JP3834080B2 - 蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤を主成分とする未成熟凝縮染色体生成剤と生成方法 - Google Patents
蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤を主成分とする未成熟凝縮染色体生成剤と生成方法 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は医学、獣医学、動・植物学などの分野において、種々の手段により得られた生細胞より、光学顕微鏡や電子顕微鏡で観察する際の染色体の生成方法に関し、より具体的には海綿から抽出あるいは合成された、オカダ酸などの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤を使用して、未成熟染色体凝縮法により未成熟凝縮染色体を作成する生成剤と生成方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
人間や生物の体の各部分は、それぞれの機能に応じて細胞が種々の状態に配列した組織から構成され、それらの細胞を光学顕微鏡や電子顕微鏡で観察すると、それぞれの細胞は、隣接する同種の細胞や間質腔が境界で区分されて独立した単位として存在し、各細胞の中央部に大きな球状の核があって、その内部には細胞内の塩基性の色素によく染められるクロマチン(染色質)と呼ばれる斑点状のものが散在している。
球状の核の周囲は細胞質と呼ばれ、その内部に多数の球形、楕円形、ヒゲ状などの構造体が存在し、細胞質の主成分は水で、その中にナトリウム、カリウムなどの無機イオンと、有機物としての蛋白質、炭水化物、脂質などを含んでいる。
前記の核も同様に境界で区分された内部にコロイド系があり、染色質や核小体がコロイド系内を浮遊している。
細胞の中には、前記のように核を有するもの(真核細胞)と、核として識別される構造体を有しないもの(前核細胞)とに大別される。
【0003】
人体や生物体を構成する細胞は、例外として、一旦成熟すると二度と分裂しない神経や骨格筋と、通常は分裂しないが、肝臓や腎臓の細胞のように損傷がおきると損傷を埋めるように分裂を開始するものがあり、有糸分裂と呼ばれる方式で分裂し増殖を行う。
有糸分裂では図1に示すように、G1(ギャップ1)期→S期(DNA合成期)→G2(ギャップ2)期→M期(分裂中期)→分裂後期→G1期の順に循環するサイクルを経ながら増殖し分裂を繰り返していく。
第1段階では核内の染色質から染色体ができて、分裂前期(G2期)では染色質のフィラメントが凝縮し、ヒトでは46本の染色体に変わり、同時に核膜も消失する。
染色体は化学的には、DNAと呼ばれる核酸とヒストンと呼ばれる塩基性蛋白質などからなり、娘細胞に正確に分配されることにより、DNAに含まれる遺伝情報が次の世代に伝えられる。
前述した有糸分裂の中期(M期)では、個々の染色体が分割されて細胞の両極に集まり細胞質も中央部がくびれ、M期後期(分裂後期)になると、くびれた部分から分裂して染色体の周りに核膜が形成され、染色体は脱凝縮し静止核となりG1期にもどる。
真核生物においては、核内の遺伝子はM期において前述した染色体の形態をとり(遺伝子が凝縮したもの)、同時に紡垂糸が形成され2個の細胞に染色体が均等に分配され細胞が分裂し、分裂完了後染色体は脱凝縮し間期核となる。
細胞に紡垂糸形成の阻害剤であるコルヒチンあるいはその誘導体(コルセミドなど)を作用させて、M期に細胞を停止させることにより染色体を得ることが従来広く用いられている方法である。
しかしながら、この方法は細胞が上記のM期に達することが必須であり、細胞分裂が盛んな細胞では有効であるが、例えば神経細胞のように細胞分裂を起こしていない細胞、あるいは各種の固型腫瘍のように細胞分裂が盛んでない細胞では染色体を得るのが困難なことが多いことは、専門家の間では周知のことである。
このため、これら組織の染色体の解析には支障を来していた。
【0004】
この点を改良するための方法として、Raoらによって初めて報告された未成熟染色体凝縮法(Premature Chromosome Condensation:PCCと称する)が知られている。
このPCCの用語は上記のように未成熟染色体凝縮法(Premature ChromosomeCondensation)の略語として方法を示すために用いられる場合と、未成熟凝縮染色体(Premature Condensed Chromosome)を示すために用いられる場合とがあり、省略語PCCとしては同一であるが、文脈の前後関係から上記のいずれかを判断する必要がある。本発明では方法を示す場合はPCC法として示す。
図2は、前記のRaoらによる古典的なPCC法を示す模式図であり、この方法は分裂中期(M期)に同調停止させた細胞(融合細胞)aを、観察の対象とする細胞(被融合細胞)bと細胞融合させることにより、融合細胞中に存在する染色体凝縮促進因子(Maturation Promoting Factor:以下MPFと称する)の働きで被融合細胞の間期核を凝縮させ、染色体の形態を誘発させるもので、被融合細胞の上記細胞周期の状態により生じる染色体構造物は、G1−PCC、S−PCC、G2−PCC染色体と分類して呼ばれる。
図3は、これらの染色体の細胞周期を示す光学顕微鏡写真(x 1000)である。
図3において、符号a−fで示された組織の中、a−cはG1−PCC染色体、d−eはS−PCC染色体、fはG2−PCC染色体を示す。
図中に記入した太い矢印は融合細胞由来の染色体であり、細い矢印は被融合細胞由来の染色体である。
この方法は、M期に達しない細胞からでも染色体を得ることできるという利点を有している。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記PCC法は、
1)大量のM期同調細胞を用意する必要があること、
2)細胞融合を行う必要があること、
3)細胞融合の効率が高くないこと、
など技術的に困難(確立されていない)な点と、多大な労力が要求される点などの課題を有しているため、一般には普及されていない。
また、PCC法で得られる染色体は、融合細胞と被融合細胞との染色体が混在するため染色体の解析も容易でなく、且つ明確でないという欠点を有している。
これらの課題を解消して効率的に且つ確実に染色体を作成することが本発明の目的である。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明では、未成熟染色体凝縮による染色体の生成法として平成6年8月12日に出願した際に使用した、オカダ酸、カリクリンAなどの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤に加え、現在入手可能な蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤で細胞透過性を有するものとして、オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸(ジノフィジトキシン)、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールを試薬として使用し、細胞培養中に上記試薬を培養液中に加えることにより、上記の課題を解決した。
上記のオカダ酸、カリクリンAは、いずれも海綿から得られる物質であり、その化学構造は次に示される。
オカダ酸は、クロイソカイメン(Harichondria Okadai)から抽出され、その化学構造はC44H68O13で、分子量は805.2である。オカダ酸アンモニウム(Okadaic acid ammonium salt C44H67O13−NH4分子量822.05)、35−メチルオカダ酸(35-methyl okadaic acid C45H70O13 分子量819.04)は、オカダ酸の誘導体である。
カリクリンAは、チョコガタイシカイメン(Discodermia Calyx)から抽出され、その化学構造はC50H81N4O15Pで、分子量は1009.18である。
タウトマイシン(Tautomycin C41H66O13 分子量766.97)は、土壌細菌ストレプトマイセス(Streptomyces spiroverticillatus)より得られる抗生物質である。
カンタリジン(Cantharidine C10H12O4 分子量196.2)は、ツチハンミョウ(Blister Beetle)の分泌液より得られる物質である。また、カンタリジン酸(Canthardic Acid C10H14O5 分子量214.2)、エンドタール(Endothal C8H10O5 分子量186.2)は、カンタリジンの誘導体である。
蛋白質脱リン酸化酵素とは、リン酸化された蛋白質のセリン/スレオニン残基の脱リン酸化反応を触媒する酵素である。
細胞培養は、5%CO2、95%湿度、37℃の条件で行った。
染色体の作成は、上記条件で培養の対数増殖期の細胞に、本発明に使用した薬剤を所定濃度添加し、2時間培養を続ける。細胞は回収後、75mM塩化カリウム溶液で低張処理を行った後、3:1 メタノール:酢酸 液で固定し、スライドグラス上に展開した。
オカダ酸、35−メチルオカダ酸、カリクリンA、タウトマイシンは、100%エタノール、メタノール、あるいはDMSO(Dimethyl sulfoxide)に1mMの濃度に溶解して使用した。
オカダ酸アンモニウムは、水、エタノール、メタノール、DMSOに1mMの濃度に溶解して使用した。
カンタリジン、エタノールは、100%エタノール、メタノール、あるいはDMSOに100mMの濃度に溶解して使用した。
カンタリジン酸は、100%エタノール、メタノール、DMSO、あるいは水に100mMの濃度に溶解して使用した。
上記のオカダ酸、カリクリンA、タウトマイシン、オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールなどを含む溶液中に細胞を所定の時間浸漬処理して、M期に達していない細胞からも染色体を生成することを可能にして課題を解決した。
また、これらの染色体生成剤と溶媒とをセットとして、ヒトの生細胞あるいは獣医学、動植物学などの分野での生細胞の未成熟凝縮染色体検査用の試薬キットならびに検査キットとして利用することを可能にした。
【0007】
【発明の実施の形態】
実施の形態1:
実施の形態1として、被験細胞を、オカダ酸、カリクリンAで30分−2時間処理し、比較例として従来の方法であるコルセミド0.1μg/mlで2時間処理した。薬剤の濃度は、特に明記しない限り細胞培養液中の濃度(最終濃度)で示す。
オカダ酸の濃度が1−10nM(ナノモラー)の場合には、G2−PCC染色体を、100nMの場合には、G1−PCC、S−PCCおよびG2−PCC染色体を、それぞれ容易に得ることが可能であった。
カリクリンA濃度が1nMの場合には、G2−PCC染色体を、10−100nMの場合には、G1−PCC、S−PCCおよびG2−PCC染色体を、それぞれ容易に得ることが可能であった。
これらの染色体を得る効率は、従来の方法であるコルセミドを使用する方法より高く、また従来の方法によっては細胞分裂が盛んでないことから染色体がほとんど得られないような場合でも、上記のオカダ酸やカリクリンAによる処理を行うことによって染色体を得ることが可能であった。
【0008】
図4は、従来のコルセミド法により得られた染色体の光学顕微鏡写真(x 1000)である。
本発明によって得られた染色体のうち、図5のaは低濃度(1−10nM)オカダ酸で誘発される未成熟凝縮染色体であるが、形態的な相違はなく各種の染料を使用しても従来法による染色体に対するのと同等に染色することが可能であり、染色体の解析に関し問題はなかった。
表1は、ヒトリンパ球(PHA−P刺激)、ヒト樹立細胞株AT(L)5KY、AT(L)6KY、マウスリンパ球(コンカナバリンA、LPS 刺激)およびマウス樹立細胞株Ba/F3を試料とし、細胞培養中に、比較例として従来の分裂中期染色体を得る方法としてコルセミドを、本発明の未成熟凝縮染色体の生成剤である蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤としてのオカダ酸を、1nM、10nMおよび100nMの3種の濃度で処理し染色体標本を作成し、間期核、生成されたG1−PCC、S−PCC、G2−PCC、あるいはM期PCC染色体(コルセミド処理例)のそれぞれの数とその割合(括弧内に表示)とを示したものである。
【0009】
【表1】
表1中の記号G1/S−PCCは、G1/S期の細胞に誘導されるPCCを、また、G2/M−PCCは、G2/M期の細胞に誘導されるPCCを示す。
G1−PCCとS−PCCは、オカダ酸の濃度の相違で互いに分離できなかったため、G1/S−PCCとしてまとめて表記している。
G2/M−PCCも同様である。
また、本願明細書中で使用した下記の用語中で、
G1期はギャップ1(Gap 1)期を、
G2期はギャップ2(Gap 2)期を、
S期はDNA合成期(Synthesis)を、
M期は分裂中期(Mitosis)を示す。
ヒトリンパ球は2名の健常人の末梢血より分離し、幼若化刺激剤であるPHA−P(ファイトヘムアグルチニン)を用いて幼若化し、細胞増殖をさせた。
マウスリンパ球はマウスから脾臓リンパ球を採取し、幼若化刺激剤であるコンカナバリン(Con A)あるいはリポポリサッカロイド(LPS)を用いて幼若化し、細胞増殖させた。
ヒト樹立細胞株AT(L)5KY、AT(L)6KY、あるいはマウス樹立細胞株Ba/F3は対数増殖期の細胞に上記処理を行った。
【0010】
ヒトリンパ球(PHA−P刺激)、ヒト樹立細胞株AT(L)5KY、AT(L)6KY、マウスリンパ球(コンカナバリンA、LPS 刺激)およびマウス樹立細胞株Ba/F3を試料とし、細胞培養中に、比較例として従来の分裂中期染色体を得る方法としてのコルセミドと、本発明の未成熟凝縮染色体の生成剤である蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤の試料としてカリクリンAを、1nM、10nMおよび100nMの3種の濃度で処理し染色体標本を作成し、間期核、生成されたG1−PCC、S−PCCおよびG2−PCC染色体のそれぞれの数とその割合(括孤内)とを表2に示したものである。
【0011】
【表2】
【0012】
追加の実施の形態:
現在入手可能な蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤で細胞透過性を有するものとして、平成6年8月12日に出願した特願平6−210719号に記載したオカダ酸あるいはカリクリンAに追加して、オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸(ジノフィジトキシン)、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールを用いた。これらの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤を用い、ヒト末梢血リンパ球(表3)およびヒト樹立細胞株AT(L)5KY(表4)への未成熟染色体凝縮の誘発を行った。
実施の形態2:
オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸(ジノフィジトキシン)の濃度が100nM以上の場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であった。1nMから100nMの濃度では、G2−PCCのみが誘発された。これは、オカダ酸の場合と同様であった。
実施の形態3:
カンタリジンおよびカンタリジン酸の濃度が5μM以上の場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であった。500nMから5μMの濃度では、G2−PCCのみが誘発された。
実施の形態4:
エンドタールの濃度が50μM以上の場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であったが、5μM以下の濃度では、G2−PCCのみが誘発された。また、出現したPCCの頻度はカンタリジンおよびカンタリジン酸の場合に比較して低かった。
実施の形態5:
タウトマイシンの濃度が10μMの場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であった。1μMの濃度では、若干のG1/S−PCCの出現が認められたが、1μMより濃度が低いときは、G2−PCCのみが誘発された。
実施の形態2〜5に用いた、これらの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤を用い、ヒト末梢血リンパ球(表3)およびヒト樹立細胞株AT(L)5KY(表4)への未成熟染色体凝縮の誘発を行った。また、得られた未成熟染色体はオカダ酸で得られたものと同一であったので、顕微鏡写真は省略した。また、表3ならびに表4のデータのグラフ表示も省略し、データを表で表示するのに留めた。
【0013】
表3、4は、上記の実施の形態2〜5で使用した処理剤の濃度と生成された間期核、G1/S−PCC、G2/M−PCCのそれぞれの数とその割合および総数を表示したものである。
【0014】
【表3】
表3は、ヒトリンパ球に対して実施の形態2〜5を実施して得られたPCC出現頻度と薬剤濃度の関係を示したものである。
【表4】
表4は、ヒト樹立細胞株AT(L)5KYに対して実施の形態2〜5を実施して得られたPCCの出現頻度と薬剤濃度の関係を示したものである。
【0015】
結果の考察:
実施の形態1について:
表1に示した結果から、低濃度(1nM−10nM)のオカダ酸では、出現する未成熟凝縮染色体はG2型である。
図4は、従来のコルセミド法により、ギムザ染色によって得られる染色体を矢印で示す顕微鏡写真である。
図5は、顕微鏡写真であって、aは本発明の低濃度(1−10nM)オカダ酸により誘発される未成熟凝縮染色体であり、出現する染色体の形態は2価染色体であり、図4に示したコルセミド法で得られるG2型未成熟染色体と同じで、その出現頻度もコルセミド法とほぼ同等であった。
bは高濃度(100nM)オカダ酸で誘発される未成熟凝縮染色体であり、出現する染色体の形態は1価および2価染色体であり、S型未成熟凝縮染色体(矢印)がG2型未成熟染色体と共に出現する。
cは中倍率(400倍)による観察で、高濃度(100nM)オカダ酸で誘発される未成熟凝縮染色体を示し、矢印で示される部分は、染色体の複製が完了し染色体が2価となっている部分であり、他の薄く染色されている部分は複製が行われてなく染色体が1価であることを示す。
この染色体は複製完了部と未複製の部分が混在していることから、DNA合成期にある細胞が未成熟染色体凝縮(S型未成凝縮熟染色体)を起こしたことを示している。
dは高倍率(1,000倍)による観察で、矢印で示される複製完了部と未複製部分がより明確に観察される。
同様の現象は実施の形態2で、蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤の試料としてのカリクリンAでも観察されたので顕微鏡写真は省略する。
【0016】
図6は、表1に示した結果から、オカダ酸(OA)の濃度と出現するPCCとの関係をグラフ化したもので、オカダ酸の濃度が1nM−10nMではG2型未成熟染色体が単独に、100nM以上でG1/S型の未成熟凝縮染色体がG2型とともに出現することが明白に認められる。
図7は、表2に示した結果から、カリクリンA(Calc A)の濃度と出現するPCCとの関係をグラフ化したもので、低濃度(1nM)では、出現する未成熟凝縮染色体はG2型であり、コルセミドにより得られる分裂中期染色体と形態的に同じであり、またその出現頻度もコルセミド法とほぼ同等であった。
カリクリンAの濃度が10nM以上に達すると、G2型未成熟凝縮染色体に加え、G1、S型未成熟凝縮染色体が出現する。
また、その出現頻度もコルセミド法に比べ数倍上昇した。この点からカリクリンAはオカダ酸に比較して未成熟凝縮染色体を誘発する作用が強いことが確認できた。
以上の結果から、オカダ酸(OA)とカリクリンA(Calc A)とも濃度が1nMを下回る場合は出現頻度が十分でなく、100nMで殆ど飽和し、それを超えても殆ど変化がなく、場合によっては染色体凝縮が過度になり、あるいは細胞毒性が強く、死滅細胞が増加するので濃度の上限を100nMとした。
【0017】
実施の形態2〜5について:
表3は、ヒトリンパ球に対して実施の形態2〜5を実施して得られたPCCの出現頻度と薬剤濃度の関係を示したものである。
オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸(ジノフィジトキシン)の濃度が100nMの場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であった。1nMから100nMの濃度では、G2−PCCのみが誘発された。これはオカダ酸の場合と同様であった。
カンタリジンおよびカンタリジン酸の濃度が5μM以上の場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であった。500nMから5μMの濃度では、G2−PCCのみが誘発された。
エンドタールの濃度が50μM以上の場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であったが、5μ以下の濃度では、G2−PCCのみが誘発された。また、出現したPCCの頻度は、カンタリジンおよびカンタリジン酸の場合に比較して低かった。
タウトマイシンの濃度が10μMの場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であった。1μMでは若干のG1/S−PCCの出現が認められたが、1μMより濃度が低いときは、G2−PCCのみが誘発された。
表4は、ヒト樹立細胞株AT(L)5KYに対して表3と同様に、実施の形態2〜5を実施して得られたPCCの出現頻度と薬剤濃度の関係を示したものである。得られたPCCの頻度値の違いはあるものの、G1/S−PCC、G2−PCCと各薬剤の濃度依存性は同等であった。
【0018】
オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールは、すべて蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤である。未成熟染色体凝縮を誘発するために必要な濃度はそれぞれ異なるが、全て未成熟染色体凝縮を誘発することが可能であった。このことは、染色体の凝縮が蛋白質脱リン酸化酵素によって制御されていることを強く示唆している。このことは同時に、今後発見あるいは合成される新たなる蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤が強力な未成熟染色体凝縮の誘発作用を示すことが期待される。
【0019】
先に行ったオカダ酸あるいはカリクリンAに追加して、オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸(ジノフィジトキシン)、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールを用いた。
【0020】
オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸(ジノフィジトキシン)の濃度が100nM以上の場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であった。1nMから100nMの濃度では、G2−PCCのみが誘発された。これはオカダ酸の場合と同様であった。
カンタリジンおよびカンタリジン酸の濃度が5μM以上の場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であった。500nMから5μMの濃度では、G2−PCCのみが誘発された。
エンドタールの濃度が50μM以上の場合、G1/S−PCC、G2−PCCを誘発することが可能であったが、5μM以下の濃度では、G2−PCCのみが誘発された。また、出現したPCCの頻度は、カンタリジンおよびカンタリジン酸の場合に比較して低かった。
タウトマイシンの濃度が10μMの場合、G1/S−PCCを誘発することが可能であった。1μMでは、若干のG1/S−PCCの出現が認められたが、1μMより濃度が低いときは、G2−PCCのみが誘発された。
【0021】
以上の結果から、オカダ酸、オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸、カリクリンA、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールは、すべて本発明に適用できる蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤であると言い得る。
【0022】
(作用)
現時点の技術では、本発明のオカダ酸、オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸などによる直接的なPCC誘導の機構は不明確な点が多いが、分子生物学的な知見により染色体の凝縮の機構にはヒストンその他多くの蛋白(タンパク)質のリン酸化が関わっているということが知られていて、その調節に蛋白質脱リン酸化酵素が関与しているという知見が得られている。
従って、上記の効果は、オカダ酸などによる蛋白質脱リン酸化酵素の阻害により、染色体の凝縮に関与している蛋白質のリン酸化が促進されて、染色体の凝縮が促進されることによるものと考えられる。
【0023】
【発明の効果】
しかし、本発明の低濃度(1−10nM)オカダ酸の場合、出現する染色体の形態や出現頻度も従来のコルセミド法とほぼ同等であったが、本発明による場合は、M期同調細胞を集めること、および細胞融合を行なう必要がなく極めて簡便で、しかも得られる染色体も解析の対象となる細胞自体のもつ染色体のみで構成されるので、その解析も容易である。従って低濃度(1−10nM)で使用しても従来のコルセミド法に比較して優れている。
表2に示した結果から、1nMのカリクリンAでは出現する未成熟凝縮染色体はG2型であり、出現頻度も従来のコルセミド法とほぼ同等であったが、前記オカダ酸の場合と同様の理由により従来のコルセミド法に比較して優れている。
10nMのカリクリンAと10−100nMの場合にG1−PCC、S−PCCおよびG2−PCC染色体を、それぞれ容易に得ることが可能なので、従来のコルセミド法に比較して遥かに優れている。
オカダ酸などの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤により、細胞に未成熟染色体凝縮を誘導させることにより、従来分裂中期細胞からのみ得られていた染色体を、分裂中期以外の細胞からも得られることが可能になった。
分裂中期細胞は、通常増殖の盛んな細胞では比較的良く得られることができるが、増殖が盛んでない細胞あるいは増殖をほとんど停止している細胞からは、得るのが極めて困難な場合が多い。
【0024】
オカダ酸、オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸、カリクリンA、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールにより細胞を処理することにより、分裂中期だけでなくG1、S、G2期からも染色体形成を誘導することが可能となり、従来染色体を得るのが困難だったケースからも染色体サンプルを得るのが可能となった。
医学的な応用として、リンパ球、羊水細胞、絨毛細胞などで染色体解析を行う場合しばしば染色体を得られない場合があるが、本発明によれば今後より確実に染色体標本を得ることが期待できる。
また、オカダ酸、オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸、カリクリンA、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールの濃度を増加させると、G2期ばかりでなく、G1、S期の細胞においても未成熟染色体凝縮を誘導させることが可能であった。
【0025】
細胞に放射線、薬剤などを作用させるとき、染色体の切断組み替えが生じ最終的に染色体の異常が形成されるが、これは従来分裂中期染色体の解析をもって行われてきた。
しかしながら、染色体の切断組み替えは本来間期核で進行していく現象であって、一方分裂中期染色体はこれら現象の最終的な結果を反映しているに過ぎず、これら機構の解明には間期核での観察が不可欠である。
オカダ酸などにより、M期ばかりでなく、G2、C1、S期の細胞においても未成熟染色体凝縮を誘導させることが可能となったことは、これらのステージにおける染色体の状態を観察することが可能になったことを意味し、上記の現象の解明に大きく貢献することが期待される。
また、Raoらが発表した従来のPCC法と比較すると、本発明による場合は、M期同調細胞を集めること、および細胞融合を行なう必要がなく、極めて簡便でしかも得られる染色体も解析の対象となる細胞自体のもつ染色体のみで構成されるので、その解析も容易である。
また、染色体を効率良く得ることができるため、用意する細胞の数も少なくてすむという利点を併せ持っている。
【図面の簡単な説明】
【図1】細胞周期と細胞分裂の関係を示す模式図である。
【図2】古典的なPCC法を示す模式図である。
【図3】図2の古典的なPCC法の細胞周期を示す光学顕微鏡写真(x 1000)である。
【図4】従来のコルセミド法により、ギムザ染色によって得られる染色体を示す顕微鏡写真である。
【図5】本発明の各濃度のオカダ酸により誘発される未成熟凝縮染色体を示す顕微鏡写真である。
【図6】表1に示した結果を集約して示すグラフである。
【図7】表2に示した結果を集約して示すグラフである。
【符号の説明】
PCC: 未成熟凝縮染色体(Premature Condensed Chromosome)
G1/S−PCC: G1、S期の細胞に誘導されるPCC
G2−PCC: G2期の細胞に誘導されるPCC
G1期: ギャップ1(Gap 1)期
G2期: ギャップ2(Gap 2)期
S期: DNA合成期(Synthesis)
OA: オカダ酸(Okadaic Acid)
CalcA: カリクリンA(Calyculin A)
Claims (16)
- 蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤がオカダ酸とカリクリンAの少なくとも1つである未成熟凝縮染色体生成剤であって、G1(ギャップ1期)、S期(DNA合成期)、G2(ギャップ2期)、およびM期(分裂中期)のいずれの段階においても未成熟凝縮染色体を生成することのできる未成熟恐縮染色体生成剤。
- 蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤がオカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸およびエンドタールから成る群から選ばれる少なくとも1種である未成熟凝縮染色体生成剤であって、G1(ギャップ1期)、S期(DNA合成期)、G2(ギャップ2期)、およびM期(分裂中期)のいずれの段階においても未成熟凝縮染色体を生成することのできる未成熟凝縮染色体生成剤。
- オカダ酸とカリクリンAの少なくとも1つを含む細胞培養液に浸漬処理することから成る未成熟凝縮染色体生成方法であって、G1(ギャップ1期)、S期(DNA合成期)、G2(ギャップ2期)、およびM期(分裂中期)のいずれの段階においても未成熟凝縮染色体を生成することができる未成熟凝縮染色体生成方法。
- オカダ酸あるいはカリクリンAの濃度が1−100nMである溶液を用いる請求項3の未成熟凝縮染色体生成方法。
- オカダ酸の濃度が100nM以上の溶液でG1期、S期、あるいはG2期の未成熟凝縮染色体(PCC)を生成し、あるいは1nM−10nMの溶液でG2期のPCCを生成する請求項3または4の未成熟凝縮染色体生成方法。
- カリクリンAの濃度が10nM以上の溶液でG1期、S期、あるいはG2期のPCCを生成し、あるいは1nMの溶液でG2期のPCCを生成する請求項3または4の未成熟凝縮染色体生成方法。
- 生細胞を、オカダ酸アンモニウム、35−メチルオカダ酸、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸およびエンドタールから成る群から選ばれる少なくとも1種を含む細胞培養液に浸漬処理することから成る未成熟凝縮染色体生成方法であって、G1(ギャップ1期)、S期(DNA合成期)、G2(ギャップ2期)、およびM期(分裂中期)のいずれの段階においても未成熟凝縮染色体を生成することができる未成熟凝縮染色体生成方法。
- オカダ酸アンモニウムあるいは35−メチルオカダ酸の濃度が1−100nMである溶液を用いる請求項7の未成熟凝縮染色体生成方法。
- オカダ酸アンモニウムあるいは35−メチルオカダ酸の濃度が100nM以上の溶液でG1期、S期、あるいはG2期のPCCを生成し、または1nM−10nMの溶液でG2期のPCCを生成する請求項8の未成熟凝縮染色体生成方法。
- タウトマイシンの濃度が100nM−10μMである溶液を用いる請求項9の未成熟凝縮染色体生成方法。
- タウトマシンの濃度が1μM以上の溶液でG1期、S期、あるいはG2期のPCCを生成し、あるいは100nMの溶液でG2期のPCCを生成する請求項10の未成熟凝縮染色体生成方法。
- カンタリジン、カンタリジン酸、あるいはエタンドールの濃度が500nM−50μMである溶液を用いる請求項7の未成熟凝縮染色体生成方法。
- カンタリジン、カンタリジン酸、あるいはエタンドールの濃度が5μM以上の溶液でG1期、S期、あるいはG2期のPCCを生成し、または500nMの溶液でG2期のPCCを生成する請求項7の未成熟凝縮染色体生成方法。
- ヒトの生細胞の染色体の検査に使用される請求項1または2の未成熟凝縮染色体生成剤。
- 獣医学、動・植物学の分野で生細胞の染色体検査に使用される請求項1または2の未成熟凝縮染色体生成剤。
- 請求項1または2の未成熟凝縮染色体生成剤から成る細胞の未成熟凝縮染色体検査用の試薬キットならびに検査キット。
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