CN108645683A - 一种软脂固定液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种软脂固定液及其应用，属于测试用样品制备技术领域。包括甲醛、卵磷脂、无水乙醇、丙酮、去氧胆酸、甲醇，各组分在固定液中的浓度分别为：甲醛50~150ml/L，卵磷脂30~70g/L，无水乙醇200~300 ml/L，丙酮200~300ml/L，去氧胆酸30~70g/L，甲醇200‑300ml/L。将本申请应用于肿瘤淋巴结等的清扫，不仅有效溶解脂肪组织、保证淋巴结及时充分的固定，还确保了淋巴结细胞形态保存完整，无变形，免疫组化效果好，有效提高了淋巴结检出数目和精确淋巴结转移阳性率。
Description
技术领域
本申请涉及一种软脂固定液及其应用，属于测试用样品制备技术领域。
背景技术
现有新鲜离体标本通常是在福尔马林固定液中浸泡，这主要由于甲醛可以长时间并且很好的保存组织形态学结构特征，同时又具有良好的经济效用。此类标本处理方法虽然可以很好的固定组织的形态，但也使含有脂肪组织的标本变硬，在病理科取材特别是淋巴结取材时大大增加了难度。对于胃癌、肠癌、乳腺癌等肿瘤根治术标本中，彻底地淋巴结取材对肿瘤诊断分期、制定治疗方案及判断预后至关重要，而常规的固定液和现有的标本固定方法都无法满足在快速固定的同时提高淋巴结的取材速度和检出率，使得病理医生在长期的离体脂肪组织中手摸刀切式寻找淋巴结的方法存在取材不充分、操作时间长等诸多弊端，并最终影响病人的治疗方案、预后和转归。为解决现有肿瘤根治组织标本处理技术中存在的问题，临床实际工作中急需软化或者溶解脂肪的同时充分暴露和固定淋巴结、保持淋巴结组织结构和细胞形态完整的方法。
基于此，做出本申请。
发明内容
针对现有淋巴结检出技术所存在的上述缺陷，本申请首先提供一种软脂固定液，在软化乳化溶解脂肪的同时固定淋巴结，保证淋巴结结构的完整和最佳染色效果。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：
一种软脂固定液，包括甲醛、卵磷脂、无水乙醇、丙酮、去氧胆酸、甲醇，各组分在固定液中的浓度分别为：甲醛50～150ml/L，卵磷脂30～70g/L，无水乙醇200～300ml/L，丙酮200～300ml/L，去氧胆酸30～70g/L，甲醇200-300ml/L。
进一步的，作为优选：
还包括有PBS溶液，PBS溶液添加至固定液中其浓度为100-200ml/L。更优选的，所述软脂固定液中，甲醛100ml/L，卵磷脂50g/L，去氧胆酸47.5g/L，无水乙醇250ml/L，甲醇250ml/L，丙酮250ml/L，PBS溶液1×。
还包括有PBS溶液和美兰，PBS溶液添加至固定液中其浓度为100-200ml/L，美兰在固定液中的浓度为0.05-0.15g/L。更优选的，所述软脂固定液中，甲醛100ml/L，卵磷脂50g/L，去氧胆酸47.5g/L，无水乙醇250ml/L，甲醇250ml/L，丙酮250ml/L，PBS溶液1×，美兰0.1g/L。
同时本申请还提供了一种具有上述特征软脂固定液的应用方法，取肿瘤淋巴结清扫新鲜组织标本，浸泡于固定液中进行固定处理，再增强脂肪细胞通透性，采用消化液35-39℃恒温处理2-6小时；所述固定处理是指标本于室温下在固定液中浸泡2-24小时，固定液包括甲醛、卵磷脂、无水乙醇、去氧胆酸、丙酮和甲醇，各组分在固定液中的浓度分别为：甲醛50～150ml/L，卵磷脂30～70g/L，无水乙醇200～300ml/L，丙酮200～300ml/L，去氧胆酸30～70g/L，甲醇
200-300ml/L。
进一步的，作为优选：
所述增强脂肪细胞通透性是指先用HCl溶液处理新鲜组织标本5-20min，处理温度为室温；再将其浸泡在胰蛋白酶-EDTA中，浸泡选用35-39℃恒温水浴处理10-20min，其中，HCl溶液浓度为0.005N-0.05N；胰蛋白酶-EDTA构成为：含0.1-2.5％(体积质量比)胰蛋白酶、0.001-0.1％(体积质量比)EDTA，PBS配制。
所述PBS溶液，是将pbs粉末加入蒸馏水中搅拌溶解至适宜浓度，或者采用浓度为70mmol/L(7×PBS溶液)的PBS溶液稀释成适宜浓度。
所述肿瘤淋巴结清扫新鲜组织标本取自脂肪组织、乳腺组织、甲状腺组织、肺组织、结肠组织中的任一种。
将上述软脂固定液处理标本，其优点主要体现为：
(1)本申请所提供的新鲜肿瘤淋巴结清扫组织标本的处理方法，以HCl和胰蛋白酶-EDTA处理，增加脂肪细胞膜通透性。在该方案中，首先通过温和的化学法处理组织，增强脂肪细胞膜通透性，而淋巴结因为表面致密结缔组织被膜的保护，细胞组成成分细胞膜不受影响或影响轻微不足以引起细胞和组织结构的改变。
(2)在增加脂肪细胞膜通透性处理后，以软化乳化脂肪、固定淋巴结等多重作用的固定液进行软脂处理，所选用的固定液具有乳化甚至部分溶解脂肪的作用，可使包裹淋巴结及淋巴结周边的脂肪组织软化，加大淋巴结和脂肪组织的软硬度差别，更容易和方便淋巴结取材，提高工作效率和取材质量。
(3)使用软脂固定液对淋巴结及多种组织标本的固定效果与常规福尔马林进行保存固定的效果相当，提高了淋巴结的检出数目，精确淋巴结转移阳性率，也减少了病理科医生的解剖取材时间，为后期病理学科的室外质量控制提供了可能，商品化后在临床广泛推广应用中的作用尤其突出。
附图说明
图1为本申请所提供软脂固定液处理前后的脂肪组织，其中，A为处理前的新鲜脂肪组织，B为处理后的脂肪；C为转移癌放大40倍，D为微小转移癌放大200倍；
图2为乳腺组织采用本申请所提供软脂固定液(上行)与采用常规中性福尔马林(下行)处理的效果对照图，其中从左至右依次为常规HE染色及CD10、P63和PR免疫组化染色，×200；
图3为甲状腺样本采用本申请所提供软脂固定液(上行)与采用常规中性福尔马林(下行)处理的效果对照图，其中从左至右依次为常规HE染色及TTF-1、CD20和CD3免疫组化染色，×200；
图4为肺组织标本采用本申请所提供软脂固定液(上行)与采用常规中性福尔马林(下行)处理的效果对照图，其中从左至右依次为常规HE染色及CK、P63和TTF-1免疫组化染色，×200；
图5为结肠组织标本采用本申请所提供软脂固定液(上行)与采用常规中性福尔马林(下行)处理的效果对照图，其中从左至右依次为常规HE染色及actin、CK20和S100免疫组化染色，×200。
具体实施方式
实施例1：不同构成的软脂固定液
本申请所提供的软脂固定液的核心作用成分主要是甲醛、卵磷脂、无水乙醇和丙酮，在不同实施环境下，还可以额外增加去氧胆酸、甲醇、PBS溶液和美兰中的任一种或多种，具体成分选择方式可参见表1所示。
表1不同组成的软脂固定液
我们分别对核心构成成分的软脂固定液(即表1中的序号1)以及补充成分进行测试，可以得到上述16种情况，相同组分采用相同浓度对同样的样品做平行试验，结果表明：核心构成成分的软脂固定液不论是对脂肪组织还是器官组织(如甲状腺组织、乳腺组织、肺组织)或者结肠组织，都具有很好的固定效果，淋巴结得到良好暴露；但补充成分的作用也不容忽视，如采用表1中序号2所提供方案时，去氧胆酸与核心构成成分的配合下，脂肪的消化效果较好，该趋势在序号1与序号2、序号3与序号6、序号8与序号12以及序号14与序号16的对比中有同样体现；序号3所提供的方案中，甲醇与无水乙醇起到协同的作用，配合其他核心构成成分，溶出效率更高，该趋势在序号1与序号3、序号4与序号8、序号6与序号7以及序号15与序号16的对比中有同样体现；序号4所提供的方案中，PBS溶液与核心构成成分的配合下，脂肪的溶出与软化效果更加均匀，该趋势在序号1与序号4、序号13与序号16；序号5所提供的方案中，与核心构成成分的配合下，在后续染色处理中可以更加快速的显色，该特性在序号1与序号5、序号6与序号13、序号12与序号16的对比中也有同样体现。
因此，基于不同的固定目的和处理要求，可以选择上述不同构成的软脂固定液进行软脂(溶脂)处理。
我们还对固定液中核心构成成分(甲醛、卵磷脂、无水乙醇、丙酮)与补充成分(去氧胆酸、甲醇、PBS溶液、美兰)的浓度进行了实验，结果表明在软脂固定液中，甲醛的浓度适宜控制在50-150ml/L、卵磷脂的浓度适宜控制在30-70g/L、无水乙醇的浓度适宜控制在200-300ml/L、丙酮的浓度适宜控制在200-300ml/L，在这种情况下，四种核心作用成分可以很好的发挥协同与配合作用，达到溶解或软化脂肪的效果，低于或者超出上述范围则会对溶脂效果造成一定的干扰和不利影响；当进行补充成分的添加时，可保持上述四种核心作用成分添加量不变或者在上述范围内适当调整，补充成分的添加不宜过大，否则很容易造成固定液失衡，影响软化与溶解效果，因此，去氧胆酸在固定液中的浓度为30～70g/L，甲醇在固定液中的浓度为200-300ml/L，PBS溶液在固定液中的浓度为100-200ml/L，美兰在固定液中的浓度为0.05-0.15g/L，且这四种补充成分可同时添加，也可选择任一种或任几种分别添加。
实施例2：相同组成不同浓度的软脂固定液
本实施例给出了全构成(即包含了全部的核心构成成分与全部补充成分)的软脂固定液组成与浓度，并将具有代表性的几组罗列如表2所示：
表2不同浓度的软脂固定液
应用表2各序号所对应的软脂固定液处理经预处理的手术切除网膜标本4小时，再进行淋巴结取材、脱水、包埋、切片、染色、免疫组化，镜下观察，结果表明：上述各浓度均可不同程度的对样本实现溶解，脂肪柔软液化，淋巴结得到有效暴露，淋巴结细胞形态保存完整，无变形，免疫组化效果良好，特别是采用表2中序号9-12所提供方案进行软脂实验时，其溶脂效果显著，固定效果好，脂肪柔软液化，淋巴结暴露明显，淋巴结细胞形态保存完整，无变形，免疫组化效果良好。
常见肿瘤淋巴结清扫新鲜组织标本的对比
以下分别以表2中序号12所提供的软脂固定液作为代表，对不同标本进行软脂固化，并与常规中性福尔马林(10％福尔马林，pH7.2)处理效果进行对比，具体如下：
(1)脂肪组织
取手术切除新鲜脂肪组织小块及淋巴结，一式两份，均采用同样的处理方法。首先用化学法处理，即用0.01N HCl室温下浸泡10min，弃处理液，PBS冲洗后，用0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA 37℃恒温水浴箱浸泡15min。下一步，将标本取出放入脱脂固定液中，随后每隔0.5-1h拍照观察并记录。如图1所示，此为原脂肪组织与脱脂固定液处理6h后的比较，可见采用本申请软脂固定液处理后，脂肪组织明显变软变薄，淋巴结结构完整，转移癌组织及微小转移癌细胞团均清晰可见。
(2)器官组织
取手术切除新鲜乳腺腺组织，首先通过化学法处理，即用0.01N HCl室温下浸泡10min，弃处理液PBS冲洗后，再用0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA 37℃恒温水浴箱浸泡15min。下一步，将标本取出放入脱脂固定液中，6h后依次进行常规取材、脱水、石蜡包埋、切片及染色，结果如图2所示，结果表明：与常规福尔马林固定同标本相比，本法固定液的处理对乳腺组织标本的普通形态学、免疫组化染色均无差别。
取手术中切除新鲜甲状腺腺组织，如上方式处理，结果如图3所示，结果表明：与常规福尔马林固定同标本相比，本法固定液的处理对甲状腺组织标本的普通形态学、免疫组化染色均无差别。
取手术切除新鲜肺组织，如上方式处理，结果如图4所示，结果表明：与常规福尔马林固定同标本相比。本法固定液的处理对肺组织标本的普通形态学、免疫组化染色均无差别。
取手术切除结肠组织，如上方式处理，结果如图5所示，结果表明：与常规福尔马林固定同标本相比。本法固定液的处理对结肠粘膜组织标本的普通形态学、免疫组化染色均无差别。
其中，上述方案中所使用的0.01N HCl由以下步骤制备：质量分数为36.5％的盐酸取1ml滴于蒸馏水中配置成1000ml的HCl溶液。
0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA按如下比例及步骤制备：首先配制1％的质量体积比EDTA母液，称取1gEDTA粉末溶于PBS中，滴加1N NaOH至PH为8，搅拌均匀至溶液为100ml。0.25％胰酶为质量体积比，即称取0.25g胰蛋白酶溶于PBS溶液中混合均匀，加入1mlEDTA母液后加PBS至100ml。
固定液由以下步骤制备：称取PBS粉末和15ml蒸馏水混合均匀，得到7×PBS溶液，然后依次加入无水乙醇，甲醇，丙酮，甲醛，卵磷脂，去氧胆酸，美兰，定容至100ml(此时，PBS溶液为1×，增加离子量，以确保细胞状态不发生变形或受损)，搅拌至混合均匀。
Claims (9)
1.一种软脂固定液，其特征在于，包括甲醛、卵磷脂、无水乙醇、丙酮、去氧胆酸、甲醇，各组分在固定液中的浓度分别为：甲醛50~150ml/L，卵磷脂30~70g/L，无水乙醇200~300ml/L，丙酮200~300ml/L，去氧胆酸30~70g/L，甲醇200-300ml/L。
2.如权利要求1所述的一种软脂固定液，其特征在于：还包括有PBS溶液，所述PBS溶液添加至固定液中其浓度为100-200ml/L。
3.如权利要求2所述的一种软脂固定液，其特征在于：所述软脂固定液中，甲醛100ml/L，卵磷脂50g/L，去氧胆酸47.5g/L，无水乙醇250 ml/L，甲醇250 ml/L，丙酮250ml/L，PBS溶液1×。
4.如权利要求1所述的一种软脂固定液，其特征在于：还包括有PBS溶液和美兰，PBS溶液添加至固定液中其浓度为100-200ml/L，美兰在固定液中的浓度为0.05-0.15g/L。
5.如权利要求4所述的一种软脂固定液，其特征在于：所述软脂固定液中，甲醛100ml/L，卵磷脂50g/L，去氧胆酸47.5g/L，无水乙醇250 ml/L，甲醇250 ml/L，丙酮250ml/L，PBS溶液1×，美兰0. 1g/L。
6.一种软脂固定液应用，其特征在于：取肿瘤淋巴结清扫新鲜组织标本，浸泡于固定液中进行固定处理，再增强脂肪细胞通透性，采用消化液35-39℃恒温处理2-6小时；所述固定处理是指标本于室温下在固定液中浸泡2-24小时，固定液包括甲醛、卵磷脂、无水乙醇、去氧胆酸、丙酮和甲醇，各组分在固定液中的浓度分别为：甲醛50~150ml/L，卵磷脂30~70g/L，无水乙醇200~300 ml/L，丙酮200~300ml/L，去氧胆酸30~70g/L，甲醇200-300ml/L。
7.如权利要求6所述的一种软脂固定液应用，其特征在于：所述增强脂肪细胞通透性是指先以盐酸溶液浸泡，再以胰蛋白酶-EDTA 浸泡，其中，HCl溶液浓度为0.005N-0.05N；胰蛋白酶-EDTA含0.1-2.5%胰蛋白酶、0.001-0.1%EDTA。
8.如权利要求6所述的一种软脂固定液应用，其特征在于：所述PBS溶液是由pbs粉末溶于蒸馏水中直接配制而成或者稀释获得。
9.如权利要求6-8任一项所述的一种软脂固定液应用，其特征在于：所述肿瘤淋巴结清扫新鲜组织标本取自脂肪组织、乳腺组织、甲状腺组织、肺组织、结肠组织中的任一种。
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