CN111388758A - 基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法 - Google Patents

基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111388758A
CN111388758A CN202010260081.4A CN202010260081A CN111388758A CN 111388758 A CN111388758 A CN 111388758A CN 202010260081 A CN202010260081 A CN 202010260081A CN 111388758 A CN111388758 A CN 111388758A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acellular matrix
ink
hydroxyethylcellulose
hydrogel
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010260081.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张秀莉
李晓瑞
罗勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou University
Original Assignee
Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou University filed Critical Suzhou University
Priority to CN202010260081.4A priority Critical patent/CN111388758A/zh
Publication of CN111388758A publication Critical patent/CN111388758A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/48—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with macromolecular fillers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A61L2300/254—Enzymes, proenzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，该复合生物墨水的组分包括脱细胞基质溶液、光交联甲基丙烯酸化水凝胶以及羟乙基纤维素，所述脱细胞基质溶液为动物或者人的肝脏、肾脏、胰腺等其他组织脱细胞基质的胃蛋白酶溶液。本发明还公开了所述的基于光交联甲基丙烯酸化水凝胶/脱细胞基质/羟乙基纤维素的复合生物墨水的制备方法及应用。本发明的基于光交联甲基丙烯酸化水凝胶/脱细胞基质/羟乙基纤维素的复合生物墨水，表征效果好，可打印性强，生物相容性好。

Description

基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合 生物墨水及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物墨水技术领域，具体涉及一种用于体外细胞打印的高活性复合生物墨水及其制备方法与应用。
背景技术
3D生物打印是一种能在数字三维模式驱动下按照增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，制造医疗器械、组织工程支架和组织器官的技术。近年来，3D打印技术和微流控技术的逐渐成熟，各式新型的器官组织芯片不断涌现，在筛选药物、推动个性化和精准化医疗快速发展方面具有重大的作用。既可以降低药物筛选的成本，也可以减少测试时间，节约人力和财力资源；更重要的是可以提高被测试对象的一致性，使实验结果更具有说服力。利用“生物墨水”作为打印材料，模拟天然的3D ECM，结合细胞以构建含有活性的组织或器官。虽然目前已研制出来的生物墨水非常类似于ECM的活性，但由于体外3D培养系统仍然缺乏促进细胞生长和维持细胞功能的合适天然生长因子，导致3D生物打印构建的组织活性相对原型具有较大的差距。因此使用天然生长因子对3D ECM进行模拟是当前3D生物打印实现高仿生性的当务之急。
具有复杂天然组成和仿生结构的脱细胞基质是生物墨水的首选。脱细胞基质是指将组织经过脱细胞工艺处理后，去除能够引起免疫排斥的抗原部分。具有良好的机械力学性能，良好的生物相容性，在体内起着支撑、连接细胞的作用，同时其三维空间的结构及生长因子有利于细胞的黏附和生长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新型的用于体外细胞打印的高活性复合生物墨水，其表征效果好，可打印性强，生物相容性好。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，所述复合生物墨水的组分包括脱细胞基质溶液(DECM)、光交联甲基丙烯酸化水凝胶(GelMA)以及羟乙基纤维素。
本发明中，脱细胞基质由动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼等器官组织经脱细胞工艺处理得到，具有良好的机械力学性能以及生物相容性，其三维的空间结构以及生长因子也有利于细胞的粘附和生长。甲基丙烯酸酐化水凝胶是由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶材料，具有优异的生物相容性，且可由紫外光或可见光激发固化反应，形成适于细胞生长与分化且有一定强度的三维结构。两种材料的结合可显著提高生物墨水的生物活性，但也降低了生物墨水的可打印性。
进一步地，所述脱细胞基质溶液为脱细胞基质的胃蛋白酶溶液，其浓度优选为1-50mg/ml。
本发明中，通过在体系中加入一定量的羟乙基纤维素，作为一种助变剂，能够改善生物墨水的流变性能，进一步增强生物墨水的机械强度，有效提高了生物墨水的打印性能。
进一步地，所述光交联甲基丙烯酸化水凝胶与脱细胞基质溶液的体积比为5:1～1:5，优选为1:1。
进一步地，所述羟乙基纤维素的添加量为脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶总质量的0.1％～15％，优选为1％。
进一步地，所述复合生物墨水可用于打印的细胞包括动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼等器官组织的细胞。
本发明另一方面提供了所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法，包括：
S1、将脱细胞基质冻干、研磨，加入胃蛋白酶溶液溶解，制成脱细胞基质溶液；
S2、将得到的脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶混合，再加入羟乙基纤维素，混合均匀，即得到所述复合生物墨水。
进一步地，步骤S1中，所述脱细胞基质是由解冻后的组织连接蠕动泵进行脱细胞灌注而得到的，所述脱细胞灌注具体依次包括：
(1)去离子水振荡洗脱2h；
(2)0.1％胰酶浸3h；
(3)1％TritonX-100振荡洗脱1h；
(4)4％SDC振荡洗脱1h；
(5)80U/ml DNase、5U/ml RNase振荡洗脱30min；
(6)2％青霉素-链霉素、2.5μg/ml两性霉素B的PBS振荡洗脱30min。
进一步地，振荡洗脱的速率为60rpm/min。
进一步地，制备脱细胞基质后，还需要对其进行表征，所述表征包括：残留核酸检测，定量DNA浓度，HE染色验证脱细胞过程。
进一步地，步骤S1中，所述胃蛋白酶溶液是由胃蛋白酶溶解于盐酸中得到的，浓度为0.1-10mg/mL。
进一步地，步骤S2中，还包括对制备的生物墨水进行可打印性和生物相容性的验证的步骤。
本发明还提供了所述的复合生物墨水在构建组织工程支架中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的制备方法简单易操作，选取动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼等器官组织作为脱细胞基质的来源，来源广泛，容易获得；
(2)由于本发明在制备生物墨水的过程当中，加入了脱细胞基质和羟乙基纤维素，所以制备出来的生物墨水表征效果好，可打印性强，生物相容性好；
(3)本发明制备而得的新型的用于细胞打印的高活性复合生物墨水，用于医疗或制药行业，将在一定程度上降低药物筛选成本，减少筛选测试时间，节约人力和财力资源，对于未来医疗事业的发展具有奠基作用。
附图说明
图1为1％的羟乙基纤维素加入GelMA与脱细胞基质(DECM)不同的体积比中形成生物墨水的打印效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一、制备基于肝脏脱细胞基质的复合生物墨水
(1)肝脏准备：获取新鲜猪肝脏，切为10mm2大小的方块，-80℃冷冻12小时；
(2)肝脏脱细胞基质的制备：肝脏常温解冻，进行振荡细胞(振荡速率为60rpm/min)去离子水振荡洗脱2h；0.1％胰酶浸泡3h；1％TritonX-100振荡洗脱1h；4％SDC振荡洗脱1h；80U/ml DNase、5U/ml RNase振荡洗脱30min；2％青霉素-链霉素、2.5μg/ml两性霉素B的PBS振荡洗脱30min。
(3)肝脏脱细胞基质的表征：肝脏脱细胞基质经历冷冻干燥后，DNA含量检测以及胶原蛋白等一系列表征，证明脱细胞较完全以后，可以进行下一步；
(4)肝脏脱细胞基质溶液的制备与表征
①肝脏脱细胞基质溶液的制备：将肝脏脱细胞基质冻干，取冻干后的脱细胞基质进行剪碎、研磨，使其易于溶解，研磨至合适颗粒大小，溶于胃蛋白酶中制成溶液；
②肝脏脱细胞基质溶液的表征：检测溶液中胶原蛋白的浓度，以及溶液中GAG含量，确保检测的含量尽量与未脱细胞处理的天然肝脏对比，没有极为显著的变化，保证制成的生物墨水具有一定的生物活性；
(5)生物墨水的制备：将肝脏脱细胞基质与明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)1:1混合，并加入1％的羟乙基纤维素，制成生物墨水。
二、生物墨水性能的检测
(1)生物墨水可打印性的验证：电镜SEM检测生物墨水的孔径，测量杨式模量，检测打印结构和弹性模量；
(2)生物墨水生物相容性的验证：细胞活死染色评估细胞活性，定量尿素和ALB分泌评估肝功能。
三、细胞打印检测
(1)肝癌细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的HepG2细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
(2)正常肝细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的LO2细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
(3)肝原代细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的肝原代细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
附图1示出了1％的羟乙基纤维素加入GelMA与脱细胞基质(DECM)不同的体积比中形成生物墨水的打印效果。
从图1中可以看出，当GelMA：DECM的比例为1：1～1：2时，得到的生物墨水都显示出了良好的打印性能。当GelMA：DECM的比例上升至1:3时，生物墨水的打印性能出现明显的下降。
现有技术中，未加羟乙基纤维素时，生物墨水中GelMA：DECM最大比例为1：1，即DECM的上限为50％。本实施例中，通过在生物墨水中引入了1％的羟乙基纤维素，明显的提高生物墨水的打印性能，使得DECM的可打印含量增加至67％，有利于提高打印支架的生物活性。
实施例2
一、制备基于肾脏脱细胞基质的复合生物墨水
(1)肾脏准备：获取新鲜猪肾脏，切为10mm2大小的方块，-80℃冷冻至少12小时；
(2)肾脏脱细胞基质的制备：肾脏常温解冻，进行振荡细胞(振荡速率为120rpm/min)去离子水振荡洗脱2h；0.1％胰酶浸泡3h；1％TritonX-100振荡洗脱1h；4％SDC振荡洗脱1h；80U/ml DNase、5U/ml RNase振荡洗脱30min；2％青霉素-链霉素、2.5μg/ml两性霉素B的PBS振荡洗脱30min。
(3)肾脏脱细胞基质的表征：肾脏脱细胞基质经历冷冻干燥后，DNA含量检测以及胶原蛋白等一系列表征，证明脱细胞较完全以后，可以进行下一步；
(4)肾脏脱细胞基质溶液的制备与表征
①肾脏脱细胞基质溶液的制备：将肾脏脱细胞基质冻干，取冻干后的脱细胞基质进行剪碎、研磨，使其易于溶解，研磨至合适颗粒大小，溶于胃蛋白酶中制成溶液；②肾脏脱细胞基质溶液的表征：检测溶液中胶原蛋白的浓度，以及溶液中GAG含量，确保检测的含量尽量与未脱细胞处理的天然肾脏对比，没有极为显著的变化，保证制成的生物墨水具有一定的生物活性；
(5)生物墨水的制备：将肾脏脱细胞基质与明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)1:1混合，并加入1％的羟乙基纤维素，混合均匀，制成生物墨水。
二、生物墨水性能的检测
(1)生物墨水可打印性的验证：电镜SEM检测生物墨水的孔径，测量杨式模量，检测打印结构和弹性模量；
(2)生物墨水生物相容性的验证：细胞活死染色评估细胞活性，定量尿素和ALB分泌评估肾功能。
三、细胞打印检测
(1)肾癌细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的MPC5细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
(2)正常肾细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的HK2细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
(3)肾原代细胞的打印：将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5mL生物打印墨水与1mL的肾原代细胞悬液在10mL离心管中混合均匀，2000转/分钟，离心2分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，紫外光交联30s得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用MTT法检测细胞增殖情况，并用Hoechst及PI进行染色检测凝胶中细胞活性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (11)

1.基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述复合生物墨水的组分包括脱细胞基质溶液、光交联甲基丙烯酸化水凝胶以及羟乙基纤维素。
2.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述脱细胞基质溶液为动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子或眼的脱细胞基质的胃蛋白酶溶液。
3.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述脱细胞基质溶液的浓度为1～50mg/ml。
4.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述光交联甲基丙烯酸化水凝胶的浓度为1％～50％。
5.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述光交联甲基丙烯酸化水凝胶与脱细胞基质溶液的体积比为5:1～1:5。
6.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述羟乙基纤维素的添加量为脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶总质量的0.1％～15％。
7.如权利要求1所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水，其特征在于，所述复合生物墨水用于打印的细胞包括动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胆、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼的细胞。
8.根据权利要求1-7任一项所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法，其特征在于，包括：
S1、将脱细胞基质冻干、研磨，加入胃蛋白酶溶液溶解，制成脱细胞基质溶液；
S2、将得到的脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶混合，再加入羟乙基纤维素，混合均匀，即得到所述复合生物墨水。
9.如权利要求8所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述脱细胞基质是由解冻后的组织经多步脱细胞操作得到的，所述多步脱细胞具体依次包括：
(1)去离子水振荡洗脱2h；
(2)0.1％胰酶浸3h；
(3)1％TritonX-100振荡洗脱1h；
(4)4％SDC振荡洗脱1h；
(5)80U/ml DNase、5U/ml RNase振荡洗脱30min；
(6)2％青霉素-链霉素、2.5μg/ml两性霉素B的PBS振荡洗脱30min。
10.如权利要求8所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述胃蛋白酶溶液是由胃蛋白酶溶解于盐酸中得到的，浓度为0.1-10mg/mL。
11.根据权利要求1-7任一项所述的复合生物墨水在构建组织工程支架中的应用。
CN202010260081.4A 2020-04-03 2020-04-03 基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法 Pending CN111388758A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010260081.4A CN111388758A (zh) 2020-04-03 2020-04-03 基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010260081.4A CN111388758A (zh) 2020-04-03 2020-04-03 基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111388758A true CN111388758A (zh) 2020-07-10

Family

ID=71416680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010260081.4A Pending CN111388758A (zh) 2020-04-03 2020-04-03 基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111388758A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063224A (zh) * 2020-09-24 2020-12-11 惠州市至上新材料有限公司 一种生物油墨及其制备方法
CN114712561A (zh) * 2022-03-22 2022-07-08 苏州大学 一种可注射、光交联脱细胞基质复合水凝胶及其制备方法与应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999040153A1 (en) * 1998-02-06 1999-08-12 Monsanto Company Acid-stable and cationic-compatible cellulose compositions and methods of preparation
CN102407332A (zh) * 2011-12-05 2012-04-11 烟台工程职业技术学院 一种多孔钛的制备方法
CN102712699A (zh) * 2009-12-14 2012-10-03 路博润高级材料公司 决明衍生物
CN103599567A (zh) * 2013-11-25 2014-02-26 四川大学华西医院 一种温敏性复合材料及其制备方法和用途
CN107987287A (zh) * 2017-11-15 2018-05-04 华东理工大学 光致亚硝基交联水凝胶材料及其制备方法与应用
CN109054503A (zh) * 2018-07-05 2018-12-21 大连理工大学 一种生物打印墨水制备方法及打印方法和用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999040153A1 (en) * 1998-02-06 1999-08-12 Monsanto Company Acid-stable and cationic-compatible cellulose compositions and methods of preparation
CN102712699A (zh) * 2009-12-14 2012-10-03 路博润高级材料公司 决明衍生物
CN102407332A (zh) * 2011-12-05 2012-04-11 烟台工程职业技术学院 一种多孔钛的制备方法
CN103599567A (zh) * 2013-11-25 2014-02-26 四川大学华西医院 一种温敏性复合材料及其制备方法和用途
CN107987287A (zh) * 2017-11-15 2018-05-04 华东理工大学 光致亚硝基交联水凝胶材料及其制备方法与应用
CN109054503A (zh) * 2018-07-05 2018-12-21 大连理工大学 一种生物打印墨水制备方法及打印方法和用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONALD BEJLERI ET AL: "A Bioprinted Cardiac Patch Composed of Cardiac-Specific Extracellular Matrix and Progenitor Cells for Heart Repair", 《ADVANCED HEALTHCARE MATERIALS》 *
XIAORUI LI ET AL.: "Hydroxyethyl Cellulose As a Rheological Additive for Tuning the Extrusion Printability and Scaffold Properties", 《3D PRINTING AND ADDITIVE MANUFACTURING》 *
马振友: "《中西皮肤外用制剂手册》", 30 September 2019, 河南科学技术出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063224A (zh) * 2020-09-24 2020-12-11 惠州市至上新材料有限公司 一种生物油墨及其制备方法
CN114712561A (zh) * 2022-03-22 2022-07-08 苏州大学 一种可注射、光交联脱细胞基质复合水凝胶及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rosellini et al. Protein/polysaccharide‐based scaffolds mimicking native extracellular matrix for cardiac tissue engineering applications
CN110272860B (zh) 一种细胞三维培养微环境构建方法及应用
WO2019122351A1 (en) Tissue-specific human bioinks for the physiological 3d-bioprinting of human tissues for in vitro culture and transplantation
US20220145259A1 (en) Liver Tissue Model Constructs and Methods for Providing the Same
Wagner et al. Design and synthesis of an artificial pulmonary pleura for high throughput studies in acellular human lungs
CN111388758A (zh) 基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法
CN109054496A (zh) 一种复合生物墨水及其制备方法
CN104312140B (zh) 一种聚氨酯/小肠粘膜下层复合材料及用途
CN109475606A (zh) 从电纺脱细胞的细胞外基质制造的支架
JP2023554582A (ja) 筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法及びその使用
Bashiri et al. 3D-printed placental-derived bioinks for skin tissue regeneration with improved angiogenesis and wound healing properties
US20230405186A1 (en) Preparation method and application of decellularized extracellular matrix tissue paper
CN115475279B (zh) 光敏软骨脱细胞基质水凝胶材料及其制备方法及应用
KR102282070B1 (ko) 폐 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법, 그 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법
CN113150318B (zh) 一种可注射镁合金复合多网络水凝胶的制备方法及应用
CN113929934A (zh) 抗降解性明胶微球、人工肝模型及其构建方法与应用
EP4261273A1 (en) Scaffold derived from decellularized adipose tissue for culturing organoid, and method for producing same
CN115141792A (zh) 一种小鼠颈动脉血管组织单细胞悬液的制备方法及其应用
CN110669721A (zh) 一种诱导肝卵圆细胞系在肝脏去细胞生物支架上形成功能性类肝样器官组织的方法
Zheng et al. Preparation and Properties of Decellularized Sheep Kidney Derived Matrix Scaffolds
CN111420121A (zh) 一种基于甲基丙烯酸化水凝胶/纳米粘土/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法和应用
US20230340422A1 (en) Adipose extracellular matrix-derived scaffold for culturing organoid and preparing method thereof
EP4299083A1 (en) Phenol derivative-modified, tissue-derived extracellular matrix derivative for construction of artificial tissue
KR102145057B1 (ko) 숙신화 콜라겐 및 이를 이용한 숙신화 콜라겐-피브리노겐 복합체의 제조방법
KR102708789B1 (ko) 간 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 간 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200710

RJ01 Rejection of invention patent application after publication