CN107271233A - 一种组织病理学的组织样本的处理方法 - Google Patents

一种组织病理学的组织样本的处理方法 Download PDF

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孙淼淼
姜国忠
赵志华
杨建萍
吕新全
韦娜
张红新
郑湘予
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Abstract

本发明属于组织病理学样本处理技术领域，公开了一种组织病理学的组织样本的处理方法，包括固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡包埋、切片、染色、封片、观察等步骤。本发明的方法对组织样本处理中切片染色方法进行改进，采用特殊配方的脱蜡液、复水液A、复水液B、复水液C、复水液D、复水液E、染色液A，在不影响染色结果的情况下，脱蜡、复水、染色等步骤的总计时间缩短为55min左右，使用溶液种类减少，步骤简化，减少人为误差，减少染色试剂的使用时间，效果显著。

Description

一种组织病理学的组织样本的处理方法
技术领域
本发明属于组织病理学样本处理技术领域，具体涉及一种组织病理学的组织样本的处理方法。
背景技术
组织病理学的组织样本的处理方法通常是将组织样本置于特定的化学试剂中，是组织样本的组织结构发生一定变化，便于观察组织病理特征。比如尸体解剖中涉及的石蜡渗透保存处理样本方法，该方法是将组织样本包埋在石蜡中，经固定、脱水、清洗、渗透等步骤。石蜡包埋染色制片是当前处理组织样本的基本技术，也是病理诊断方法学的基础。
现有组织样本处理技术需要经过处理包埋、切片、染色、封片等诸多步骤，包埋步骤通常是将离体组织样本从样品盒中取出，加入诸如固体石蜡包埋材料的模具中，得到包埋组织；切片步骤是将包埋组织置于切片机中切片，切片需要2-25微米厚的片；染色步骤是将得到的切片用特殊的染色剂染色处理，以便于镜下观察；封片步骤则是保护染色好的组织样本，防止污染，以便观察。
然而，上述过程包括诸多细节步骤，步骤繁琐且耗时长，现有组织样本处理技术人为操作，存在人为污染组织样本的风险；并且过程中需要使用到大量甲醛、二甲苯、氯化汞等挥发性有毒试剂，长期接触容易损害技术人员身体健康。
发明内容
本发明提供的一种组织病理学的组织样本的处理方法，解决了现有处理方法步骤繁琐且耗时长，存在人为污染组织样本的风险，也解决了长期接触挥发性有毒试剂带来的损害技术人员身体健康的问题。
本发明提供的一种组织病理学的组织样本的处理方法，包括以下步骤：
步骤1，对离体的组织样本进行固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡包埋、切片操作，得到石蜡组织切片；
步骤2，染色
步骤2.1，采用脱蜡液对石蜡组织切片浸泡脱蜡10min，得到脱蜡切片；其中，脱蜡液由以下重量份的组分混合后制成：D-柠檬烯58-60份、甲基环己烷40-42份；
步骤2.2，依次用复水液A、复水液B、复水液C、复水液D、复水液E浸泡处理，然后用复水液F冲洗处理3min，得到复水切片；
其中，复水液A由二甲苯和无水乙醇按照1:1的体积比例混合而成，复水液A浸泡时间为5min；复水液B、复水液C、复水液D、复水液E依次是体积分数95％乙醇、70％乙醇、45％乙醇、30％乙醇，且复水液B、复水液C、复水液D、复水液E的溶剂均为0.01mol/L的柠檬酸钠溶液；复水液B-复水液E的浸泡时间均为3min；复水液F是ddH2O；
步骤2.3，依次用染色液A浸泡复水切片3-5min，水冲洗15-20s，盐酸-乙醇溶液冲洗1-2s，水冲洗2-3s，饱和碳酸锂溶液冲洗15-20s，水冲洗直至切片变色，染色液B浸泡3-5min，水冲洗2-3s，复水液D冲洗5-10s、复水液C冲洗5-10s、复水液B冲洗5-10s，无水乙醇脱水，二甲苯透明，得到透明切片；
所述染色液A由以下重量份的组分混合而成：苏木精1份、硫酸铝钾15份、无水乙醇10份、氯化汞0.5份、氯化钠0.5-0.9份、去离子水200份；使用时每100ml染色液A加入5ml冰醋酸；
所述染色液B是将1g伊红溶解入100ml 95％乙醇中制备而成，使用时每100ml染色液A加入50μL冰醋酸；
步骤3，采用中性树脂对染色切片进行封片，完成对组织样本的处理。
优选的，上述组织病理学的组织样本的处理方法，所述脱蜡液由以下重量份的组分混合后制成：D-柠檬烯58份、甲基环己烷42份。
优选的，上述组织病理学的组织样本的处理方法，所述盐酸-乙醇溶液由0.5mL盐酸和99mL 75％酒精混合而成。
优选的，上述组织病理学的组织样本的处理方法，所述染色液A由以下重量份的组分混合而成：苏木精1份、硫酸铝钾15份、无水乙醇10份、氯化汞0.5份、氯化钠0.5份、去离子水200份。
优选的，上述组织病理学的组织样本的处理方法，所述染色液A按以下方法制备：先用去离子水加热溶解硫酸铝钾、氯化钠，得硫酸铝钾溶液，用无水乙醇溶解苏木精，得苏木精溶液；然后将硫酸铝钾溶液和苏木精溶液混合，煮沸1min，冷却20-30s，加入氯化汞，加热搅拌直至颜色变为紫红色，滤纸过滤后，每100ml染色液A加入5ml冰醋酸，备用。
与现有技术相比，本发明提供的一种组织病理学的组织样本的处理方法具有以下有益效果：
(1)本发明的方法对组织样本处理中切片染色方法进行改进，采用特殊配方的脱蜡液、复水液A、复水液B、复水液C、复水液D、复水液E、染色液A，这些特殊配方的溶液与其他步骤组合使用，构成了一个简单完整的方案，在不影响染色结果的情况下，脱蜡、复水、染色等步骤的总计时间缩短为55min左右，使用溶液种类减少，步骤简化，减少人为误差，减少染色试剂的使用时间，效果显著。
(2)对比实验结果表明本发明脱蜡液配方可减少脱蜡时间，染色液A配方可减少染色时间，但是均不影响切片结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
一种组织病理学的组织样本的处理方法，包括以下步骤：
步骤1，取离体的组织样本，按照常规方法对离体的组织样本进行固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡包埋、切片，得到石蜡组织切片，厚度5微米；
步骤2，染色
步骤2.1，采用脱蜡液对石蜡组织切片浸泡脱蜡10min，得到脱蜡切片；其中，脱蜡液由以下重量份的组分混合后制成：D-柠檬烯58份、甲基环己烷42份。
步骤2.2，依次用复水液A、复水液B、复水液C、复水液D、复水液E浸泡处理，然后用复水液F冲洗处理3min，得到复水切片；
其中复水液A由二甲苯和无水乙醇按照1:1的体积比例混合而成，复水液A浸泡时间为5min；复水液B、复水液C、复水液D、复水液E依次是体积分数95％乙醇、70％乙醇、45％乙醇、30％乙醇，且复水液B、复水液C、复水液D、复水液E的溶剂均为0.01mol/L的柠檬酸钠溶液；复水液B-复水液F的浸泡时间均为3min，复水液F是ddH2O。
步骤2.3，依次用染色液A浸泡复水切片3min，水冲洗15s，盐酸-乙醇溶液(0.5mL浓盐酸+99mL 75％酒精)冲洗2s，水冲洗2s，饱和碳酸锂溶液冲洗15s，水冲洗直至切片变色，染色液B浸泡3min，水冲洗2s，复水液D冲洗5s、复水液C冲洗5s、复水液B冲洗5s，无水乙醇脱水10min，二甲苯透明10min，得到透明切片；
所述染色液A由以下重量份的组分混合而成：苏木精1份、硫酸铝钾15份、无水乙醇10份、氯化汞0.5份、氯化钠0.5份、去离子水200份；使用时每100ml染色液A加入5ml冰醋酸。先用去离子水加热溶解硫酸铝钾、氯化钠，得硫酸铝钾溶液，用无水乙醇溶解苏木精，得苏木精溶液；然后将硫酸铝钾溶液和苏木精溶液混合，煮沸1min，冷却30s，加入氯化汞，加热搅拌直至颜色变为紫红色，滤纸过滤后，每100ml染色液A加入5ml冰醋酸，备用。
所述染色液B是将1g伊红溶解入100ml 95％乙醇中制备而成，使用时每100ml染色液A加入50μL冰醋酸。
步骤3，按常规方法采用中性树脂对染色切片进行封片，完成对组织样本的处理，观察。
实施例2
一种组织病理学的组织样本的处理方法，包括以下步骤：
步骤1，取离体的组织样本，按照常规方法对离体的组织样本进行固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡包埋、切片，得到石蜡组织切片，厚度10微米；
步骤2，染色
步骤2.1，采用脱蜡液对石蜡组织切片浸泡脱蜡10min，得到脱蜡切片；其中，脱蜡液由以下重量份的组分混合后制成：D-柠檬烯60份、甲基环己烷40份。
步骤2.2，依次用复水液A、复水液B、复水液C、复水液D、复水液E浸泡处理，然后用复水液F冲洗处理3min，得到复水切片；
其中复水液A由二甲苯和无水乙醇按照1:1的体积比例混合而成，复水液A浸泡时间为5min；复水液B、复水液C、复水液D、复水液E依次是体积分数95％乙醇、70％乙醇、45％乙醇、30％乙醇，且复水液B、复水液C、复水液D、复水液E的溶剂均为0.01mol/L的柠檬酸钠溶液；复水液B-复水液F的浸泡时间均为3min，复水液F是ddH2O。
步骤2.3，依次用染色液A浸泡复水切片4min，水冲洗20s，盐酸-乙醇溶液(0.5mL浓盐酸+99mL 75％酒精)冲洗1s，水冲洗3s，饱和碳酸锂溶液冲洗20s，水冲洗直至切片变色，染色液B浸泡5min，水冲洗3s，复水液D冲洗10s、复水液C冲洗10s、复水液B冲洗10s，无水乙醇脱水10min，二甲苯透明10min，得到透明切片；
所述染色液A由以下重量份的组分混合而成：苏木精1份、硫酸铝钾15份、无水乙醇10份、氯化汞0.5份、氯化钠0.9份、去离子水200份；使用时每100ml染色液A加入5ml冰醋酸。先用去离子水加热溶解硫酸铝钾、氯化钠，得硫酸铝钾溶液，用无水乙醇溶解苏木精，得苏木精溶液；然后将硫酸铝钾溶液和苏木精溶液混合，煮沸1min，冷却20s，加入氯化汞，加热搅拌直至颜色变为紫红色，滤纸过滤后，每100ml染色液A加入5ml冰醋酸，备用。
所述染色液B是将1g伊红溶解入100ml 95％乙醇中制备而成，使用时每100ml染色液A加入50μL冰醋酸。
步骤3，按常规方法采用中性树脂对染色切片进行封片，完成对组织样本的处理，观察。
实施例3
一种组织病理学的组织样本的处理方法，包括以下步骤：
步骤1，取离体的组织样本，按照常规方法对离体的组织样本进行固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡包埋、切片，得到石蜡组织切片，厚度6微米；
步骤2，染色
步骤2.1，采用脱蜡液对石蜡组织切片浸泡脱蜡10min，得到脱蜡切片；其中，脱蜡液由以下重量份的组分混合后制成：D-柠檬烯59份、甲基环己烷41份。
步骤2.2，依次用复水液A、复水液B、复水液C、复水液D、复水液E浸泡处理，然后用复水液F冲洗处理3min，得到复水切片；
其中复水液A由二甲苯和无水乙醇按照1:1的体积比例混合而成，复水液A浸泡时间为5min；复水液B、复水液C、复水液D、复水液E依次是体积分数95％乙醇、70％乙醇、45％乙醇、30％乙醇，且复水液B、复水液C、复水液D、复水液E的溶剂均为0.01mol/L的柠檬酸钠溶液；复水液B-复水液F的浸泡时间均为3min，复水液F是ddH2O。
步骤2.3，依次用染色液A浸泡复水切片3min，水冲洗18s，盐酸-乙醇溶液(0.5mL浓盐酸+99mL 75％酒精)冲洗1s，水冲洗3s，饱和碳酸锂溶液冲洗18s，水冲洗直至切片变色，染色液B浸泡4min，水冲洗3s，复水液D冲洗8s、复水液C冲洗8s、复水液B冲洗8s，无水乙醇脱水10min，二甲苯透明5min，得到透明切片；
所述染色液A由以下重量份的组分混合而成：苏木精1份、硫酸铝钾15份、无水乙醇10份、氯化汞0.5份、氯化钠0.7份、去离子水200份；使用时每100ml染色液A加入5ml冰醋酸。先用去离子水加热溶解硫酸铝钾、氯化钠，得硫酸铝钾溶液，用无水乙醇溶解苏木精，得苏木精溶液；然后将硫酸铝钾溶液和苏木精溶液混合，煮沸1min，冷却25s，加入氯化汞，加热搅拌直至颜色变为紫红色，滤纸过滤后，每100ml染色液A加入5ml冰醋酸，备用。
所述染色液B是将1g伊红溶解入100ml 95％乙醇中制备而成，使用时每100ml染色液A加入50μL冰醋酸。
步骤3，按常规方法采用中性树脂对染色切片进行封片，完成对组织样本的处理，观察。
传统的组织样本助理方法包括对离体的组织样本进行固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡包埋、切片、染色、封片、观察等步骤，其中染色步骤中，采用二甲苯脱蜡30min左右，梯度乙醇复水时，采用1/2二甲苯-1/2乙醇、100％乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、ddH2O依次复水，总计耗时50min左右；采用苏木精染色、水冲洗、盐酸-乙醇溶液冲洗、梯度乙醇冲洗，伊红染色、梯度乙醇溶液冲洗、无水乙醇脱水、二甲苯透明等步骤总计耗时40min左右。《动物石蜡切片5中染色方法的比较》(金建丽，黑龙江畜牧兽医，2017(03上)：162-163，296-297)中述及的方法也耗时很长。染色步骤耗费的大量时间，步骤繁琐，容易带来人为误差，且染色试剂的使用，容易损害人体健康。
本发明的方法对组织样本处理中切片染色方法进行改进，采用特殊配方的脱蜡液、复水液A、复水液B、复水液C、复水液D、复水液E、染色液A，在不影响染色结果的情况下，脱蜡、复水、染色等步骤的总计时间缩短为55min左右，使用溶液种类减少，步骤简化，减少人为误差，减少染色试剂的使用时间，效果显著。
下面以小鼠小肠组织为样本，实施例1-3的方法与《动物石蜡切片5中染色方法的比较》(金建丽，黑龙江畜牧兽医，2017(03上)：162-163，296-297)中的方法2(作为对照一组)进行对比，观察染色效果。
另外，我们还设置了对照二组和对照三组，对照二组的方法基本上与实施例1相同，只是将脱蜡液改为二甲苯(传统脱蜡液)；将所述染色液A的配方改为传统染色液配方：由以下重量份的组分混合而成：苏木精1份、硫酸铝钾15份、无水乙醇10份、氯化汞0.5份、去离子水200份；使用时每100ml染色液A加入5ml冰醋酸。
对照三组的方法基本上与实施例1相同，只是将所述染色液A的配方改为传统染色液配方：由以下重量份的组分混合而成：苏木精1份、硫酸铝钾15份、无水乙醇10份、氯化汞0.5份、去离子水200份；使用时每100ml染色液A加入5ml冰醋酸。
实验结果如表1所示。表1结果表明实施例1-3的方法不但缩短时间，而且不影响染色结果。对照一组染色效果同实施例1，但是其耗时长。对照二组的染色效果不佳，是因为二甲苯脱蜡时间不足，传统染色液染色时间不足，导致组织切片内石蜡影响观察结果。对照三组的染色过浅，是因为传统染色液染色时间不足，导致组织切片染色过浅。
表1不同方法染色结果
方法 染色过浅现象 细胞结构辨识 细胞层次
实施例1 否 能 清晰
实施例2 否 能 清晰
实施例3 否 能 清晰
对照一组 否 能 清晰
对照二组 是 不能 不清晰
对照三组 否 部分清晰 部分清晰
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种组织病理学的组织样本的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，对离体的组织样本进行固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡包埋、切片操作，得到石蜡组织切片；
步骤2，染色
步骤2.1，采用脱蜡液对石蜡组织切片浸泡脱蜡10min，得到脱蜡切片；其中，脱蜡液由以下重量份的组分混合后制成：D-柠檬烯58-60份、甲基环己烷40-42份；
步骤2.2，依次用复水液A、复水液B、复水液C、复水液D、复水液E浸泡处理，然后用复水液F冲洗处理3min，得到复水切片；
其中，复水液A由二甲苯和无水乙醇按照1:1的体积比例混合而成，复水液A浸泡时间为5min；复水液B、复水液C、复水液D、复水液E依次是体积分数95％乙醇、70％乙醇、45％乙醇、30％乙醇，且复水液B、复水液C、复水液D、复水液E的溶剂均为0.01mol/L的柠檬酸钠溶液；复水液B-复水液E的浸泡时间均为3min；复水液F是ddH2O；
步骤2.3，依次用染色液A浸泡复水切片3-5min，水冲洗15-20s，盐酸-乙醇溶液冲洗1-2s，水冲洗2-3s，饱和碳酸锂溶液冲洗15-20s，水冲洗直至切片变色，染色液B浸泡3-5min，水冲洗2-3s，复水液D冲洗5-10s、复水液C冲洗5-10s、复水液B冲洗5-10s，无水乙醇脱水，二甲苯透明，得到透明切片；
所述染色液A由以下重量份的组分混合而成：苏木精1份、硫酸铝钾15份、无水乙醇10份、氯化汞0.5份、氯化钠0.5-0.9份、去离子水200份；使用时每100ml染色液A加入5ml冰醋酸；
所述染色液B是将1g伊红溶解入100ml 95％乙醇中制备而成，使用时每100ml染色液A加入50μL冰醋酸；
步骤3，采用中性树脂对染色切片进行封片，完成对组织样本的处理。
2.根据权利要求1所述的组织病理学的组织样本的处理方法，其特征在于，所述脱蜡液由以下重量份的组分混合后制成：D-柠檬烯58份、甲基环己烷42份。
3.根据权利要1所述的组织病理学的组织样本的处理方法，其特征在于，所述盐酸-乙醇溶液由0.5mL盐酸和99mL 75％酒精混合而成。
4.根据权利要求1所述的组织病理学的组织样本的处理方法，其特征在于，所述染色液A由以下重量份的组分混合而成：苏木精1份、硫酸铝钾15份、无水乙醇10份、氯化汞0.5份、氯化钠0.5份、去离子水200份。
5.根据权利要求1所述的组织病理学的组织样本的处理方法，其特征在于，所述染色液A按以下方法制备：先用去离子水加热溶解硫酸铝钾、氯化钠，得硫酸铝钾溶液，用无水乙醇溶解苏木精，得苏木精溶液；然后将硫酸铝钾溶液和苏木精溶液混合，煮沸1min，冷却20-30s，加入氯化汞，加热搅拌直至颜色变为紫红色，滤纸过滤后，每100ml染色液A加入5ml冰醋酸，备用。
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