CN108760444A

CN108760444A - 用于组织纤维的染色试剂盒及染色方法

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Publication number: CN108760444A
Application number: CN201810863914.9A
Authority: CN
Inventors: 李立科; 蒋小龙; 陈其云
Original assignee: Mike Biological Ltd By Share Ltd
Current assignee: Mike Biological Ltd By Share Ltd
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2018-11-06

Abstract

本申请公开了一种染色试剂盒及其对结缔组织染色的染色方法。所述染色试剂盒包括：Weigert铁苏木素染色液，其包含A液和B液，其中A液为苏木精溶液，B液为三氯化铁‑盐酸溶液；红色复合染色液，所述红色复合染色液为包含丽春红、酸性品红和比布列西猩红的混合红色染料的醋酸水溶液；磷钼酸水溶液；和蓝色染色液，所述蓝色染色液为甲基蓝醋酸水溶液，其中，所述红色复合染色液中，丽春红的浓度为4.0‑16.5M，酸性品红的浓度为1.5‑10.0M，比布列西猩红的浓度为5.0‑13.0M，前提是所述丽春红和所述酸性品红的摩尔浓度比为1.5‑3.0。经本发明染色试剂盒染色的结缔组织，红色部分染色清晰度比常规的三色染液有显著的提升，对比度高，易于精确观察。

Description

用于组织纤维的染色试剂盒及染色方法

技术领域

本发明涉及病理特殊染色领域，特别涉及结缔组织的染色。

背景技术

结缔组织由细胞和大量细胞外间质构成，在体内广泛分布，具有连接、支持、营养和保护等多种功能，因而具有重要意义和功能。一般意义上的结缔组织仅指固有结缔组织，包括疏松结缔组织、致密结缔组织、网状组织和脂肪组织。大量的间充质中包括多种纤维，主要有胶原纤维、网状纤维和弹性纤维。这三种纤维广泛分布于身体各处，常见于器官与器官之间，组织与组织之间以及细胞与细胞之间。

常规的苏木精-伊红(HE)染色不能对结缔组织的各种纤维进行区分染色，因而在病理诊断上常常需要借助于特殊染色进行鉴别。不同的染料和不同纤维之间的作用机制是不同的。例如，网状纤维对银离子有选择亲和性，可用银离子吸附后还原为黑色的金属银而染色；胶原纤维可以通过HE染色而呈现红色；弹力纤维可通过Verhoeff铁苏木素染色而呈现黑色，细胞核为蓝色，而胶原纤维呈红色。用于结缔组织染色的常用方法有多色染色，例如Van Gieson(V.G.)染色可使胶原纤维呈现红色、肌纤维呈黄色、细胞核为蓝黑色或灰色；Mallory三色染色法可使胶原纤维为蓝色、神经胶质纤维、肌纤维和酸性颗粒为红色，髓鞘为红色或桔红色；Masson(马松)三色染色可使胶原纤维为绿色或蓝色、肌纤维为红色、细胞核为灰蓝色或灰黑色。

常规的Masson三色染色法是依次采用Weigert铁苏木素或Regaud苏木素、Masson复合染色液(通常包括酸性品红，为了使红色鲜艳还可加入丽春红)以及亮绿或苯胺蓝三种染色液进行染色。具体方法是用Weigert铁苏木素或Regaud苏木素对经复水处理好的切片进行染色5-10分钟，水洗(过染的情况下也可用盐酸酒精分化处理)后用Masson复合染色液染色5-10分钟，然后用约1％磷钼酸溶液分化处理3-5分钟，最后用苯胺蓝或亮绿染色液进行染色约5分钟，最后用冰醋酸水溶液洗涤，脱水、透明化后用中性树胶封片保存。

Masson染色条件要求苛刻，对于包含不同类型的细胞和纤维的组织，特别是病理组织，需要能更为鲜明地区分不同细胞和纤维的染色试剂盒和染色方法。特别是常规Masson三色染色法对肾小球内免疫复合物及肾脏内胶原纤维增生等病理组织染色浅淡，使基底膜、系膜、胶原纤维及胞质、红细胞颜色对比不够鲜艳。此外，由于红色染色不够鲜艳导致红色肌纤维、胞质与蓝色胶原纤维之间不易区分，对比度差。

发明内容

因此，本发明的第一方面的目的是提供一种对结缔组织，特别是包含肿瘤病变的组织能更加有效染色的Masson三色染色试剂盒。

为此，本发明提供了一种染色试剂盒，包括以下试剂：

Weigert铁苏木素染色液，其包含A液和B液，其中A液为苏木精溶液，B液为三氯化铁-盐酸溶液；

红色复合染色液，所述红色复合染色液为包含丽春红、酸性品红和比布列西猩红的混合红色染料的醋酸水溶液；

磷钼酸水溶液；和

蓝色染色液，所述蓝色染色液为甲基蓝醋酸水溶液，

其中，所述红色复合染色液中，丽春红的浓度可为4.0-16.5M，酸性品红的浓度可为1.5-10.0M，比布列西猩红的浓度可为5.0-13.0M，前提是所述丽春红和所述酸性品红的摩尔浓度比为1.5-3.0。

优选地，所述丽春红和所述酸性品红的摩尔浓度比为1.8-2.9，例如可为1.8，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9等。

本发明人发现，尽管在传统的红色染色液中加入一定浓度的比布列西猩红能够显著改善肌纤维的红的鲜艳度，从而增加染色的对比度，但是丽春红和酸性品红的浓度需保持在一定的比例范围内，否则会导致染色过浅或易被蓝色染料侵染而变为紫红色从而降低不同颜色区域的对比度。

根据一种实施方式，所述红色复合染色液中，丽春红的浓度可为8.3-16.5M，酸性品红的浓度可为5.0-10.0M，比布列西猩红的浓度可为10.5-12.5M。

根据优选的实施方式，丽春红的浓度约为14.5M，酸性品红的浓度约为5.0M，比布列西猩红的浓度约为10.5M。

所述红色复合染色液通常为醋酸水溶液，其中醋酸浓度为18-22g/L，优选为20g/L。

此外，本发明人进一步发现，当红色染料的总浓度与甲基蓝的浓度处于一定范围内时，红色和蓝色染料之间基本没有相互侵染的情况，红色和蓝色均能保持各自鲜艳的色泽，从而获得最佳的对比度。

因此，根据一种优选的实施方式，所述红色复合染色液中混合红色染料的总浓度与所述蓝色染色液中甲基蓝的摩尔浓度比约为(8-15):(9-11)。

最优选的实施方式中，所述红色复合染色液中混合红色染料的总浓度与所述蓝色染色液中甲基蓝的摩尔浓度比约为1.2:1。

根据一种实施方式，所述蓝色染色液中甲基蓝的浓度为18.5-31.0M，优选为22.0-28.0M，最优选25.0M。

同样的，所述蓝色染色液通常为醋酸水溶液，其中醋酸浓度为18-22g/L，优选为20g/L。

根据一种实施方式，所述Weigert铁苏木素染色液中，A液包含20-40g/L的苏木精，100-200mL/L的乙二醇和650-850mL/L的乙醇；B液包含60-100mL/L的29wt％三氯化铁和8-12mL/L的HCl。

优选地，所述Weigert铁苏木素染色液中A液进一步包含50-150mL/L的甘油。

更优选地，所述Weigert铁苏木素染色液中，A液由30g/L的苏木精，150mL/L的乙二醇，100mL/L的甘油和750mL/L的乙醇组成；B液由80mL/L的29wt％三氯化铁和10mL/L的HCl组成。

根据一种实施方式，所述磷钼酸水溶液中磷钼酸的浓度为8-12g/L。

根据优选的实施方式，所述试剂盒进一步包括1％盐酸酒精溶液。

本发明的试剂盒还可包含其他必要的辅助试剂，例如醋酸水溶液、95％乙醇水溶液、无水乙醇、二甲苯等。

根据本发明较为优选的实施方式，本发明的染色试剂盒，包括以下试剂：

Weigert铁苏木素染色液，其包含A液和B液，其中A液包含20-40g/L的苏木精，100-200mL/L的乙二醇和650-850mL/L的乙醇；B液包含60-100mL/L的29wt％三氯化铁和8-12mL/L的HCl；

红色复合染色液，所述红色复合染色液为由丽春红、酸性品红和比布列西猩红组成的混合红色染料的醋酸水溶液；

8-12g/L的磷钼酸水溶液；和

含22.0-28.0M甲基蓝的醋酸水溶液，

其中，所述红色复合染色液中，丽春红的浓度可为8.3-16.5M，酸性品红的浓度可为5.0-10.0M，比布列西猩红的浓度可为10.5-12.5M，醋酸浓度为18-22g/L，前提是所述丽春红和所述酸性品红的摩尔浓度比为1.8-2.9，

且所述红色复合染色液中混合红色染料的总浓度与所述蓝色染色液中甲基蓝的摩尔浓度比约为(8-15):(9-11)。

根据本发明更优选的实施方式，本发明的染色试剂盒，包括以下试剂：

红色复合染色液，所述红色复合染色液中，丽春红的浓度约为14.5M，酸性品红的浓度约为5.0M，比布列西猩红的浓度约为10.5M，醋酸浓度为20g/L；

8-12g/L的磷钼酸水溶液；和

含25.0甲基蓝的醋酸水溶液，其中醋酸浓度为20g/L。

本发明第二发明的目的是提供一种使用本发明的Masson染色试剂盒的染色方法。因此，本发明提供一种对结缔组织染色的染色方法，所述方法包括：

提供用于染色的组织切片；

将Weigert铁苏木素染色液的A液和B液等比例混合后，对所述组织切片进行Weigert铁苏木素染色5-10分钟；

流水冲洗后，用红色复合染色液染色5-10分钟，冲洗；

用磷钼酸溶液容易处理约5分钟；

用甲基蓝醋酸水溶液复染5-10分钟，用醋酸水溶液冲洗切片；和

进行脱水、透明并封片。

根据优选的实施方式，用Weigert铁苏木素染色后，用1％盐酸酒精分化数秒。盐水酒精分化能够消除过染色的情况。

根据一种实施方式，提供用于染色的组织切片包括使组织切片脱蜡，和在乙醇梯度溶液中进行复水。脱蜡通常用二甲苯进行，至少在两份二甲苯中分别脱蜡3-5分钟。

所述乙醇梯度溶液是100％乙醇到75％乙醇水溶液中的至少三个不同梯度的乙醇或乙醇水溶液。通常复水采用3-5个乙醇梯度溶液。

根据一种具体实施方式，脱蜡：将组织切片浸于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各3-5分钟；复水：依次将经脱蜡的组织切片浸入100％乙醇Ⅰ、100％乙醇Ⅱ、95％乙醇、85％乙醇和75％乙醇中，各1-3分钟，然后自来水流洗1-2分钟。

如果用Bouin氏液或Zenker氏液固定组织样品，则脱蜡至水后直接染色；如果是用甲醛液固定组织样品，可在切片脱蜡至水后再置于Bouin氏液或Zenker氏液中补充固定2-4小时，流水冲洗直至组织无颜色后再进行后续染色。

本发明的染色方法，可在环境温度下进行。必要时通过镜下控制染色程度。

本发明的Masson染色试剂盒及其染色方法能够获得胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，肌纤维和红细胞呈红色，细胞核呈黑色的染色效果，其中红色部分染色清晰度比常规的三色染液有显著的提升，对比度高，易于精确观察，特别适用于包含肿瘤病变(诸如肾癌、肝癌、食管鳞癌、胃癌、结肠癌等)的组织切片染色。

此外，本发明以甲基蓝替代传统的苯胺蓝，并控制红色染料与蓝色染料的摩尔浓度比例，使得肌纤维的红色部分颜色更鲜明，没有偏蓝紫色的现象，进一步提高了不同组织部分之间的颜色对比。

附图说明

图1分别示出了实施例1(A)、实施例2(B)、实施例3(C)、对比例1(D)、对比例2(E)和对比例3(F)的染色切片的显微照片；

图2分别示出了对比例4(A)和对比例5(B)的染色切片的显微照片；和

图3分别示出了实施例4(A)、实施例5(B)、对比例6(C)和对比例7(D)的染色切片的显微照片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

以下实施例及对比例按以下方法步骤进行。

材料和方法：

获取肾癌临床样本用于制作切片。

将肾癌临床样本石蜡包埋后利用切片机加工成4μm超薄切片。按以下步骤进行染色。

1.脱蜡：将组织切片浸于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各3-5分钟。

2.复水：依次浸入100％乙醇Ⅰ、100％乙醇Ⅱ、95％乙醇、85％乙醇和75％乙醇中，各1-3分钟，然后自来水流洗1～2分钟。

如果组织是用Bouin氏液或Zenker氏液固定，则脱蜡至水后直接染色；如果组织是用甲醛液固定，可在切片脱蜡至水后再置于Bouin氏液或Zenker氏液中补充固定2-4小时，流水冲洗直至组织无颜色后再进行后续染色。以下实施例及对比例中均采用Bouin氏液固定。

3.Weigert铁苏木素染色(Weigert铁苏木素染色液A和B等比例混合，现配现用，不宜预先混合)染色5～10分钟，流水稍洗。

4.1％盐酸酒精分化数秒，流水冲洗数分钟。

5.红色复合染色液染5～10分钟，流水稍冲洗。

6.磷钼酸溶液处理约5分钟，倾去玻片上的磷钼酸，不用水洗。

7.用苯胺蓝醋酸水溶液染色复染3～5分钟，倾去玻片上的染液，不用水洗。

8.用1％冰醋酸水溶液冲洗切片，至切片无蓝色脱出，镜下控制。

9.95％酒精稍洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。

实施例1

各试剂的配制：

按照以下配方配制Weigert铁苏木素A染液：

按照以下配方配制Weigert铁苏木素B染液：

29％三氯化铁 80mL/L

浓盐酸 10mL/L

蒸馏水 910mL/L

按照以下配方用蒸馏水配制红色复合染色液：

配制10g/L的磷钼酸溶液。

按照以下配方用蒸馏水配制甲基蓝溶液：

甲基蓝 25.0M

冰醋酸 20mL/L

按以上“材料与方法”中的步骤进行染色。本实施例染色后的显微照片请见图1(A)。

实施例2-3及对比例1-3

按照实施例1类似的方法进行实施例2-3和对比例1。其中实施例2-3除红色复合染色液外，各试剂的配方不变；对比例1除蓝色染色液采用苯胺蓝外，其他配方与实施例2相同；对比例2和3中的红色复合染色液采用传统配方，仅包含两种红色染料，其他配方与实施例1相同，具体如下。

按照以下配方用蒸馏水配制红色复合染色液和蓝色染色液：

结果请见附图1，其中B为实施例2的显微照片，C为实施例3的显微照片，D为对比例1的显微照片。

由图1可以看出，A-C都显示出鲜明的红蓝对比。经磷钼酸分化后，本发明的红色复合染色液的配方显示出肌纤维、胞质和红细胞仍保持鲜艳的红色，不褪色，且在甲基蓝染色后胶原纤维呈现蓝色，且不干扰肌纤维等染色，从而使得组织各个部分对比清晰，红蓝分明，对比明显，其中B的对比度最好，A相对来说红色偏暗一点。图1(D)虽然采用与实施例2基本相同的染色液配方，但是，采用苯胺蓝作为蓝色染料，可以明显看到蓝色着色增强，颜色艳丽，但是蓝色区域已扩散到红色区域中，并且与红色染料混合，使使肌纤维和胞质呈现为紫红色，降低了红蓝对比度。

此外，在试剂配置过程中，甲基蓝极溶于水，水溶性优于苯胺蓝，在水溶液中更稳定。

图1(E-F)对应对比例2-3，为传统经典Masson三色染色法，其中红色复合染色液中仅包含两种红色染料。从实际染色效果可以看出，肌纤维、胞质和红细胞着色较浅，染色不够鲜艳，色泽偏浅，导致甲基蓝染色后，胞质内的红色转变为紫红色，红蓝对比度差，整体染色效果与本发明的实施例1-3相比较差。其中图E为最为常见的Masson染色配方，其中蓝色鲜明，但是扩散进入到红色染色区域中，且红色部分呈紫红色，红蓝对比度差；图F对应的红色复合染色液中不包含丽春红，其中红色保持不褪色，但是颜色暗淡，蓝色部分也扩散进入红色染色区域，且呈现蓝紫色，红蓝对比度差。

对比例4-5

按照实施例1类似的方法进行对比例4-5。其中除红色复合染色液外，各试剂的配方不变。对比例4中的各红色染料浓度虽均在本发明范围内，但是丽春红和品红的配比低于本发明的范围，实施例5虽然添加了比布列西猩红，但是其浓度低于本发明的范围，具体如下。

按照以下配方用蒸馏水配制红色复合染色液：

结果请见图2。如图2所示，对比例4(A)中，丽春红和品红比例发生变化(1.2:1)，可以看出肌纤维和胞质着色较浅，色泽变淡，红色不够鲜艳，红蓝对比度明显降低；对比例5(B)中，当比布列西猩红浓度低于最优范围时，可以看出肌纤维和胞质着色较浅，被甲基蓝覆盖成为紫红色，色泽暗淡，不够鲜艳，红蓝对比度差。

实施例4-5和对比例6-7

按照实施例1类似的方法进行实施例4-5和对比例6-7。其中除用红色复合染色液和蓝色染色液外，各试剂的配方不变。

按照以下配方用蒸馏水配制红色复合染色液和蓝色染色液：

结果请见图3。实施例4(A)和实施例5(B)在实施例1-3的基础上对红蓝比例进行了调整，发现红蓝比在本发明的范围内，组织着色鲜艳，对比清晰，红蓝区分明显。对比例6(C)可以看出当红色染料和蓝色染料的比例低于红蓝最优比例时，肌纤维和胞质着色较浅，红色染色不够鲜艳，色泽偏浅，导致甲基蓝染色后，红色转变为紫红色，红蓝对比度差。对比例7(D)可以看出当红色染料和蓝色染料的比例高于红蓝最优比例时，胶原纤维着色较浅，色泽变暗，部分胶原纤维被染成红色，影响整体染色效果。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种染色试剂盒，包括以下试剂：

磷钼酸水溶液；和

蓝色染色液，所述蓝色染色液为甲基蓝醋酸水溶液，

其中，所述红色复合染色液中，丽春红的浓度为4.0-16.5M，酸性品红的浓度为1.5-10.0M，比布列西猩红的浓度为5.0-13.0M，前提是所述丽春红和所述酸性品红的摩尔浓度比为1.5-3.0。

2.根据权利要求1所述的染色试剂盒，其中，所述红色复合染色液中混合红色染料的总浓度与所述蓝色染色液中甲基蓝的摩尔浓度比为(8-15):(9-11)，优选为1.2:1。

3.根据权利要求1或2所述的染色试剂盒，其中，所述红色复合染色液中，丽春红的浓度为8.3-16.5M，酸性品红的浓度为5.0-10.0M，比布列西猩红的浓度为10.5-12.5M。

4.根据权利要求1或2所述的染色试剂盒，其中，所述蓝色染色液中甲基蓝的浓度为18.5-31.0M，优选为22.0-28.0M。

5.根据权利要求1或2所述的染色试剂盒，其中，所述Weigert铁苏木素染色液中，A液包含20-40g/L的苏木精，100-200mL/L的乙二醇和650-850mL/L的乙醇；B液包含60-100mL/L的29wt％三氯化铁和8-12mL/L的HCl。

6.根据权利要求1或2所述的染色试剂盒，其中，所述Weigert铁苏木素染色液中A液进一步包含50-150mL/L的甘油。

7.根据权利要求5所述的染色试剂盒，其中，所述磷钼酸水溶液中磷钼酸的浓度为8-12g/L。

8.一种用权利要求1-7中任一项所述的染色试剂盒对结缔组织染色的染色方法，所述方法包括：

提供用于染色的组织切片；

流水冲洗后，用红色复合染色液染色5-10分钟，冲洗；

用磷钼酸溶液处理约5分钟；

进行脱水、透明并封片。

9.根据权利要求8所述的方法，进一步包括在用Weigert铁苏木素染色后，用1％盐酸酒精进行分化。