CN113929934A - 抗降解性明胶微球、人工肝模型及其构建方法与应用 - Google Patents

抗降解性明胶微球、人工肝模型及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗降解性明胶微球、人工肝模型及其构建方法与应用，先合成甲基丙烯酰胺化改性明胶，然后进一步通过乳化制备光交联明胶微球，这样不仅使明胶微球具备生理环境下的抗降解性，并且通过调节甲基丙烯酰胺化程度和光照条件，能够实现微球降解速率的简单高效调控，为体外组织工程人工肝构建提供细胞载体。本发明以抗降解明胶微球为细胞载体，在其表面接种血管内皮细胞和肝细胞极，并自发粘结组装形成人工肝模型，不仅提升了人工肝模型的抗降解特性，且所获得的人工肝模型血管化程度高，有利于人工肝模型的肝功能表达和长期体外应用，可用于白酒质量鉴别与酒精性肝病治疗药物治疗效果评价。

Description

抗降解性明胶微球、人工肝模型及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学材料和生物医学工程技术领域，涉及仿生材料制造方法，尤其涉及用于白酒安全性快速评价的组织工程人工肝模型构建方法。
背景技术
研究表明，长期大量饮酒可能引起酒精性肝病，不同品质白酒致肝脏损伤存在差异，白酒引起肝脏功能受损、形态学改变的程度与酒的种类和剂量有关。过量饮酒以及饮低劣品质的白酒会导致乙醇的中间代谢产物乙醛在体内大量累积，破坏肝细胞的细胞结构、触发自身免疫反应，直接或间接导致肝细胞变性、坏死及纤维化，同时还引起肝非实质细胞的改变。因此，建立快速、经济、有效的肝损伤评价模型对于白酒的质量鉴别和健康功能研究，以及酒精性肝病治疗药物的研发具有重要意义。
现有报道中多通过鼠等哺乳动物建立酒精性肝损伤模型进行白酒肝损伤评价，例如Tsukamoto-French模型和Lieber-DeCarli模型。这些基于动物模型的评价体系能在临床前基本满足人体肝脏环境模拟需求，可靠性高。但由于肝脏强大的再生能力和代偿机能，短期内这些模型并不能真实快速灵敏地反映肝脏病变或肝功能异常，并且成本高、操作难度大、专业性强，无法满足批量化、产业化需求。而通过简单的体外细胞模型由于无法精确模拟肝组织复杂结构功能，同样不能不能全面、准确地反映肝损伤过程。
体外组织工程人工肝的构建为白酒安全性评价与酒精性肝病治疗药物筛选提供了新的途径，有望在保证高有效性的同时，改善传统白酒评价模型成本高、周期长、效率低的现状，从而降低白酒生产成本，降低产品潜在的安全风险，提高国内外市场竞争力。
发明内容
本发明目的旨在针对现有技术中存在的问题，提供一种抗降解性明胶微球及其制备方法，所制备的明胶微球具备生理环境下的抗降解性，能够为组织构建，尤其是组织工程人工肝构建提供细胞载体。
本发明的另一目的旨在提供一种用于白酒安全性快速评价的人工肝模型及其构建方法，所构建的人工肝模型，血管化程度高，有利于人工肝模型的肝功能表达。
本发明的第三个目的旨在提供上述人工肝模型在白酒安全性评价中的应用。
本发明的第四个目的旨在提供上述人工肝模型在酒精性肝病治疗药物评价中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现。
本发明提供的抗降解性明胶微球的制备方法，其包括以下步骤：
(1)合成甲基丙烯酰胺化明胶
将甲基丙烯酸酐逐滴加入温度为45～70℃的明胶溶液中，滴加结束后，形成的反应体系于45～70℃下避光反应3～10h，避光反应过程中使用NaOH溶液调节反应体系的pH值为6～9；反应结束后利用有机溶剂析出沉淀；所得沉淀进一步经洗涤、透析、冷冻干燥得到冻干甲基丙烯酰胺化明胶；所述反应体系中甲基丙烯酸酐体积浓度为1～20％；
(2)制备预聚混合液
将光引发剂和冻干甲基丙烯酰胺化明胶依次溶解至PBS缓冲液中，配置成甲基丙烯酰胺化明胶终浓度为100～600mg/mL、光引发剂终浓度为1～20mg/mL的预聚混合液；
(3)制备抗降解性明胶微球
将乳化剂和分散剂混合均匀所得分散液加入至预聚混合液中，搅拌均匀得到混合乳状液，所得混合乳状液转移至0～4℃冰浴中继续搅拌至得到含有微球的混合液；于0～4℃条件下，含有微球的混合液紫外光照射得到含有光交联明胶微球的混合液；所得含有光交联明胶微球的混合液经离心分离、清洗、干燥得到抗降解明胶微球；所述分散液与预聚混合液的体积比为6:1。
上述步骤(1)中，所述明胶溶液中明胶质量浓度为50～500mg/mL，是由明胶溶解于45～70℃PBS缓冲液中配置而成；在优选实现方式中，所述明胶溶液中明胶质量浓度为100～200mg/mL，是由明胶溶解于50～70℃PBS缓冲液中配置而成。所述反应体系中甲基丙烯酸酐体积浓度为1～20％，优选为5～10％。避光反应过程中，使用浓度为2～10mol/L的NaOH溶液调节反应体系的pH值为6～9。反应结束后用于析出沉淀的有机溶剂可以为乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等中的一种。有机溶剂的使用量与上述反应体系体积相等。析出沉淀后的混合液首先经离心进行固液分离去除上清液；然后再使用无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等离心清洗3次以上。最后离心所得产物溶于去离子水中，于0～4℃条件下避光透析3～10天，以去除未反应的甲基丙烯酸酐。透析所得产物经冷冻干燥得到甲基丙烯酰胺化明胶。
上述步骤(2)中，预聚混合液配置过程为：将光引发剂溶解于45～70℃的PBS缓冲液中，配置成质量浓度为1～20mg/mL的光引发剂溶液；将冻干甲基丙烯酰胺化明胶溶解于上述45～70℃的光引发剂溶液中配置成甲基丙烯酰胺化明胶终浓度为100～600mg/mL、光引发剂终浓度为1～20mg/mL的预聚混合液。所述光引发剂为irgacure2959，irgacure184、irgacure127、irgacure500、irgacure651或rosebengal。
上述步骤(3)中，于50～80℃条件下，将乳化剂和分散剂按照体积比1：(600～60)混合均匀得到分散液；在优选实现方式中，所属乳化剂和分散剂的体积比为1：60～120。所述乳化剂为Span 80、Tween 80、蔗糖酯、脂肪酸甘油酯等中的一种。所述分散剂为玉米油、花生油、矿物油等中的一种。本发明中，所述乳化剂和分散剂机械搅拌2～5min即可。本发明中，所述分散液与预聚混合液的体积比约为6:1。将所得分散液加入至上述步骤(2)得到的45～70℃的预聚混合液后，于200～600rpm转速下搅拌1～5min得到混合乳状液。所得混合乳状液于0～4℃冰浴、200～600rpm转速下搅拌15min左右得到含有微球的混合液。含有微球的混合液使用紫外光(360～480nm波长、能量密度为8mW/cm2)照射20～50s，即得到含有光交联明胶微球的混合液。将含有光交联明胶微球的混合液加入到预冷的乙醇溶液中搅拌5～20min，以去除微球表面的乳化剂和分散剂，并防止微球间粘结；预冷的乙醇溶液一般为0～4℃；然后离心收集微球，并用丙酮、无水乙醇或/和乙醚等反复清洗数次后于空气中自然干燥，进一步经筛选得到100～400μm的抗降解明胶微球。
本发明进一步提供了一种人工肝模型的构建方法，其包括以下步骤：
(1)将抗降解明胶微球浸泡于PBS缓冲液；
(2)将浸泡后的无菌抗降解明胶微球置于培养板中；然后将经胰酶消化后的血管内皮细胞和肝细胞混合均匀后接种于无菌抗降解明胶微球表面；
(3)将接种细胞后的无菌抗降解明胶微球置于滤网中，并浸没入细胞培养基中培养得到组织工程人工肝模型。
上述步骤(1)中，首先将抗降解明胶微球经紫外照射灭菌(一般约30-60min)后，再使用通过0.22μm滤膜过滤后的无菌PBS缓冲液充分浸泡(一般浸泡过夜即可)。
上述步骤(2)中，血管内皮细胞(HUVECs)与肝细胞(LO2)的混合比例为1：(0.5～3)，优选为1：1。微球载体表面细胞的总体接种密度为1×105-1×108个细胞/毫升微球。
上述步骤(3)中，所述接种细胞后的无菌抗降解明胶微球一般于培养基中培养3～7天，载有细胞微球间由于细胞增殖融合而逐渐粘结组织成块，得到人工肝模型。本发明使用的细胞培养基为常规细胞培养基，例如DMEM培养基。
通过上述方法构建的人工肝模型，具有很好的生物相容性和细胞活性，而且由于明胶微球提供的类三维的培养界面显著促进HUVECs在其表面的粘附生长，从而使得人工肝模型的血管化程度很高，这将有助于人工肝模型的肝功能表达和长期体外应用。
本发明进一步提供了上述人工肝模型在白酒安全性评价中的应用，具体操作为：将人工肝模型从完全培养基中取出，置于添加了白酒的条件培养基(即在培养基中添加白酒，白酒体积浓度为1～10％)中继续培养12～72h，得到体外酒精性肝损伤模型。以细胞活性、脂肪合成、肝脏代谢能力等作为酒精性肝损伤评价指标，评估白酒的安全性。
本发明进一步提供了上述人工肝模型在酒精性肝病治疗药物评价中的应用，具体操作为：将得到的体外酒精性肝损伤模型从添加白酒的条件培养基(同上)中取出后，置于添加有治疗药物的另一种条件培养基(即在培养基中添加治疗药物)中继续培养7～14天，然后取出，考察药物添加前后人工肝模型中的细胞活性、脂肪合成、肝脏代谢能力，评价药物对酒精性肝病的治疗效果。上述药物可以是胆碱、蛋氨酸、磷脂、谷胱甘肽或表没食子儿茶素没食子酸酯等，条件培养基中的药物浓度为0.1～10mM。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的抗降解性明胶微球的制备方法，先合成甲基丙烯酰胺化改性明胶，然后进一步通过乳化制备微球，并进一步通过紫外光照射使明胶微球上接枝的甲基丙烯酰胺，发生自由基聚合反应，这样不仅使明胶微球具备生理环境下的抗降解性，并且通过调节甲基丙烯酰胺化程度和光照条件，能够实现微球降解速率的简单高效调控，为体外组织工程人工肝构建提供细胞载体。
(2)本发明通过光聚合共价交联改善明胶微球细胞载体生理环境下易降解的缺点，与现有技术中采用戊二醛、京尼平等交联技术相比，本发明所使用的光聚合交联具有优异的细胞相容性，所获得的抗降解明胶微球除可用于组织工程人工肝模型构建外，还可广泛用于其他类型细胞的粘附生长界面和其他组织仿生模拟，为再生医学提供新型功能化载体材料。
(3)本发明所制备的人工肝模型，以抗降解明胶微球为细胞载体，极大提升了人工肝模型的抗降解特性，且所获得的人工肝模型血管化程度高，有利于人工肝模型的肝功能表达和长期体外应用。
(4)本发明所制备的人工肝模型，接种血管内皮细胞和肝细胞的明胶微球，由于表面细胞不断增殖融合，能够进一步自发粘结组装形成人工肝模型。
(5)本发明所制备的人工肝模型，基于常规设备即可实现，简单高效；所用原材料无毒、环保，且具有良好的生物相容性和细胞活性，有利于实现工业化生产。
(6)本发明将体外工程化人工肝模型用于白酒质量鉴别与酒精性肝病治疗药物治疗效果评价的思想和方法，有利于建立快速、经济、有效的肝损伤评价模型，能显著改善现有的动物或体外细胞评价模型成本高、周期长、效率低的现状，从而降低白酒生产成本，降低产品潜在的安全风险，提高国内外市场竞争力。
附图说明
图1为实施例2制备的抗降解明胶微球的扫描电镜照片。
图2为不同甲基丙烯酰胺化程度明胶微球的降解速率曲线。
图3为HUVECs和LO2细胞接种于抗降解明胶微球表面体外培养3天后，经FDA/PI染色(a)和VECAD/DAPI染色(b)后的激光共聚焦照片。
图4为组织工程人工肝模型在含白酒的条件培养基中培养1天(a)，以及在含白酒的条件培养基中培养1天后置于含EGCG的条件培养基中继续培养7天(b)的FAS染色照片。
具体实施方式
拟结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。
以下实施例和应用例中使用的PBS缓冲液为(pH7.4的外购磷酸盐缓冲液)。上述PBS缓冲液还可以使用(Tris-盐酸缓冲液、Tris-磷酸盐缓冲液、氨基酸缓冲液)等替代。
实施例1
本实施例提供的抗降解明胶微球制备步骤如下：
(1)合成甲基丙烯酰胺化明胶
在搅拌条件下，称取20g明胶粉末溶解于50℃的100mLPBS缓冲液，配置成质量浓度为200mg/mL的明胶溶液；然后，将5mL甲基丙烯酸酐逐滴加入到上述明胶溶液中；形成的反应体系于60℃下避光反应5h；反应过程中不断使用2mol/L的NaOH溶液调节反应体系的pH值为8；反应结束后加入等体积的无水乙醇使沉淀析出，之后离心去除上清液，再用无水乙醇离心清洗3次。将最终离心产物溶于100mL去离子水，于4℃条件下使用去离子水避光透析7天以去除未反应的甲基丙烯酸酐，透析后所得产物经冷冻干燥得到冻干甲基丙烯酰胺化明胶。
(2)制备预聚混合液
将irgacure2959光引发剂溶解于60℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为10mg/mL的光引发剂溶液；然后，继续在60℃下，将冻干甲基丙烯酰胺化明胶溶解于上述光引发剂溶液中，配置成甲基丙烯酰胺化明胶终浓度为200mg/mL、光引发剂终浓度为10mg/mL的预聚混合液；
(3)制备抗降解性明胶微球
将1mLSpan 80加入至60℃的60mL玉米油中，以700rpm转速机械搅拌5min后，所得分散液迅速倒入至10mL上述预聚混合液中，300rpm下搅拌1.5分钟后得到混合乳状液；接着，将混合乳状液转移至4℃冰浴中快速冷却到4℃，于400rpm转速下继续搅拌15min得到含有微球的混合液；然后，继续在4℃下，使用8mW/cm2 UV光(365nm)照射混合液体系40s，得到含有光交联明胶微球的混合液；将含有光交联明胶微球的混合液加入到预冷的乙醇(4℃)溶液中搅拌10min，之后离心收集，并用丙酮反复清洗5次后，置于空气中自然干燥，筛选得到100～400μm粒径的干燥抗降解明胶微球。
实施例2
本实施例提供的抗降解明胶微球制备步骤如下：
(1)合成甲基丙烯酰胺化明胶
在搅拌条件下，称取10g明胶粉末溶解于60℃的100mLPBS缓冲液，配置成质量浓度为100mg/mL的明胶溶液；然后，将5mL甲基丙烯酸酐逐滴加入到上述明胶溶液中；形成的反应体系于60℃下避光反应3h；反应过程中不断使用5mol/L的NaOH溶液调节反应体系的pH值为8；反应结束后加入等体积的无水乙醇使沉淀析出，之后离心去除上清液，再用无水乙醇离心清洗3次。将最终离心产物溶于100mL去离子水，于4℃条件下使用去离子水避光透析5天以去除未反应的甲基丙烯酸酐，透析后所得产物经冷冻干燥得到冻干甲基丙烯酰胺化明胶。
(2)制备预聚混合液
将irgacure2959光引发剂溶解于70℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为5mg/mL的光引发剂溶液；然后，继续在70℃下，将冻干甲基丙烯酰胺化明胶溶解于上述光引发剂溶液中，配置成甲基丙烯酰胺化明胶终浓度为400mg/mL、光引发剂终浓度为5mg/mL的预聚混合液；
(3)制备抗降解性明胶微球
将0.5mLSpan 80加入至70℃的60mL玉米油中，以700rpm转速机械搅拌2min后，所得分散液迅速倒入至10mL上述预聚混合液中，350rpm下搅拌2分钟后得到混合乳状液；接着，将混合乳状液转移至0℃冰浴中快速冷却到0℃，于400rpm转速下继续搅拌15min得到含有微球的混合液；然后，继续在0℃下，使用8mW/cm2 UV光(365nm)照射混合液体系30s，得到含有光交联明胶微球的混合液；将含有光交联明胶微球的混合液加入到预冷的乙醇(0℃)溶液中搅拌10min，之后离心收集，并用丙酮反复清洗5次后，置于空气中自然干燥，筛选得到100～400μm粒径的干燥抗降解明胶微球。
实施例3
本实施例提供的抗降解明胶微球制备步骤如下：
(1)合成甲基丙烯酰胺化明胶
在搅拌条件下，称取10g明胶粉末溶解于60℃的100mLPBS缓冲液，配置成质量浓度为100mg/mL的明胶溶液；然后，将10mL甲基丙烯酸酐逐滴加入到上述明胶溶液中；形成的反应体系于60℃下避光反应3h；反应过程中不断使用5mol/L的NaOH溶液调节反应体系的pH值为8；反应结束后加入等体积的无水乙醇使沉淀析出，之后离心去除上清液，再用无水乙醇离心清洗3次。将最终离心产物溶于50mL去离子水，于4℃条件下使用去离子水避光透析3天以去除未反应的甲基丙烯酸酐，透析后所得产物经冷冻干燥得到冻干甲基丙烯酰胺化明胶。
(2)制备预聚混合液
将irgacure2959光引发剂溶解于60℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为5mg/mL的光引发剂溶液；然后，继续在60℃下，将冻干甲基丙烯酰胺化明胶溶解于上述光引发剂溶液中，配置成甲基丙烯酰胺化明胶终浓度为400mg/mL、光引发剂终浓度为5mg/mL的预聚混合液；
(3)制备抗降解性明胶微球
将0.5mLSpan 80加入至60℃的60mL玉米油中，以700rpm转速机械搅拌2min后，所得分散液迅速倒入至10mL上述预聚混合液中，350rpm下搅拌2分钟后得到混合乳状液；接着，将混合乳状液转移至4℃冰浴中快速冷却到4℃，于400rpm转速下继续搅拌15min得到含有微球的混合液；然后，继续在4℃下，使用8mW/cm2 UV光(365nm)照射混合液体系30s，得到含有光交联明胶微球的混合液；将含有光交联明胶微球的混合液加入到预冷的乙醇(4℃)溶液中搅拌10min，之后离心收集，并用丙酮反复清洗5次后，置于空气中自然干燥，筛选得到200～300μm粒径的干燥抗降解明胶微球。
实施例4
本实施例提供的抗降解明胶微球制备步骤如下：
(1)合成甲基丙烯酰胺化明胶
在搅拌条件下，称取5g明胶粉末溶解于45℃的100mLPBS缓冲液，配置成质量浓度为50mg/mL的明胶溶液；然后，将1mL甲基丙烯酸酐逐滴加入到上述明胶溶液中；形成的反应体系于45℃下避光反应3h；反应过程中不断使用10mol/L的NaOH溶液调节反应体系的pH值为8；反应结束后加入等体积的无水乙醇使沉淀析出，之后离心去除上清液，再用无水乙醇离心清洗3次。将最终离心产物溶于100mL去离子水，于0℃条件下使用去离子水避光透析7天以去除未反应的甲基丙烯酸酐，透析后所得产物经冷冻干燥得到冻干甲基丙烯酰胺化明胶。
(2)制备预聚混合液
将irgacure2959光引发剂溶解于70℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为1mg/mL的光引发剂溶液；然后，将冻干甲基丙烯酰胺化明胶溶解于上述光引发剂溶液中，配置成甲基丙烯酰胺化明胶终浓度为100mg/mL、光引发剂终浓度为1mg/mL的预聚混合液；
(3)制备抗降解性明胶微球
将0.1mLSpan 80加入至60℃的60mL玉米油中，以700rpm转速机械搅拌5min后，所得分散液迅速倒入至10mL上述预聚混合液中，300rpm下搅拌1.5分钟后得到混合乳状液；接着，将混合乳状液转移至4℃冰浴中快速冷却到4℃，然后于400rpm转速下继续搅拌15min得到含有微球的混合液；然后，于4℃下，使用8mW/cm2 UV光(365nm)照射混合液体系20s，得到含有光交联明胶微球的混合液；将含有光交联明胶微球的混合液加入到预冷的乙醇(4℃)溶液中搅拌10min，之后离心收集，并用无水乙醇反复清洗5次后，置于空气中自然干燥，筛选得到100～400μm粒径的干燥抗降解明胶微球。
实施例5
本实施例提供的抗降解明胶微球制备步骤如下：
(1)合成甲基丙烯酰胺化明胶
在搅拌条件下，称取50g明胶粉末溶解于70℃的100mLPBS缓冲液，配置成质量浓度为500mg/mL的明胶溶液；然后，将20mL甲基丙烯酸酐逐滴加入到上述明胶溶液中；形成的反应体系于70℃下避光反应10h；反应过程中不断使用5mol/L的NaOH溶液调节反应体系的pH值为8；反应结束后加入等体积的乙醚使沉淀析出，之后离心去除上清液，再用无水乙醇离心清洗3次。将最终离心产物溶于100mL去离子水，于4℃条件下使用去离子水避光透析7天以去除未反应的甲基丙烯酸酐，透析后所得产物经冷冻干燥得到冻干甲基丙烯酰胺化明胶。
(2)制备预聚混合液
将irgacure2959光引发剂溶解于60℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为20mg/mL的光引发剂溶液；然后，将冻干甲基丙烯酰胺化明胶溶解于上述光引发剂溶液中，配置成甲基丙烯酰胺化明胶终浓度为600mg/mL、光引发剂终浓度为20mg/mL的预聚混合液；
(3)制备抗降解性明胶微球
将0.5mL Tween80加入至60℃的60mL玉米油中，以700rpm转速机械搅拌2min后，所得分散液迅速倒入至10mL上述预聚混合液中，350rpm下搅拌2分钟后得到混合乳状液；接着，将混合乳状液转移至冰浴中快速冷却到(4℃)，然后于400rpm转速下继续搅拌15min得到含有微球的混合液；然后，于4℃下，使用8mW/cm2 UV光(365nm)照射混合液体系50s，得到含有光交联明胶微球的混合液；将含有光交联明胶微球的混合液加入到预冷的乙醚(4℃)溶液中搅拌10min，之后离心收集，并用乙醚反复清洗4次后，置于空气中自然干燥，筛选得到200～300μm粒径的干燥抗降解明胶微球。
实施例6
本实施例提供的人工肝模型制备步骤如下：
(1)将实施例3制备的抗降解明胶微球经紫外照射30min灭菌后，再放入经0.22μm滤膜过滤后的无菌PBS缓冲液浸泡过夜，然后离心去除上清液，置于4℃保存备用。
(2)经胰酶消化后的血管内皮细胞(HUVECs)和肝细胞(LO2)采用常规操作得到，具体为：将融合形成单层后的血管内皮细胞(HUVECs)和肝细胞(LO2)弃培养液，用PBS缓冲液洗涤1次，加入1mL 0.125％Trypsin胰蛋白酶消化液，消化细胞，待镜下见细胞开始皱缩变圆时，反复吹打使细胞完全脱壁后，加入1mL含血清的DMEM培养基(血清浓度为10％)终止消化，分别得到HUVECs和LO2的细胞悬液。
将浸泡后的无菌抗降解明胶微球置于非粘附性细胞培养板中；然后将经胰酶消化后的血管内皮细胞(HUVECs)和肝细胞(LO2)等量混合均匀后，以1×106个细胞/毫升微球的总体细胞密度接种于无菌抗降解明胶微球表面。
(3)将接种细胞后的无菌抗降解明胶微球置于0.4μmL滤网中，并浸没入DMEM细胞培养基中进行静态培养，3天后载细胞微球间逐渐粘结组装成块，得到组织工程人工肝模型。
实施例7
本实施例提供的人工肝模型制备步骤如下：
(1)将实施例2制备的抗降解明胶微球经紫外照射60min灭菌后，再放入经0.22μm滤膜过滤后的无菌PBS缓冲液浸泡过夜，然后离心去除上清液，置于4℃保存备用。
(2)经胰酶消化后的血管内皮细胞(HUVECs)和肝细胞(LO2)采用常规操作得到，具体为：将融合形成单层后的血管内皮细胞(HUVECs)和肝细胞(LO2)弃培养液，用PBS缓冲液洗涤1次，加入1mL 0.125％Trypsin胰蛋白酶消化液，消化细胞，待镜下见细胞开始皱缩变圆时，反复吹打使细胞完全脱壁后，加入1mL含血清DMEM培养基(血清浓度为10％)终止消化，分别得到HUVECs和LO2的细胞悬液。
将浸泡后的无菌抗降解明胶微球置于非粘附性细胞培养板中；然后将经胰酶消化后的血管内皮细胞(HUVECs)和肝细胞(LO2)等量混合均匀后，以1×107个细胞/毫升微球的总体细胞密度接种于无菌抗降解明胶微球表面。
(3)将接种细胞后的无菌抗降解明胶微球置于0.4μmL滤网中，并浸没入DMEM细胞培养基中进行静态培养，7天后载细胞微球间逐渐粘结组装成块，得到组织工程人工肝模型。
实施例8
本实施例提供的人工肝模型制备步骤如下：
(1)将实施例1制备的抗降解明胶微球经紫外照射30min灭菌后，再放入经0.22μm滤膜过滤后的无菌PBS缓冲液浸泡过夜，然后离心去除上清液，置于4℃保存备用。
(2)经胰酶消化后的血管内皮细胞(HUVECs)和肝细胞(LO2)采用常规操作得到，具体为：将融合形成单层后的血管内皮细胞(HUVECs)和肝细胞(LO2)弃培养液，用PBS缓冲液洗涤1次，加入1mL 0.125％Trypsin胰蛋白酶消化液，消化细胞，待镜下见细胞开始皱缩变圆时，反复吹打使细胞完全脱壁后，加入1mL含血清DMEM培养基(血清浓度为10％)终止消化，分别得到HUVECs和LO2的细胞悬液。
将浸泡后的无菌抗降解明胶微球置于非粘附性细胞培养板中；然后将经胰酶消化后的血管内皮细胞(HUVECs)和肝细胞(LO2)分别以1×106个细胞/毫升微球的细胞密度接种于无菌抗降解明胶微球表面；最后将接种细胞后的两种微球以等量体积混合均匀。
(3)将混合均匀后的无菌抗降解载细胞明胶微球置于0.4μmL滤网中，并浸没入DMEM细胞培养基中进行静态培养，5天后载细胞微球间逐渐粘结组装成块，得到组织工程人工肝模型。
应用例1
将实施例7得到的人工肝模型从细胞培养基中取出，置于添加白酒体积浓度为3％的条件培养基(即DMEM培养基中添加3％的白酒)中继续培养24h(条件培养基至少没过人工肝模型)，得到体外酒精性肝损伤模型。以细胞活性、脂肪合成、肝脏代谢能力等作为酒精性肝损伤评价指标，评估白酒的安全性。
应用例2
将实施例7得到的人工肝模型从完全培养基中取出，置于添加白酒体积浓度为3％的条件培养基(即DMEM培养基中添加3％的白酒)中继续培养24h(条件培养基至少没过人工肝模型)，得到体外酒精性肝损伤模型。然后，将上述得到的体外酒精性肝损伤模型从添加白酒的条件培养基中取出后，置于添加有1mM表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的另一种条件培养基(即DMEM培养基中添加1mM表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG))中继续培养7天(条件培养基至少没过体外酒精性肝损伤模型)，然后取出，考察药物添加前后人工肝模型中的细胞活性、脂肪合成、肝脏代谢能力，评价药物对酒精性肝病的治疗效果。
(一)抗降解明胶微球结构表征
为了检测抗降解明胶微球的成型性，对实施例2所制备的干燥抗降解明胶微球进行形貌分析，得到的扫描电镜照片如图1所示，从图中可以看出，获得的微球呈光滑球形，粒径分布在100～300μm左右，表明微球成型性良好。
为了考察甲基丙烯酰胺化改性对明胶微球降解性的影响，对未经甲基丙烯酰胺化处理的明胶微球(未经甲基丙烯酰胺化处理的明胶直接按照实施例1中步骤(2)-(3)制备得到)和实施例1中步骤(3)所得微球(分别命名为GEL和GMA)浸入PBS缓冲液中于37℃下孵育，在特定时间点(如图所示)取上清液通过BCA蛋白检测试剂盒分析明胶微球的降解情况，得到的降解曲线如图2所示，改性后得到的明胶微球降解率显著降低，表明通过甲基丙烯酰胺改性可以有效改善GMA微球的易降解性。
(二)人工肝模型性能分析
为了验证本发明提供的抗降解明胶微球能够用于组织工程人工肝的体外构建，对实施例6中体外培养3天后所得的微球组装体经FDA/PI染色和VECAD/DAPI染色后置于激光共聚焦显微镜下观察，得到的荧光照片如图3所示，细胞在微球表面表现出良好的增殖和粘附，微球间逐渐粘结聚集，并且表现出血管内皮钙粘蛋白(VECAD)高表达，表明本发明提供的抗降解明胶微球具有优良的细胞相容性，能够作为细胞载体，有利于血管化组织工程人工肝的体外构建。
(三)白酒安全性和酒精性肝病药物的治疗效果评价
为了验证本发明提供的抗降解明胶微球构建形成组织工程人工肝模型后，能够用于白酒安全性和酒精性肝病药物的治疗效果评价，对应用例1和应用例2获得的人工肝模型经脂肪酸合成酶(FAS)免疫荧光染色后，置于激光共聚焦显微镜下观察，得到的荧光照片如图4所示，人工肝模型在白酒添加的条件培养基中培养24h后，其FAS呈高表达；而后在EGCG添加的条件培养基中继续培养7天后，FAS表达显著降低，表明白酒能够一定程度上造成组织工程人工肝的肝损伤，而EGCG则有利于酒精性肝损伤的功能修复，适合作为白酒健康功能成分。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗降解性明胶微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)合成甲基丙烯酰胺化明胶
将甲基丙烯酸酐逐滴加入温度为45～70℃的明胶溶液中，滴加结束后，形成的反应体系于45～70℃下避光反应3～10h，避光反应过程中使用NaOH溶液调节反应体系的pH值为6～9；反应结束后利用有机溶剂析出沉淀；所得沉淀进一步经洗涤、透析、冷冻干燥得到冻干甲基丙烯酰胺化明胶；所述反应体系中甲基丙烯酸酐体积浓度为1～20％；
(2)制备预聚混合液
将光引发剂和冻干甲基丙烯酰胺化明胶依次溶解至PBS缓冲液中，配置成甲基丙烯酰胺化明胶终浓度为100～600mg/mL、光引发剂终浓度为1～20mg/mL的预聚混合液；
(3)制备抗降解性明胶微球
将乳化剂和分散剂混合均匀所得分散液加入至预聚混合液中，搅拌均匀得到混合乳状液，所得混合乳状液转移至0～4℃冰浴中继续搅拌至得到含有微球的混合液；于0～4℃条件下，含有微球的混合液紫外光照射得到含有光交联明胶微球的混合液；所得含有光交联明胶微球的混合液经离心分离、清洗、干燥得到抗降解明胶微球；所述分散液与预聚混合液的体积比为6:1。
2.根据权利要求1所述抗降解性明胶微球的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述明胶溶液中明胶质量浓度为50～500mg/mL，是由明胶溶解于45～70℃PBS缓冲液中配置而成。
3.根据权利要求1所述抗降解性明胶微球的制备方法，其特征在于步骤(2)中，预聚混合液配置过程为：将光引发剂溶解于45～70℃的PBS缓冲液中，配置成质量浓度为1～20mg/mL的光引发剂溶液；将冻干甲基丙烯酰胺化明胶溶解于上述45～70℃的光引发剂溶液中配置成甲基丙烯酰胺化明胶终浓度为100～600mg/mL、光引发剂终浓度为1～20mg/mL的预聚混合液；所述光引发剂为irgacure2959，irgacure184、irgacure127、irgacure500、irgacure651或rosebengal。
4.根据权利要求1所述抗降解性明胶微球的制备方法，其特征在于步骤(3)中，所述乳化剂和分散剂体积比为1：(600～60)；所述乳化剂为Span 80、Tween 80、蔗糖酯和脂肪酸甘油酯中的一种；所述分散剂为玉米油、花生油和矿物油中的一种。
5.权利要求1至4任一所述方法制备的抗降解性明胶微球。
6.一种人工肝模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将权利要求5所述的抗降解明胶微球浸泡于PBS缓冲液；
(2)将浸泡后的无菌抗降解明胶微球置于培养板中；然后将经胰酶消化后的血管内皮细胞和肝细胞混合均匀后接种于无菌抗降解明胶微球表面；
(3)将接种细胞后的无菌抗降解明胶微球置于滤网中，并浸没入细胞培养基中培养得到组织工程人工肝模型。
7.根据权利要求6所述的人工肝模型的构建方法，其特征在于步骤(2)中，血管内皮细胞与肝细胞的混合比例为1：(0.5～3)；微球载体表面细胞的总体接种密度为1×105-1×108个细胞/毫升微球。
8.权利要求6或7所述方法构建的人工肝模型。
9.权利要求8所述人工肝模型在白酒安全性评价中的应用。
10.权利要求8所述人工肝模型在酒精性肝病治疗药物评价中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114748676A (zh) * 2022-04-08 2022-07-15 四川大学 一种具有Janus结构的壳聚糖基高效止血剂、其制备方法及应用
WO2024005552A1 (ko) * 2022-06-28 2024-01-04 주식회사 딥바이오 젤라틴 마이크로 입자 제조방법

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160206780A1 (en) * 2014-08-15 2016-07-21 Suzhou Cancercell Biotechnology Co. Ltd Matrix Scaffold for Three-Dimensional Cell Cultivation, Methods of Construction Thereof and Uses Thereof
CN109810935A (zh) * 2017-11-20 2019-05-28 中国科学院大连化学物理研究所 细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法
CN109880151A (zh) * 2019-02-21 2019-06-14 上海市伤骨科研究所 一种水凝胶多孔微球的制备方法与多孔支架材料
CN111040199A (zh) * 2019-12-31 2020-04-21 华南理工大学 一种基于两个水相不互溶乳液的光交联多孔水凝胶及其制备方法和应用
CN112980009A (zh) * 2021-03-16 2021-06-18 华南理工大学 一种纳米复合多孔凝胶支架及其构建方法与应用
CN113018463A (zh) * 2021-03-24 2021-06-25 厦门大学 一种含放射性核素的医用天然高分子微球及其制备方法和用途
CN113041216A (zh) * 2021-03-26 2021-06-29 福州大学 一种用于肝癌治疗修复一体化的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160206780A1 (en) * 2014-08-15 2016-07-21 Suzhou Cancercell Biotechnology Co. Ltd Matrix Scaffold for Three-Dimensional Cell Cultivation, Methods of Construction Thereof and Uses Thereof
CN109810935A (zh) * 2017-11-20 2019-05-28 中国科学院大连化学物理研究所 细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法
CN109880151A (zh) * 2019-02-21 2019-06-14 上海市伤骨科研究所 一种水凝胶多孔微球的制备方法与多孔支架材料
CN111040199A (zh) * 2019-12-31 2020-04-21 华南理工大学 一种基于两个水相不互溶乳液的光交联多孔水凝胶及其制备方法和应用
CN112980009A (zh) * 2021-03-16 2021-06-18 华南理工大学 一种纳米复合多孔凝胶支架及其构建方法与应用
CN113018463A (zh) * 2021-03-24 2021-06-25 厦门大学 一种含放射性核素的医用天然高分子微球及其制备方法和用途
CN113041216A (zh) * 2021-03-26 2021-06-29 福州大学 一种用于肝癌治疗修复一体化的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZUOYING YUAN ET AL.: "Injectable GelMA Cryogel Microspheres for Modularized Cell Delivery and Potential Vascularized Bone Regeneration", 《SMALL》, pages 1 *
展翰翔;姚波;刘昌;刘亚雄;贺健康;李涤尘;吕毅;: "一种新型肝组织工程支架的制备及生物相容性评价", 第四军医大学学报, no. 19 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114748676A (zh) * 2022-04-08 2022-07-15 四川大学 一种具有Janus结构的壳聚糖基高效止血剂、其制备方法及应用
CN114748676B (zh) * 2022-04-08 2022-11-18 四川大学 一种具有Janus结构的壳聚糖基高效止血剂、其制备方法及应用
WO2024005552A1 (ko) * 2022-06-28 2024-01-04 주식회사 딥바이오 젤라틴 마이크로 입자 제조방법

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