CN107505181A - 一种血细胞染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于血细胞染色技术领域，公开了一种血细胞染色方法，包括制备染色液、制备染色缓冲液、染色等步骤；其中，每升染色缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，甘油5～10ml，质量分数30％的双氧水5～10μL，蒸馏水定容至1L。本发明的方法对瑞氏染色法使用的染色缓冲液进行改进，在传统缓冲液的基础上加入了双氧水，利用双氧水的氧化作用，促进天青的生成，从而使配制好的染色缓冲液与染色液混合后，只需要放置5～10min即可使用，不影响染色效果，且染色液配制好后只需要放置3d即可与染色缓冲液配合使用，耗时短。
Description
技术领域
本发明属于血细胞染色技术领域，具体涉及一种血细胞染色方法。
背景技术
观察血细胞形态是医学检验过程中的基本手段，如果不对细胞进行染色处理，显微镜下观察到的所有细胞形态相似，难以区分血细胞。因此医学检验过程中常常使用瑞氏染色法、姬姆萨染色法、巴氏染色法或者苏木素-伊红染色法进行血细胞的临床染色检验。
瑞氏染色法是目前最常用且最简单的染色方法。瑞氏试剂中的酸性伊红和碱性美蓝混合而成的中性染料，久置后生成天青，可以对细胞核及细胞浆着色。瑞氏染色法的染色原理既有物理吸附作用，又有化学亲和作用。由于不同细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。比如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，能够与酸性染料伊红结合，被染成粉红色；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，能够与碱性染料美蓝或天青结合，被染成紫蓝色或蓝色。
现有技术中，瑞氏染色法常用磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液作为染液稀释液，但是该缓冲液稀释后染色效果不稳定，容易出现染色不清晰或者染色较浅的缺陷。
发明内容
本发明提供的一种血细胞染色方法，解决了磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液作为稀释液导致的染色效果不稳定，容易出现染色不清晰或者染色较浅的问题。
本发明提供的一种血细胞染色方法，包括以下步骤：
S1，制备染色液
所述染色液由瑞氏色素、甲醇和甘油混合后放置于室温3d，备用，放置期间振摇以促进瑞氏色素的溶解，其中瑞氏色素：甲醇：甘油的比例为1g:60ml:1～2ml；
S2，制备染色缓冲液
每升染色缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，甘油5～10ml，质量分数30％的双氧水5～10μL，蒸馏水定容至1L；
S3，染色
利用S2的染色缓冲液对S1的染色液进行稀释，稀释混匀后静置5～10min，混匀，得到稀释染色液，将稀释染色液直接滴加到预先制备好的血膜上，并覆盖整个血膜，3～5min后流水冲洗血膜，干燥，完成对血细胞的快速染色，用显微镜观察染色结果即可。
优选的，上述血细胞染色方法，所述血膜按照以下方法制备而成：
S31，将抗凝血滴加在载玻片上，推动推片使血液在载玻片上展开，制成具有血片的血涂片；
S32，血涂片的血片晾干后在血片上滴加并覆盖磷酸盐缓冲液，5min后流水冲洗，晾干得到具有血膜的血涂片；其中每升磷酸盐缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，蒸馏水定容至1L。
优选的，上述血细胞染色方法，将1滴抗凝血滴加到载玻片上，将推片与载玻片呈30～45度角，平推推片使血液沿推片边缘在载玻片上展开，制成具有血片的血涂片。
优选的，上述血细胞染色方法，S31中，将2滴抗凝血滴加到载玻片上，用推片的一角接触到血滴上，旋转推片并逐渐降低推片与载玻片所呈的角度，使血滴变为直径0.75～0.85cm的血片，制成具有血片的血涂片。
优选的，上述血细胞染色方法，S2中，每升染色缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，甘油5ml，质量分数30％的双氧水5μL，蒸馏水定容至1L。
与现有技术相比，本发明提供的一种血细胞染色方法具有以下有益效果：
(1)本发明的方法对瑞氏染色法使用的染色缓冲液进行改进，在传统缓冲液的基础上加入了双氧水，利用双氧水的氧化作用，促进天青的生成，从而使配制好的染色缓冲液与染色液混合后，只需要放置5～10min即可使用，不影响染色效果，且染色液配制好后只需要放置3d即可与染色缓冲液配合使用，耗时短。
(2)我们还对血膜的制备方法进行了改进，在制备具有血膜的血涂片时，滴加磷酸盐缓冲液，发现实施例1制备的染色液、染色缓冲液和血膜只需要5min即可完成染色，且染色效果良好，滴加磷酸盐缓冲液有利于缩短染色时间，节约时间成本。
(3)制备染色液和染色缓冲液时，添加甘油，防止甲醇和双氧水的挥发，增加二者的储藏时间。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
实施例1
一种血细胞染色方法，包括以下步骤：
S1，制备染色液
所述染色液由瑞氏色素、甲醇和甘油混合后放置于室温3d，备用，放置期间振摇以促进瑞氏色素的溶解，其中瑞氏色素：甲醇：甘油的比例为1g:60ml:1ml；
S2，制备染色缓冲液
每升染色缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，甘油5ml，质量分数30％的双氧水5μL，蒸馏水定容至1L，备用；
S3，染色
利用S2的染色缓冲液对S1的染色液进行稀释，稀释混匀后静置5min，混匀，得到稀释染色液，将稀释染色液直接滴加到预先制备好的血膜上，并覆盖整个血膜，3min后流水冲洗血膜，干燥，完成对血细胞的快速染色，用显微镜观察染色结果即可。
所述血膜按照以下方法制备而成：
S31，将抗凝血滴加在载玻片上，推动推片使血液在载玻片上展开，制成具有血片的血涂片；
其中，具体操作为：将1滴抗凝血滴加到载玻片上，将推片(另外的干净的载玻片)与载玻片呈30～45度角，平推推片使血液沿推片边缘在载玻片上展开，制成具有血片的血涂片。
S32，血涂片的血片晾干后在血片上滴加并覆盖磷酸盐缓冲液，5min后流水冲洗，晾干得到具有血膜的血涂片；其中每升磷酸盐缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，蒸馏水定容至1L。
实施例2
一种血细胞染色方法，包括以下步骤：
S1，制备染色液
所述染色液由瑞氏色素、甲醇和甘油混合后放置于室温3d，备用，放置期间振摇以促进瑞氏色素的溶解，其中瑞氏色素：甲醇：甘油的比例为1g:60ml:2ml；
S2，制备染色缓冲液
每升染色缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，甘油10ml，质量分数30％的双氧水10μL，蒸馏水定容至1L，备用；
S3，染色
利用S2的染色缓冲液对S1的染色液进行稀释，稀释混匀后静置5min，混匀，得到稀释染色液，将稀释染色液直接滴加到预先制备好的血膜上，并覆盖整个血膜，5min后流水冲洗血膜，干燥，完成对血细胞的快速染色，用显微镜观察染色结果即可。
所述血膜按照以下方法制备而成：
S31，将抗凝血滴加在载玻片上，推动推片使血液在载玻片上展开，制成具有血片的血涂片；
其中，具体操作为：将2滴抗凝血滴加到载玻片上，用推片的一角接触到血滴上，旋转推片并逐渐降低推片与载玻片所呈的角度，使血滴变为直径0.75～0.85cm的血片，制成具有血片的血涂片。
S32，血涂片的血片晾干后在血片上滴加并覆盖磷酸盐缓冲液，5min后流水冲洗，晾干得到具有血膜的血涂片；其中每升磷酸盐缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，蒸馏水定容至1L。
实施例3
一种血细胞染色方法，包括以下步骤：
S1，制备染色液
所述染色液由瑞氏色素、甲醇和甘油混合后放置于室温3d，备用，放置期间振摇以促进瑞氏色素的溶解，其中瑞氏色素：甲醇：甘油的比例为1g:60ml:1.5ml；
S2，制备染色缓冲液
每升染色缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，甘油7.5ml，质量分数30％的双氧水7.5μL，蒸馏水定容至1L，备用；
S3，染色
利用S2的染色缓冲液对S1的染色液进行稀释，稀释混匀后静置8min，得到稀释染色液，将稀释染色液直接滴加到预先制备好的血膜上，并覆盖整个血膜，4min后流水冲洗血膜，干燥，完成对血细胞的快速染色，用显微镜观察染色结果即可。
所述血膜按照以下方法制备而成：
S31，将抗凝血滴加在载玻片上，推动推片使血液在载玻片上展开，制成具有血片的血涂片；
S32，血涂片的血片晾干后在血片上滴加并覆盖磷酸盐缓冲液，5min后流水冲洗，晾干得到具有血膜的血涂片；其中每升磷酸盐缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，蒸馏水定容至1L。
本发明对瑞氏染色法使用的染色缓冲液进行改进，以实施例1～3制备的染色缓冲液为实验组，分别分组为实施例1组、实施例2组、实施例3组，均对实施例1制备的染色液稀释3倍并放置5min后使用；以不添加甘油和双氧水的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液(配方为：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，蒸馏水定容至1L)作为对照组，并对实施例1制备的染色液稀释3倍并放置5min后备用；利用上述稀释后的染色液和对实施例1方法制备的血膜进行染色实验，结果如表1所示。
表1结果表明使用实施例1～3的染色缓冲液稀释染色液后，5～20min染色时间内均不影响染色结果，细胞染色情况良好，细胞核清晰可辨，细胞层次清晰可辨；而对照组仅在染色10min时染色效果良好，染色时间过长或者过短均影响染色结果，染色结果不稳定。
另外，我们将实施例1制备的染色液放置一周和三个月后，再次利用磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液(配方为：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，蒸馏水定容至1L)进行稀释和对实施例1方法制备的100个血膜进行染色实验。结果发现放置三个月后，5min染色时间下，97％的血膜染色良好，细胞核染色清晰可辨，细胞层次清晰可辨；放置一周后，5min染色时间下，80％的血膜染色良好，细胞核染色清晰可辨，细胞层次清晰可辨。
我们在传统缓冲液的基础上加入了甘油和双氧水，利用双氧水的氧化作用，促进天青的生成，从而使配制好的染色缓冲液与染色液混合后，只需要放置5～10min即可使用，100％的血膜染色良好，且染色液配制好后只需要放置3d即可与染色缓冲液配合使用，耗时短；而传统的染色液新配制后需要至少放置一周后才能与磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液使用，且染色效果不稳定，放置三个月后才能得到较佳较稳定的染色效果。
表1不同缓冲液稀释染色液后的染色结果
我们还对血膜的制备方法进行了改进，在制备具有血膜的血涂片时，滴加磷酸盐缓冲液(每升磷酸盐缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，蒸馏水定容至1L)，发现实施例1制备的染色液、染色缓冲液和血膜只需要5min即可完成染色，且染色效果良好；而同样采用实施例1的染色液、染色缓冲液，仅在制备具有血膜的血涂片时，不滴加磷酸盐缓冲液，则需要25min才能观察到清晰可辨的染色结果。说明在制备具有血膜的血涂片时，滴加磷酸盐缓冲液有利于缩短染色时间，节约时间成本。
需要说明的是，本发明权利要求书及说明书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例1～3，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.一种血细胞染色方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，制备染色液
所述染色液由瑞氏色素、甲醇和甘油混合后放置于室温3d，备用，放置期间振摇以促进瑞氏色素的溶解，其中瑞氏色素：甲醇：甘油的比例为1g:60ml:1～2ml；
S2，制备染色缓冲液
每升染色缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，甘油5～10ml，质量分数30％的双氧水5～10μL，蒸馏水定容至1L；
S3，染色
利用S2的染色缓冲液对S1的染色液进行稀释，稀释混匀后静置5～10min，混匀，得到稀释染色液，将稀释染色液直接滴加到预先制备好的血膜上，并覆盖整个血膜，3～5min后流水冲洗血膜，干燥，完成对血细胞的快速染色，用显微镜观察染色结果即可。
2.根据权利要求1所述的血细胞染色方法，其特征在于，所述血膜按照以下方法制备而成：
S31，将抗凝血滴加在载玻片上，推动推片使血液在载玻片上展开，制成具有血片的血涂片；
S32，血涂片的血片晾干后在血片上滴加并覆盖磷酸盐缓冲液，5min后流水冲洗，晾干得到具有血膜的血涂片；其中每升磷酸盐缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，蒸馏水定容至1L。
3.根据权利要求2所述的血细胞染色方法，其特征在于，S31中，将1滴抗凝血滴加到载玻片上，将推片与载玻片呈30～45度角，平推推片使血液沿推片边缘在载玻片上展开，制成具有血片的血涂片。
4.根据权利要求2所述的血细胞染色方法，其特征在于，S31中，将2滴抗凝血滴加到载玻片上，用推片的一角接触到血滴上，旋转推片并逐渐降低推片与载玻片所呈的角度，使血滴变为直径0.75～0.85cm的血片，制成具有血片的血涂片。
5.根据权利要求2所述的血细胞染色方法，其特征在于，S2中，每升染色缓冲液由以下组分混合后制成：磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，甘油5ml，质量分数30％的双氧水5μL，蒸馏水定容至1L。
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