大鼠子宫内肥大细胞和嗜酸性细胞共染结果示意灰度图，
图中细箭头为嗜酸性细胞，细胞质染成粉色；粗箭头为肥大细胞，细胞质染成紫红色或蓝紫色，图1的放大倍数为400倍；
图2为实施例2中猪小肠内肥大细胞和嗜酸性细胞共染结果示意灰度图，
图中细箭头为嗜酸性细胞，细胞质染成粉色；粗箭头为肥大细胞，细胞质染成紫红色，图2中的A放大倍数为1000倍，B放大倍数为400倍。
具体实施方式
下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
实施例1大鼠子宫内肥大细胞和嗜酸性细胞共染结果
一种同时显示大鼠子宫内肥大细胞和嗜酸性细胞的染色方法，采用甲苯胺蓝染色液和改良瑞氏-吉姆萨染色液相结合的染色方法，其中所述的甲苯胺蓝染色液每150毫升配制方法如下：
配制A液：将1.0-1.2克甲苯胺蓝放入100毫升的蒸馏水内，使甲苯胺蓝完全溶于蒸馏水中；
配制B液：将0.9-1.0克高锰酸钾放入50毫升的蒸馏水内，使高锰酸钾完全溶于蒸馏水中；
将已经配制好的A液在1000℃电磁炉上煮沸10分钟，再将配制好的B液慢慢滴入A液 中，形成甲苯胺蓝混合染液；将混合染液继续煮沸10分钟，使甲苯胺蓝充分被氧化；将经过煮沸的混合染液用蒸馏水补足使该混合染液的总体积为150毫升，室温下使甲苯胺蓝混合染液自然冷却，过滤后即为甲苯胺蓝染色液；
所述改良瑞氏-吉姆萨染色液中：
瑞氏染色液的配制：将0.2-0.3克Wright’s色素粉剂倒入100毫升的甲醇中，搅拌使Wright’s色素粉剂完全溶解在甲醇液体中，而后将此溶液放入棕色试剂瓶中保存，室温放置30天后可以使用；
吉姆萨染色液的配制：将1.8-2.0克Giemsa’s色素粉剂倒入100毫升的甲醇中，搅拌使Giemsa’s色素完全溶解在甲醇中；另将100毫升的甘油液体在水浴锅内加热，水浴锅温度为58-60℃，加热时间持续120-140分钟，将加热后甘油慢慢加入到上述Giemsa’s色素与甲醇的染液中，将三者充分混匀后再放入37℃恒温箱中保存10-11小时，取出混合液体装入棕色试剂瓶中保存，室温放置48小时后可以使用；
pH6.4的磷酸缓冲液的配制：将6.63克磷酸二氢钾和56.0克磷酸氢二钠粉剂倒入体积为1000毫升的蒸馏水中，搅拌后使磷酸二氢钾和磷酸氢二钠完全溶解在蒸馏水中，检测调整溶液的pH值，并用磷酸二氢钾或磷酸氢二钠调整溶液的pH值为6.4。
所述吉姆萨染色液、瑞氏染色液和pH 6.4的磷酸缓冲液按照体积比为1：5：14。
染色的具体步骤为：
步骤a：将已经制备好厚度为5-8微米大鼠子宫组织石蜡切片脱蜡后复水；
步骤b：将步骤a中在蒸馏水中的子宫组织学切片放入已经配制好的改良的瑞氏-吉姆萨染色液中浸泡染色10-15分钟，用蒸馏水洗去多余染色液；此步骤的判定标准：普通光学显微镜下观察子宫组织内除嗜酸性细胞细胞质被染成粉色外，其他组织结构均被染成蓝色，即完成嗜酸性细胞染色，而后进入步骤c；
步骤c：将步骤b中在蒸馏水中的子宫组织学切片放入配制好的甲苯胺蓝染色液浸染3-5秒，立即入蒸馏水冲洗多余染液；此步骤的判定标准：普通光学显微镜下观察组织内除肥大细胞的细胞质被染成紫红色或蓝紫色、嗜酸性细胞的细胞质被染成粉色外，子宫内的其他组织结构均是深蓝色，即完成肥大细胞染色，而后进入步骤d；
步骤d：分色：将步骤c中在蒸馏水中的组织学切片放入95％酒精中浸泡30-60秒，除去多余染料，显微镜下观察分色效果；此步骤的判定标准：普通光学显微镜下观察子宫组织内除嗜酸性细胞细胞质染成粉色、肥大细胞细胞质被染成紫红色或蓝紫色外，其他组织结构均被染成蓝色或淡蓝色即完成分色；
步骤e：脱水、透明、封片、观察
将步骤d中在95％酒精中进行浸泡分色的组织学切片里立即放入无水乙醇中浸泡3-5分钟，然后放入二甲苯中浸泡3-5分钟，取出子宫组织学切片，用中性树脂胶将盖玻片盖在组织上，到此步骤即完成肥大细胞和嗜酸性细胞共显示的组织学切片制备。
将步骤e中完成染色的子宫组织学切片放在普通光学显微镜下观察，可见到组织内分布的肥大细胞和嗜酸性细胞：嗜酸性细胞的细胞质被染成粉色、肥大细胞的细胞质被染成紫红色或蓝紫色外，其他组织结构均被染成蓝色或淡蓝色(如图1所示)。
实施例2猪小肠内肥大细胞和嗜酸性细胞共染结果
一种同时显示猪小肠内肥大细胞和嗜酸性细胞的染色方法，采用甲苯胺蓝染色液和改良瑞氏-吉姆萨染色液相结合的染色方法，其中所述的甲苯胺蓝染色液每150毫升配制方法如下：
配制A液：将1.0-1.2克甲苯胺蓝放入100毫升的蒸馏水内，使甲苯胺蓝完全溶于蒸馏水中；
配制B液：将0.9-1.0克高锰酸钾放入50毫升的蒸馏水内，使高锰酸钾完全溶于蒸馏水中；
将已经配制好的A液在1000℃电磁炉上煮沸10分钟，再将配制好的B液慢慢滴入A液中，形成甲苯胺蓝混合染液；将混合染液继续煮沸10分钟，使甲苯胺蓝充分被氧化；将经过煮沸的混合染液用蒸馏水补足使该混合染液的总体积为150毫升，室温下使甲苯胺蓝混合染液自然冷却，过滤后即为甲苯胺蓝染色液；
所述改良瑞氏-吉姆萨染色液中：
瑞氏染色液的配制：将0.2-0.3克Wright’s色素粉剂倒入100毫升的甲醇中，搅拌使Wright’s色素粉剂完全溶解在甲醇液体中，而后将此溶液放入棕色试剂瓶中保存，室温放置30天后可以使用；
吉姆萨染色液的配制：将1.8-2.0克Giemsa’s色素粉剂倒入100毫升的甲醇中，搅拌使Giemsa’s色素完全溶解在甲醇中；另将100毫升的甘油液体在水浴锅内加热，水浴锅温度为58-60℃，加热时间持续120-140分钟，将加热后甘油慢慢加入到上述Giemsa’s色素与甲醇的染液中，将三者充分混匀后再放入37℃恒温箱中保存10-11小时，取出混合液体装入棕色试剂瓶中保存，室温放置48小时后可以使用；
pH6.4的磷酸缓冲液的配制：将6.63克磷酸二氢钾和56.0克磷酸氢二钠粉剂倒入体积为1000毫升的蒸馏水中，搅拌后使磷酸二氢钾和磷酸氢二钠完全溶解在蒸馏水中，检测调整溶液的pH值，并用磷酸二氢钾或磷酸氢二钠调整溶液的pH值为6.4。
所述吉姆萨染色液、瑞氏染色液和pH 6.4的磷酸缓冲液按照体积比为1：5：14。
染色的具体步骤为：
步骤a：将已经制备好厚度为5-8微米猪小肠组织石蜡切片脱蜡后复水；
步骤b：将步骤a中在蒸馏水中的小肠组织学切片放入已经配制好的改良的瑞氏-吉姆萨染色液中浸泡染色10-15分钟，用蒸馏水洗去多余染色液，此步骤的判定标准：普通光学显微镜下观察小肠组织内除嗜酸性细胞细胞质被染成粉色外，其他组织结构均被染成蓝色，即完成嗜酸性细胞染色，而后进入步骤c；
步骤c：将步骤b中在蒸馏水中的小肠组织学切片放入配制好的甲苯胺蓝染色液浸染3-5秒，立即入蒸馏水冲洗多余染液，此步骤的判定标准：普通光学显微镜下观察组织内除肥大细胞的细胞质被染成紫红色、嗜酸性细胞的细胞质被染成粉色外，小肠内的其他组织结构均是深蓝色，即完成肥大细胞染色，而后进入步骤d；
步骤d：分色。将步骤c中在蒸馏水中的组织学切片放入95％酒精中浸泡30-60秒，除去多余染料，显微镜下观察分色效果。此步骤的判定标准：普通光学显微镜下观察小肠组织内除嗜酸性细胞细胞质染成粉色、肥大细胞细胞质被染成紫红色或蓝紫色外，其他组织结构均被染成蓝色或淡蓝色即完成分色；
步骤e：脱水、透明、封片、观察
将步骤d中在95％酒精中进行浸泡分色的组织学切片里立即放入无水乙醇中浸泡3-5分钟，然后放入二甲苯中浸泡3-5分钟，取出小肠组织学切片，用中性树脂胶将盖玻片盖在组织上，到此步骤即完成肥大细胞和嗜酸性细胞共显示的组织学切片制备。
将步骤e中完成染色的小肠组织学切片放在普通光学显微镜下观察，可见到组织内分布的肥大细胞和嗜酸性细胞：嗜酸性细胞的细胞质被染成粉色、肥大细胞的细胞质被染成紫红色，其他组织结构均被染成蓝色或淡蓝色(如图2所示)。
Claims (3)
1.一种同时显示肥大细胞与嗜酸性细胞的染色方法，其特征在于：采用甲苯胺蓝染色液和改良瑞氏-吉姆萨染色液相结合的染色方法，其中所述的甲苯胺蓝染色液每150毫升配制方法如下：
配制A液：将1.0-1.2克甲苯胺蓝放入100毫升的蒸馏水内，使甲苯胺蓝完全溶于蒸馏水中；
配制B液：将0.9-1.0克高锰酸钾放入50毫升的蒸馏水内，使高锰酸钾完全溶于蒸馏水中；
将已经配制好的A液在1000℃电磁炉上煮沸10分钟，再将配制好的B液慢慢滴入A液中，形成甲苯胺蓝混合染液；将混合染液继续煮沸10分钟，使甲苯胺蓝充分被氧化；将经过煮沸的混合染液用蒸馏水补足使该混合染液的总体积为150毫升，室温下使甲苯胺蓝混合染液自然冷却，过滤后即为甲苯胺蓝染色液；
所述改良瑞氏-吉姆萨染色液配制包括瑞氏染色液的配制和吉姆萨染色液的配置，以及pH 6.4的磷酸缓冲液的配制，具体配制方法如下：
瑞氏染色液的配制：将0.2-0.3克Wright’s色素粉剂倒入100毫升的甲醇中，搅拌使Wright’s色素粉剂完全溶解在甲醇液体中，而后将此溶液放入棕色试剂瓶中保存，室温放置30天后可以使用；
吉姆萨染色液的配制：将1.8-2.0克Giemsa’s色素粉剂倒入100毫升的甲醇中，搅拌使Giemsa’s色素完全溶解在甲醇中；另将100毫升的甘油液体在水浴锅内加热，水浴锅温度为58-60℃，加热时间持续120-140分钟，将加热后甘油慢慢加入到上述Giemsa’s色素与甲醇的染液中，将三者充分混匀后再放入37℃恒温箱中保存10-11小时，取出混合液体装入棕色试剂瓶中保存，室温放置48小时后可以使用；
pH6.4的磷酸缓冲液的配制：将6.63克磷酸二氢钾和56.0克磷酸氢二钠粉剂倒入体积为1000毫升的蒸馏水中，搅拌后使磷酸二氢钾和磷酸氢二钠完全溶解在蒸馏水中，检测溶液的pH值，并用磷酸二氢钾或磷酸氢二钠调整溶液的pH值为6.4。
2.根据权利要求1所述的同时显示肥大细胞与嗜酸性细胞的染色方法，其特征在于：吉姆萨染色液、瑞氏染色液和pH 6.4的磷酸缓冲液按照体积比为1：5：14。
3.根据权利要求1所述的同时显示肥大细胞与嗜酸性细胞的染色方法，其特征在于：染色的具体步骤为：
步骤a：石蜡组织学切片脱蜡后复水；
步骤b：嗜酸性细胞染色；
步骤c：肥大细胞染色；
步骤d：分色；
步骤e：脱水、透明、封片、观察；
其中步骤b：嗜酸性细胞染色时使用改良瑞氏-吉姆萨染色液；步骤c：肥大细胞染色使用甲苯胺蓝染色液染色。
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