CN108918235A - 一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，属于测试用样品制备技术领域。将离体标本浸泡于固定液中进行软脂处理，再进行增强脂肪细胞通透性处理后，采用消化液35‑39℃恒温处理2‑6小时；所述软脂处理是指标本于室温下在固定液中浸泡2‑24小时，固定液包括甲醛、卵磷脂、无水乙醇和丙酮，各组分在固定液中的浓度分别为：甲醛50~150ml/L，卵磷脂30~70g/L，无水乙醇200~300 ml/L，丙酮200~300ml/L。将本申请应用于肿瘤淋巴结离体标本处理，有效提高了淋巴结检出数目和精确淋巴结转移阳性率。

Description

一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法

技术领域

本申请涉及一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，属于测试用样品制备技术领域。

背景技术

现有肿瘤淋巴结清扫离体组织标本通常是在福尔马林固定液中浸泡，这主要由于甲醛可以长时间并且很好的保存组织形态学结构特征，同时又具有良好的经济效用。此类标本处理方法虽然可以很好的固定组织的形态，但也使含有脂肪组织的标本变硬，在病理科取材特别是淋巴结取材时大大增加了难度。肿瘤淋巴结清扫离体组织标本中，彻底地淋巴结取材对肿瘤诊断分期、制定治疗方案及判断预后至关重要，而常规的固定液和现有的标本固定方法都无法满足在快速固定的同时提高淋巴结的取材速度和检出率，使得病理医生在长期的离体脂肪组织中手摸刀切式寻找淋巴结的方法存在取材不充分、操作时间长等诸多弊端，并最终影响病人的治疗方案、预后和转归。为解决现有肿瘤淋巴结清扫离体组织标本处理技术中存在的问题，临床实际工作中急需软化或者溶解脂肪的同时充分暴露和固定淋巴结、保持淋巴结组织结构和细胞形态完整的方法。

基于此，做出本申请。

发明内容

针对现有淋巴结检出技术所存在的上述缺陷，本申请提供一种全新的胃肠癌新鲜组织标本淋巴结的清扫方法，在软化乳化溶解脂肪的同时固定淋巴结，保证淋巴结结构的完整和最佳染色效果。

为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：

一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，将离体标本浸泡于固定液中进行前固定处理，再进行增强脂肪细胞通透性处理后，采用消化液35-39℃恒温处理2-6小时；所述前固定处理是指标本于室温下在固定液中浸泡2-24小时，固定液包括甲醛、卵磷脂、无水乙醇和丙酮，各组分在固定液中的浓度分别为：甲醛50～150ml/L，卵磷脂30～70g/L，无水乙醇200～300ml/L，丙酮200～300ml/L。

进一步的，作为优选：

所述增强脂肪细胞通透性处理是指：室温条件下，先将前固定处理后的组织标本置于HCl/PBS溶液处理10-120min，再转入NaOH/PBS溶液中处理10-120min。更优选的，所述的HCl/PBS溶液浓度为0.05N-0.2N，NaOH/PBS溶液度为0.05N-0.2N。

所述的消化液包括以下浓度的各组分：蛋白酶K 0.1-2mg/ml，胰蛋白酶1-100mg/ml，EDTA0.1-2mg/ml。

所述固定液还包括有去氧胆酸、甲醇和PBS溶液，去氧胆酸在固定液中的浓度为30～70g/L，甲醇在固定液中的浓度为200-300ml/L，所述PBS溶液添加至固定液中其浓度为100-200ml/L。更优选的，所述固定液是由以下浓度比的各组分构成：甲醛100ml/L，卵磷脂50g/L，无水乙醇250ml/L，丙酮250ml/L，去氧胆酸47.5g/L，甲醇250ml/L，PBS浓度1×。

所述固定液还包括有去氧胆酸、甲醇、PBS溶液和美兰，去氧胆酸在固定液中的浓度为30～70g/L，甲醇在固定液中的浓度为200-300ml/L，PBS溶液添加至固定液中其浓度为100-200ml/L，美兰在固定液中的浓度为0.05-0.15g/L。更优选的，所述固定液是由以下浓度比的各组分构成：甲醛100ml/L，卵磷脂50g/L，无水乙醇250ml/L，丙酮250ml/L，去氧胆酸47.5g/L，甲醇250ml/L，PBS浓度1×，美兰0.1g/L。

上述PBS溶液，是将pbs粉末加入蒸馏水中搅拌溶解，浓度为70mmol/L，形成7×PBS溶液，再将其与其他组分混合稀释至适宜倍数(如1×)。

标本经消化液处理后，将其切取淋巴结，脱水、包埋、切片染色直接操作；如无法及时取材，可将其重新浸泡于上述固定液中或中性福尔马林固定液中作为待取样。

将上述方法应用于肿瘤淋巴结离体标本的固定处理，其优点主要体现为：

(1)本申请所提供的固定处理方法，处理对象为手术切除肿瘤淋巴结组织标本，固定液用来前固定标本，使组织得以充分固定的同时，保护脂肪结构。

(2)脂肪细胞通透性处理中，以HCl/PBS溶液和NaOH/PBS溶液作为处理液，提高脂肪细胞的通透性，使消化液更容易进入脂肪细胞，以发挥软化脂肪的作用，而淋巴结则因其表面存在致密结缔组织被膜固定保护而不受影响或影响轻微。

(3)组织标本先经过固定液的固定，再以消化液处理可软化及液化的脂肪，已达到加大脂肪组织和淋巴结之间的软硬度差，方便淋巴结取材，提高了工作效率和工作质量，也减少了病理科医生的解剖取材时间，为后期病理学科的室外质量控制提供了可能。

(4)本申请使用软脂固定液对淋巴结及多种组织标本的固定效果与常规福尔马林进行保存固定的效果相当，提高了淋巴结的检出数目，精确淋巴结转移阳性率，商品化后在临床广泛推广应用中的作用尤其突出。

附图说明

图1为本申请中固定液处理后的脂肪状态图；

图2为本申请中HCl/PBS处理后的脂肪状态图；

图3为本申请中NaOH/PBS处理后的脂肪状态图；

图4为本申请中消化液处理后的脂肪状态图；

图5为本申请中不同留置方式处理后的脂肪状态图；

图6为本申请处理方法对淋巴结结构的影响对照图；

图7-14为实施例5中样例1条件下的处理效果对照图；

图15-19为实施例5中样例2条件下的处理效果对照图；

图20、21为实施例5中样例3条件下的处理效果对照图；

图22、23、24为实施例5中样例4条件下的处理效果对照图；

图25、26、27为实施例5中样例5条件下的处理效果对照图；

图28-35为实施例5中样例6条件下的处理效果对照图；

图36-43为实施例5中样例7条件下的处理效果对照图；

图44-49为实施例5中样例8条件下的处理效果对照图；

图50-54为实施例5中样例9条件下的处理效果对照图。

具体实施方式

实施例1：不同构成的软脂固定液

本申请所提供的软脂固定液的核心作用成分主要是甲醛、卵磷脂、无水乙醇和丙酮，在不同实施环境下，还可以额外增加去氧胆酸、甲醇、PBS溶液和美兰中的任一种或多种，具体成分选择方式可参见表1所示。

表1不同组成的软脂固定液

我们分别对核心构成成分的软脂固定液(即表1中的序号1)以及补充成分进行测试，可以得到上述16种情况，相同组分采用相同浓度对同样的样品做平行试验，结果表明：核心构成成分的软脂固定液不论是对脂肪组织还是器官组织(如甲状腺组织、乳腺组织、肺组织)或者结肠组织，都具有很好的固定效果，淋巴结得到良好暴露；但补充成分的作用也不容忽视，如采用表1中序号2所提供方案时，去氧胆酸与核心构成成分的配合下，脂肪的消化效果较好，该趋势在序号1与序号2、序号3与序号6、序号8与序号12以及序号14与序号16的对比中有同样体现；序号3所提供的方案中，甲醇与无水乙醇起到协同的作用，配合其他核心构成成分，溶出效率更高，该趋势在序号1与序号3、序号4与序号8、序号6与序号7以及序号15与序号16的对比中有同样体现；序号4所提供的方案中，PBS溶液与核心构成成分的配合下，脂肪的溶出与软化效果更加均匀，该趋势在序号1与序号4、序号13与序号16；序号5所提供的方案中，与核心构成成分的配合下，在后续染色处理中可以更加快速的显色，该特性在序号1与序号5、序号6与序号13、序号12与序号16的对比中也有同样体现。

因此，基于不同的固定目的和处理要求，可以选择上述不同构成的软脂固定液进行软脂(溶脂)处理。

我们还对固定液中核心构成成分(甲醛、卵磷脂、无水乙醇、丙酮)与补充成分(去氧胆酸、甲醇、PBS溶液、美兰)的浓度进行了实验，结果表明在软脂固定液中，甲醛的浓度适宜控制在50-150ml/L、卵磷脂的浓度适宜控制在30-70g/L、无水乙醇的浓度适宜控制在200-300ml/L、丙酮的浓度适宜控制在200-300ml/L，在这种情况下，四种核心作用成分可以很好的发挥协同与配合作用，达到溶解或软化脂肪的效果，低于或者超出上述范围则会对溶脂效果造成一定的干扰和不利影响；当进行补充成分的添加时，可保持上述四种核心作用成分添加量不变或者在上述范围内适当调整，补充成分的添加不宜过大，否则很容易造成固定液失衡，影响软化与溶解效果，因此，去氧胆酸在固定液中的浓度为30～70g/L，甲醇在固定液中的浓度为200-300ml/L，PBS溶液在固定液中的浓度为1×，美兰在固定液中的浓度为0.05-0.15g/L，且这四种补充成分可同时添加，也可选择任一种或任几种分别添加。

实施例2：相同组成不同浓度的软脂固定液

本实施例给出了全构成(即包含了全部的核心构成成分与全部补充成分)的软脂固定液组成与浓度，并将具有代表性的几组罗列如表2所示：

表2不同浓度的软脂固定液

应用表2各序号所对应的软脂固定液处理经预处理的手术切除网膜标本4小时，再进行淋巴结取材、脱水、包埋、切片、染色、免疫组化，镜下观察，结果表明：上述各浓度均可不同程度的对样本实现溶解，脂肪柔软液化，淋巴结得到有效暴露，淋巴结细胞形态保存完整，无变形，免疫组化效果良好，特别是采用表2中序号9-12所提供方案进行软脂实验时，其溶脂效果显著，固定效果好，脂肪柔软液化，淋巴结暴露明显，淋巴结细胞形态保存完整，无变形，免疫组化效果良好。

实施例3：不同组成的消化液构成

本申请所提供的消化液的核心作用成分是消化酶，主要成分为蛋白酶K、胰蛋白酶和EDTA，在不同实施环境下，还可以选用PBS或Tris-HCl的一种作为缓冲液，还可以加CaCl₂稳定酶活性，具体成分选择方式可参见表3所示。

表3不同组成的消化液

我们分别对核心构成成分的消化液(即表3中的序号1)以及补充成分进行测试，可以得到上述8种情况，相同组分采用相同浓度对同样的样品做平行试验，结果表明：核心构成成分的主要作用是破坏脂肪细胞膜，增加脂肪细胞膜的通脱性。但补充成分的作用也不容忽视，缓冲液用于缓冲和维持反应体系的pH值及盐离子浓度；CaCl₂提供稳定酶活性所需双价阳离子。

本申请所提供的消化液具消化和液化脂肪等作用的混合液，用于依次经“软脂固定液”固定、酸和碱处理过肿瘤淋巴结根治标本，能进入脂肪细胞发挥消化脂肪作用，可软化及液化经“软脂固定液”固定处理的标本，而淋巴结因表面致密结缔组织被膜固定保护而不受影响或影响轻微。从而达到加大脂肪组织和淋巴结软硬度差，方便淋巴结取材，提高工作效率和工作质量的目的。因此，基于不同的消化目的和处理要求，可以选择上述不同构成的消化液进行消化处理。

我们还对消化液中核心构成成分(蛋白酶K、胰蛋白酶和EDTA)与补充成分的浓度进行了实验，结果表明在消化液中，蛋白酶K 0.1-2mg/ml，胰蛋白酶1-100mg/ml，EDTA0.1-2mg/ml，在这种情况下，三种核心作用成分可以很好的发挥协同与配合作用，达到理想的软脂同时保证淋巴结结构的效果，低于或者超出上述范围则会对软脂不充分或者破坏淋巴结结构；当进行补充成分的添加时，可保持上述三种核心作用成分添加量不变或者在上述范围内适当调整，补充成分的添加不宜过大，否则很容易造成固定液失衡，影响软化与溶解效果，因此，缓冲液PBS、TRis-HCl浓度分别控制为1×和50mM CaCl2的浓度为1-10mM(优选1mM)。

实施例4：固定处理效果对照

本例中一种手术切除肿瘤淋巴结根治组织标本的固定处理方法，取胃癌根治手术切除的新鲜脂肪组织及淋巴结，一式六份，依次经过如下处理：(1)固定液在室温下处理3小时，固定液是由以下浓度比的各组分构成：甲醛100ml/L，卵磷脂50g/L，无水乙醇250ml/L，丙酮250ml/L，去氧胆酸47.5g/L，甲醇250ml/L，PBS溶液1×，美兰0.1g/L；(2)以0.1N HCl/PBS溶液室温处理1小时；(3)0.1N NaOH/PBS溶液室温处理1小时；(4)消化液处理，25mg胰蛋白酶-1％EDTA/ml+蛋白酶K，37℃水浴4小时，并分别以0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml的蛋白酶K对六份样品进行平行试验，对上述处理各阶段的效果进行观察。

在步骤(1)处理后的各组织标本仍然较硬，参见图1所示；步骤(2)处理后的各组织标本无明显改变，六份相互之间也没有差别，参见图2所示；步骤(3)处理后的各组织标本无明显改变，六份相互之间也没有差别，参见图3所示；步骤(4)处理后的组织标本，No.1和No.4两个样品的脂肪组织明显变软变薄，脂肪组织与淋巴结的硬度差显著，易于识别取材，其他样品软化程度不明显，参见图4所示。

将上述四个步骤处理后的样品分别进行留置处理：置于本申请固定液中的样本仍然效果较好，但由于No.2和No.3的蛋白酶K浓度不足，No.1和No.4的留置效果较No.2和No.3为0.25mg/ml的留置效果好，而采用福尔马林固定液留置的No.5和No.6效果较差，具体参见图5所示。

切取上述No.1方法得到的淋巴结组织，结果如图6所示，可以看出：经本方法处理淋巴结组织结构完整，细胞形态正常，免疫组化蛋白表达定位清楚，染色清晰。

其中，上述消化液的制备方法如下：称取1gEDTA粉末溶于PBS中，在配置时适当加入几滴NaOH至pH为8，搅拌均匀至溶液为100ml，配置成1％的EDTA母液。分别称取2.5g胰蛋白酶和50mg蛋白酶K，溶解于90ml PBS溶液中，滴入1mlEDTA母液，滴加PBS至溶液总量100ml。

固定液由以下步骤制备：称取PBS粉末和15ml蒸馏水混合均匀，得到7×PBS溶液，然后依次加入无水乙醇，甲醇，丙酮，甲醛，卵磷脂，去氧胆酸，美兰，定容至100ml，搅拌至混合均匀。

实施例5：不同处理方法对照实验

样例1

常规福尔马林固定后脂肪组织(见图7)→弃固定液，PBS冲洗后，0.25N盐酸常温浸泡1小时(见图8，未见明显变化)→弃盐酸，PBS冲洗后2N NaOH常温浸泡1小时(见图9，均未见明显变化)→弃2N NaOH，PBS冲洗后不同消化液37℃恒温浸泡(蛋白酶K 10mg/ml；蛋白酶K 10mg/ml+胰酶25mg/ml+EDTA1％；蛋白酶K 5mg/ml+胰酶25mg/ml+EDTA1％；蛋白酶K 1mg/ml+胰酶25mg/ml+EDTA1％，自左向右依次形成样一、样二、样三、样四)，每隔一小时进行观察(见图10，1h脂肪组织松软液化；见图11，2h脂肪组织松软液化；见图12，3h后样一脂肪溶解样二样三脂肪进一步软化，样四则仍然处于松软液化状态；见图13，4h后样一脂肪明显溶解，样二、样三、样四则组织部分溶解)→弃消化液，溶脂固定剂浸泡8小时(见图14，全部组织均溶解)。

样例2

固定、酸碱前处理同样例1→弃2N NaOH，PBS冲洗后以不同方式浸泡(常温固定液；37℃，蛋白酶K 1mg/ml；37℃，蛋白酶K 0.5mg/ml+胰酶25mg/ml+EDTA1％；37℃，蛋白酶K0.25mg/ml+胰酶25mg/ml+EDTA1％；37℃，蛋白酶K 0.125mg/ml+胰酶25mg/ml+EDTA1％，自左向右依次形成样一、样二、样三、样四、样五)，每隔一小时进行观察(见图15，1h未见明显变化；见图16，2h后，样二、样三组织稍显疏松，其余组未见明显改变；见图17，3h后样一未见明显改变，样二、三、四与两小时时相比更软化，样五未见明显改变；见图18，4h后样二组织部分溶解，样一、三、四与两小时时相比更软化，样五未见明显改变)→弃消化液，溶脂固定剂浸泡8小时(见图19，左边为样一、样四，右边为样二，样二消化四小时组织液化)。

样例3

固定、酸碱前处理同样例1→弃2N NaOH，PBS冲洗后1mg/ml蛋白酶K 37℃恒温浸泡，pH不同(pH依次为6、7、8、9，自左向右依次形成样一、样二、样三、样四，3h后组织略软，6-9之间PH值无显著影响，见图20)→弃消化液，溶脂固定剂浸泡8小时(见图21，脂肪溶解效果不佳)。

样例4

固定、酸碱前处理同样例1→0.5mg/ml蛋白酶K+1％EDTA 37℃恒温浸泡，加不同浓度胰蛋白酶(胰蛋白酶浓度依次为12.5mg/ml、12.5mg/ml、1.25mg/ml、1.25mg/ml，自左向右依次形成样一、样二、样三、样四，每小时观察一下：1h后，见图22组织较硬，未见明显变化；2h后，见图23脂肪疏松)→弃消化液，溶脂固定剂浸泡8小时(见图24，脂肪变硬，效果不良)。

样例5

固定、酸碱前处理同样例1→1mg/ml蛋白酶K+1％EDTA 37℃恒温浸泡，加不同浓度胰蛋白酶(胰蛋白酶浓度依次为25mg/ml、25mg/ml、2.5mg/ml、2.5mg/ml，自左向右依次形成样一、样二、样三、样四，每小时观察一下：1h后，见图25未见明显变化；2h后，见图26脂肪疏松)→弃消化液，溶脂固定剂室温浸泡8小时(见图27，脂肪变硬，效果不良)。

样例6

新鲜脂肪组织分为四个样(见图28，自左向右依次为样一、样二、样三、样四)→样一、样二以固定液室温浸泡3h，样三、样四以Formalin室温浸泡3h(见图29，四个脂肪均变硬)→样一、样三0.25N HCl室温处理，样二、样四不处理(见图30，硬度：样二>样四>样一>样三，脂肪硬韧韧，颗粒明显)→不同浓度NaOH处理(见图31，样一、样三与样二、样四相比，无明显差异)→样一、样三采用37℃水浴1mg/ml蛋白酶k+25mg/ml胰蛋白酶-EDTA处理，样二、样四采用2N NaOH处理(6h后，见图32，样一、样三无明显差别，均变软，样二、样四仍硬)→样二、样四采用37℃水浴1mg/ml蛋白酶k+25mg/ml胰蛋白酶-EDTA处理，样一、样三不处理(9h后，见图33，样一、样二脂肪软化效果优于样三、样四，样一与样二、样三与样四无差别)→样一、样三采用溶脂固定液处理，样二、样四不处理(10h后，见图34，与9h时无明显差别)→样二、样四采用溶脂固定液处理，样一、样三不处理(8h后，见图35，固定4h效果优于3h，同等时间下溶脂固定液效果优于Formalin)。

样例7

新鲜取材标本分为四个样(见图36，自左向右依次为样一、样二、样三、样四)→溶脂固定液室温浸泡3h(见图37，组织硬)→样一0.25N HCl室温处理，样二2N HCl室温处理，样三、样四不处理(1h后见图38，无明显变化)→样一、样四2N NaOH处理，样二、样三0.25NNaOH处理(见图39，无明显差异)→样一、样二采用37℃水浴1mg/ml蛋白酶k+25mg/ml胰蛋白酶-EDTA处理，样二、样四不处理(1h后，见图40，样一、样二脂肪软化，样三、样四脂肪无明显变化；4h后，见图41，样一、样二脂肪明显软化，纤维组织出现，样二效果最佳，样三、样四软化)→样一、样二溶脂固定液处理，样三样四不处理(5h后，见图42，样一、样二脂肪几乎全部溶解，样三、样四纤维组织出现，样四效果优于样三)→样三、样四采用溶脂固定液处理，样一、样二不处理(见图43，样一、样二、样三、样四均达到预期效果)。

样例8

新鲜取材标本分为十个样(见图44，第一行自左向右依次为样一、样二、样三、样四、样五，第二行自左向右依次为样六、样七、样八、样九、样十)→溶脂固定液室温浸泡4h(见图45，脂肪变硬)→0.1N HCl/PBS常温浸泡1h(见图46，无明显变化)→0.1N NaOH/PBS常温浸泡1h(见图47，无明显差异)→样一、样六酶K 1mg/ml；样二、样七胰酶-EDTA 25mg/ml；样三、样八胰酶-EDTA 12.5mg/ml，酶K 1mg/ml；样四、样九胰酶-EDTA2.5mg/ml，酶K 1mg/ml；样五、样十胰酶-EDTA 25mg/ml，酶K 0.5mg/ml(4h后，见图48，均无明显变化)→溶脂固定液常温浸泡8h(见图49，样一、样六与样二、样七相比，酶K效果优于胰蛋白酶-EDTA；样二、样七与样五、样十比较，酶的联合使用效果佳)。

样例9

标本溶脂固定液常温浸泡3h(见图50，第一行自左向右依次为样一、样二、样三、样四、样五、样六，脂肪变硬)→PBS冲洗后.1N HCl/PBS室温浸泡1小时(见图51，无明显改变)→弃HCl，PBS冲洗后，0.1N NaOH/PBS室温浸泡1小时(见图52，无明显变化)→弃0.1N NaOH，PBS冲洗后，以下条件37℃恒温浸泡3小时，(均含胰酶25mg/ml，EDTA1％)，不同浓度蛋白酶K处理(样一、样四0.5mg/ml，样二、样五0.25mg/ml，样三、样六0.1mg/ml，4h后，见图53，脂肪组织软化)→样一、样二、样三溶脂固定液常温浸泡8h，样四、样五、样六福尔马林常温浸泡8小时(见图54，样一、样四效果好，样二、样三效果较好，样五、样六效果差)。

综上，消化液中各组分浓度较佳构成为：蛋白酶K 0.1-2mg/ml(0.5mg/ml最佳)，胰蛋白酶1-100mg/ml(最佳25mg/ml)，EDTA0.1-2mg/ml(最佳1mg/ml)。

Claims (10)

1.一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于：将离体标本浸泡于固定液中进行固定处理，再进行增强脂肪细胞通透性处理后，采用消化液35-39℃恒温处理2-6小时；所述固定处理是指标本于室温下在固定液中浸泡2-24小时，固定液包括甲醛、卵磷脂、无水乙醇和丙酮，各组分在固定液中的浓度分别为：甲醛50~150ml/L，卵磷脂30~70g/L，无水乙醇200~300 ml/L，丙酮200~300ml/L。

2.如权利要求1所述的一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于，所述增强脂肪细胞通透性处理是指：室温条件下，先将软脂处理后的组织标本置于HCl/PBS溶液处理10-120min，再转入NaOH/PBS溶液中处理10-120min。

3.如权利要求2所述的一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于：所述的HCl/PBS溶液浓度为0.05N-0.2N，NaOH/PBS溶液度为0.05N-0.2N。

4.如权利要求1所述的一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于，所述的消化液包括以下浓度的各组分：蛋白酶K 0.1-2mg/ml，胰蛋白酶1-100mg/ml，EDTA 0.1-2mg/ml。

5.如权利要求1所述的一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于：所述固定液还包括有去氧胆酸、甲醇和PBS溶液，去氧胆酸在固定液中的浓度为30~70g/L，甲醇在固定液中的浓度为200-300ml/L，所述PBS溶液添加至固定液中其浓度为100-200ml/L。

6.如权利要求5所述的一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于，所述固定液是由以下浓度比的各组分构成：甲醛100ml/L，卵磷脂50g/L，无水乙醇250 ml/L，丙酮250ml/L，去氧胆酸47.5g/L，甲醇250ml/L，PBS浓度1×。

7.如权利要求1所述的一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于：所述固定液还包括有去氧胆酸、甲醇、PBS溶液和美兰，去氧胆酸在固定液中的浓度为30~70g/L，甲醇在固定液中的浓度为200-300ml/L，PBS溶液添加至固定液中其浓度为100-200ml/L，美兰在固定液中的浓度为0.05-0.15g/L。

8.如权利要求7所述的一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于，所述固定液是由以下浓度比的各组分构成：甲醛100ml/L，卵磷脂50g/L，无水乙醇250 ml/L，丙酮250ml/L，去氧胆酸47.5g/L，甲醇250ml/L，PBS溶液1×，美兰0.1g/L。

9.如权利要求5-8任一项所述的一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于：所述PBS溶液是由pbs粉末溶于蒸馏水中直接配制而成或者稀释获得。

10.如权利要求1所述的一种肿瘤淋巴结离体标本的固定处理方法，其特征在于：所述标本经消化液处理后，浸泡于所述固定液中或中性福尔马林固定液中作为待取样，或者将其切取淋巴结，脱水、包埋、切片染色直接操作。