WO2024005552A1 - 젤라틴 마이크로 입자 제조방법 - Google Patents

젤라틴 마이크로 입자 제조방법 Download PDF

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WO2024005552A1
WO2024005552A1 PCT/KR2023/009068 KR2023009068W WO2024005552A1 WO 2024005552 A1 WO2024005552 A1 WO 2024005552A1 KR 2023009068 W KR2023009068 W KR 2023009068W WO 2024005552 A1 WO2024005552 A1 WO 2024005552A1
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gelatin
aqueous
solution
oil
producing
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PCT/KR2023/009068
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홍진기
박소현
김지유
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주식회사 딥바이오
연세대학교 산학협력단
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    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
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    • A61K9/1682—Processes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing gelatin microparticles, and more specifically, to a method for producing gelatin microsphere (GMS) capable of rapid decomposition within 1 hour, which has not been previously reported.
  • GMS gelatin microsphere
  • Gelatin is a derivative obtained by acid or alkaline hydrolysis of collagen and is a safe natural polymer approved by the FDA.
  • Gelatin is a multi-polar material containing cations, anions, and hydrophobic groups in a ratio of 1:1:1, and is divided into Types A and B with different isoelectric points depending on processing conditions.
  • 13% are positively charged Lysine and Arginine
  • 12% are negatively charged Glutamic and Aspartic acids
  • the remaining chains are glycine, proline, and hydroxyproline. In this way, gelatin maintains the protein characteristics of collagen and is an amphipathic material, while also having excellent biocompatibility and biodegradability.
  • gelatin structures and characteristics provide high affinity and processability with other substances, and because of this, gelatin has been safely used in medicine, cosmetics, and food. Meanwhile, in order to use gelatin as a medical material, it must be optimized for the biological environment depending on the application area, treatment purpose, and function. However, because it is a difficult process to understand and control the behavior of gelatin in a complex biological environment, the conditions for gelatin in the field of medical materials are more stringent than in other fields and the possibility of commercialization is low. Therefore, research must be continuously conducted to optimize the functional activity, structural stability and decomposition rate of gelatin in vivo.
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to propose a strategy to control the decomposition rate of the produced gelatin particles by controlling the parameters affecting particle formation in the emulsion formation method for producing gelatin particles, and to provide a rapid decomposition rate at body temperature. To provide a method for producing medical gelatin particles that can be decomposed at a rapid rate.
  • the purpose of the present invention is to produce gelatin particles that, when injected into a blood vessel, move flexibly, reach parts of the body that require fast and accurate drug delivery, and rapidly decompose within 1 to 3 hours, thereby completing the drug delivery function.
  • the particles should have a size of 50 to 150 micrometers that do not block blood vessels, and an emulsion formation method that can control the decomposition behavior of gelatin particles can be established depending on the target area.
  • forming a water-oil emulsion by applying dropwise and stirring, cooling the formed water-oil emulsion into a gel while stirring, mixing cooled acetone into the gelated water-oil emulsion and stirring to form gelatin.
  • a method for producing gelatin microparticles is provided, including the steps of generating microparticles, filtering the generated gelatin microparticles, washing them with acetone to remove residual oil, and then naturally drying them.
  • the reaction temperature may be 4°C to 50°C.
  • the reaction temperature may be 25°C.
  • the step of preparing the aqueous gelatin solution may include adjusting the hydrogen ion concentration of the aqueous gelatin solution to a predetermined pH value in order to control the net charge of the gelatin chain in the emulsion reaction.
  • the pH value may be characterized as being between the initial hydrogen ion concentration of the aqueous gelatin solution (initial pH) and the hydrogen ion concentration of the isoelectric point of the aqueous gelatin solution.
  • the step of preparing the aqueous gelatin solution may include adding sodium chloride (NaCl) to the aqueous gelatin solution to control the net charge of the gelatin chains in the emulsion reaction.
  • NaCl sodium chloride
  • a strategy is proposed to control the decomposition rate of the generated gelatin microparticles by controlling the parameters affecting the formation of gelatin microparticles, and medical gelatin particles that can be decomposed at a rapid rate at body temperature are proposed.
  • a method for manufacturing can be provided.
  • gelatin particles that, when injected into a blood vessel, move flexibly, reach areas of the body that require fast and accurate drug delivery, and complete the drug delivery function by rapidly decomposing within 1 to 3 hours. There is a possible effect.
  • Figure 1 is a flow chart schematically showing a method for producing gelatin micro particles according to a preferred embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows visual images of three types of gelatin particles produced by the Water/Oil emulsion method for producing gelatin particles in ⁇ Experiment 1>.
  • Figure 3 is an SEM image showing the size and morphology of three types of gelatin particles according to oil temperature.
  • Figures 4 a) to c) show dispersed images of gelatin particles according to oil temperature
  • Figure 4 d) is a size dispersion graph when the oil temperature is 25°C
  • Figure 4 e) shows the oil temperature This is a size distribution graph at 4°C.
  • Figure 5 is an SEM image of gelatin particles formed from an aqueous gelatin solution maintained at an initial pH of 5.5 in ⁇ Experiment 2>.
  • Figure 6 is an SEM image of gelatin particles formed from an aqueous gelatin solution to which NaCl was added in ⁇ Experiment 2>.
  • Figure 7 shows dispersed images and size distribution graphs of gelatin particles formed from an aqueous gelatin solution to which NaCl was added.
  • Figure 8 shows an SEM image and a size dispersion graph of gelatin particles formed from an aqueous gelatin solution at pH 8.5, which is the pH of an aqueous gelatin solution under isoelectric point conditions.
  • Figure 9 is a graph showing the degree of decomposition of each gelatin particle derived from the BCA assay.
  • Terms such as first, second, etc. may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. Terms such as first, second, etc. do not indicate a particular order and are used only for the purpose of distinguishing one component from another component.
  • the present invention establishes a method for producing gelatin microparticles that can rapidly decompose within 1 to 3 hours and quickly deliver a precise amount of drug to a specific area of the body requiring treatment.
  • the principle of gelatin decomposition is hydration by heat. It is divided into decomposition and enzymatic decomposition. Enzymatic decomposition is decomposition that chemically destroys polypeptide bonds or other covalent bonds by enzymes. On the other hand, hydrolysis is affected by the environment in which gelatin is stored.
  • the present invention assumes that the hydrolysis of gelatin particles can be controlled by changing parameters such as oil temperature, pH, salt presence, and drying method in the water-in-oil emulsion (Water/Oil emulsion) method of producing particles. Perform.
  • the present invention establishes a strategy to control the size and morphology of gelatin particles according to oil temperature among the parameters of the emulsion method and to control the decomposition rate of gelatin particles by adjusting pH and adding salt. Since gelatin decomposes within 24 hours in a physiological environment, other existing literature mainly reported studies to slow down the decomposition of gelatin, and to date, no studies have been reported to produce gelatin that can be decomposed quickly within 1 to 3 hours. . Therefore, the present invention provides a gelatin particle platform that can flexibly pass through blood vessels with its fine size and smooth surface, reach the correct location, and then effectively release the drug to the area where rapid drug release is required.
  • Figure 1 is a flow chart schematically showing a method for producing gelatin micro particles according to a preferred embodiment of the present invention.
  • a process of preparing an aqueous gelatin solution is first performed (S100).
  • gelatin is dissolved in purified water and stirred to prepare an aqueous gelatin solution.
  • the aqueous gelatin solution prepared at this time may have a concentration of 5.55 wt%, but is not limited thereto, and may have a concentration ranging from 2 to 10 wt%.
  • the concentration of the aqueous gelatin solution affects the size of the gelatin, and the concentration in the above range is an appropriate concentration for producing gelatin particles of the size intended by the present invention.
  • the prepared aqueous gelatin solution may be preheated to 45°C.
  • the pH value is the initial hydrogen ion of the aqueous gelatin solution. It may be any one of the initial pH or the hydrogen ion concentration of the isoelectric point of the aqueous gelatin solution. Specifically, the initial hydrogen ion concentration of the aqueous gelatin solution is about pH 5.5, and the hydrogen ion concentration of the isoelectric point of the aqueous gelatin solution is about pH 8.5.
  • the process of preparing the aqueous gelatin solution may further include adding sodium chloride (NaCl).
  • NaCl sodium chloride
  • the sodium chloride added may have a concentration of 1.5 wt%.
  • the method for producing gelatin micro particles according to an embodiment of the present invention may include the process of preparing oil at a predetermined reaction temperature (S110). At this time, the reaction temperature may be 4°C to 50°C. The reaction temperature is the temperature of the prepared oil,
  • the oil may preferably be olive oil, and an embodiment in which the oil is olive oil will be described below.
  • the technical idea of the present invention is not limited thereto, and various types of oils other than olive oil may be used. .
  • the prepared gelatin aqueous solution is added dropwise to the olive oil and steered to form a water-in-oil emulsion (S120). More specifically, the gelatin solution was added dropwise to the oil where the reaction temperature was maintained and stirred at 500 rpm for 10 minutes. At this time, the ratio of added gelatin and oil may be fixed at 1:10.
  • a process of cooling the formed water-oil emulsion into a gel while steering is performed (S130). More specifically, the formed water-oil emulsion is slowly cooled to 4°C to gel, and the water-oil emulsion is gelled while steering is maintained for 30 minutes.
  • cooled acetone is mixed with the gelled water-oil emulsion and stirred to generate gelatin micro-particles (S140). More specifically, the gelled water-oil emulsion is mixed with cooled acetone and stirred for 1 hour. Afterwards, cooled acetone is further mixed and steered at 1000 rpm for 5 minutes.
  • the generated gelatin micro particles are collected, washed with acetone to remove residual oil, and then naturally dried (S150).
  • parameters such as the reaction temperature of the oil, the pH of the aqueous gelatin solution, and/or the presence or absence of sodium chloride can be adjusted. That is, the parameters can be appropriately adjusted so that gelatin microparticles with appropriate characteristics can be produced depending on the purpose of the gelatin microparticles produced by the present invention.
  • the gelatin microparticles with certain characteristics will be described by adjusting these parameters. I would like to check whether is created.
  • the decomposition experiment of gelatin particles is conducted by placing 12 mg of particles in 3 mL of 1X phosphate buffered saline (1X PBS) and then storing them in a cell culture incubator for a specific time. At each time point of gelatin decomposition, 1
  • Figure 2 shows visual images of three types of gelatin particles produced by the Water/Oil emulsion method for producing gelatin particles in ⁇ Experiment 1>.
  • Numbers 1, 2, and 3 are visual images of gelatin particles when the oil temperature is adjusted to 25°C, 50°C, and 4°C, respectively.
  • the temperature of the oil was 25°C (No. 1), 50°C (No. 2), and 4°C (No. 3).
  • the shape of the gelatin particles produced in each group is significantly different.
  • Figure 3 is an SEM image showing the size and morphology of three types of gelatin particles according to oil temperature (i.e., 25°C, 50°C, 4°C). This can be obtained by observing three types of gelatin particles according to oil temperature with a scanning electron microscope (SEM).
  • SEM scanning electron microscope
  • the dried particle size is 10 to 200 ⁇ m, and it can be seen that it is generally spherical and has a relatively smooth surface, while sample No. 2 (50°C) has a spherical shape and a relatively smooth surface.
  • the dried particle size is 10 to 50 ⁇ m, has an irregular shape, and exists in an unstable form by agglomerating.
  • the dried particle size was 100 to 600 ⁇ m, and an overall spherical and wrinkled surface was observed.
  • the temperature of the oil is the reaction temperature at which gelatin particles are formed, and by controlling this, the size and shape of the gelatin particles change.
  • gelatin depending on the temperature, it exists in a random coil (above 40°C), alpha helix (approximately 37°C), and triple helix structure (below 30°C), so the above results are due to the thermodynamic stability of the gelatin structure depending on the oil temperature. It is judged that
  • Figures 4 a) to c) show dispersed images of gelatin particles depending on oil temperature.
  • Figure 4 a) shows a case where the oil temperature is 25°C
  • b) shows a case where the oil temperature is 50°C
  • c) shows a case where the oil temperature is 4°C.
  • 4 a) to c) can be obtained by observing gelatin micro particles dispersed in water with an optical microscope.
  • Figure 4d) is a size distribution graph when the oil temperature is 25°C
  • Figure 4e) is a size distribution graph when the oil temperature is 4°C.
  • samples 1 (25°C) and 3 (4°C) were stably dispersed in water and maintained the shape of the particles without agglomeration, whereas sample 2 formed at 50°C It can be seen that the burnt sample agglomerates and loses its particle shape. Meanwhile, the average size of the hydrated sample No. 1 was measured to be about 130 ⁇ m, and the average size of sample No. 4 was measured to be about 481 ⁇ m. Considering the diameter of the blood vessel, it is believed that sample No. 1 is suitable for a vascular injection drug delivery system.
  • Figure 5 is an SEM image of gelatin particles formed from an aqueous gelatin solution maintained at an initial pH of 5.5 in ⁇ Experiment 2>.
  • the size of gelatin particles formed from a gelatin aqueous solution at pH 5.5 is 10 to 200 ⁇ m and is generally spherical. Although it has a relatively smooth surface, it is believed that fine pores exist, making it easy for water molecules to penetrate, and thus rapid hydrolysis can occur. Also, considering that the type of gelatin used is type A and its isoelectric point is pH 7 to 9, it can be seen that the gelatin particles have a weak net charge. Meanwhile, the hydrated form and size distribution of gelatin microparticles produced from a gelatin aqueous solution at pH 5.5 are shown in a) and d) of Figure 4, respectively.
  • Figure 6 is an SEM image of gelatin particles formed from an aqueous gelatin solution to which NaCl was added in ⁇ Experiment 2>.
  • the size of hydrated gelatin particles formed from an aqueous gelatin solution to which 1.5 wt% of NaCl was added was 10 to 200 ⁇ m and was generally spherical.
  • the surface was covered with NaCl, which appears to cause charge screening of the gelatin particles, increasing inter-particle stability and affecting the interaction between the gelatin particles and water molecules, thereby causing charge screening of the gelatin particles.
  • the degree of hydrolysis may vary.
  • Figure 7 shows dispersed images and size segmentation graphs of gelatin particles formed from an aqueous gelatin solution to which NaCl was added.
  • gelatin particles to which NaCl has been added are stably dispersed in water and maintain their particle shape without agglomeration. Additionally, the average size when hydrated was measured to be about 123 ⁇ m, and considering that the average size of hydrated sample No. 1 (initial pH 5.5) was about 130 ⁇ m, it can be seen that the addition of NaCl does not have a significant effect on the particle size. You can.
  • Figure 8 shows an SEM image and a size dispersion graph of gelatin particles formed from an aqueous gelatin solution at pH 8.5, which is the pH of an aqueous gelatin solution under isoelectric point conditions.
  • gelatin particles formed from a gelatin aqueous solution at pH 8.5 also had a size of 10 to 200 ⁇ m like the other particles above, but various shapes such as spheres, disks, and cylinders were observed. Because the net charge of gelatin is close to 0 under isoelectric point conditions, this is related to the stabilization of hydrogen bonds within the gelatin structure. Additionally, the various shapes of gelatin particles can be assumed to be due to instability due to the difference in surface energy between different crystal planes, which is also a factor that can affect the decomposition rate of gelatin particles.
  • Figure 9 is a graph showing the degree of decomposition of each gelatin particle derived from the BCA assay. Assuming that gelatin particles would be completely decomposed after 24 hours in a physiological environment, the degree of decomposition of each gelatin after 24 hours of the decomposition experiment was set to 100% and the degree of decomposition over time was evaluated accordingly.
  • the oil temperature was set to 25°C, where gelatin microparticles of an appropriate size capable of decomposition within 1 hour were formed, and a gelatin aqueous solution without NaCl added at pH 5.5 was completely decomposed at a rapid rate.
  • the most effective gelatin particles for drug release can be manufactured.
  • the present invention can be used in a method for producing gelatin micro particles.

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Abstract

빠른 분해가 가능한 젤라틴 마이크로 입자(Gelatin MicroSphere; GMS)를 제조하는 방법이 개시된다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 젤라틴 수용액을 제조하는 단계-여기서, 상기 젤라틴 수용액은 2wt% 내지 10wt% 농도이며, 45℃로 예열됨-, 상기 젤라틴 수용액을 소정의 반응 온도의 올리브 오일에 드롭와이즈(dropwise)로 가하고 스티어링(stirring)하여 워터 오일 에멀전을 형성하는 단계, 형성된 워터 오일 에멀전을 스티어링하면서 냉각하여 겔(gel)화하는 단계, 겔화된 워터 오일 에멀전에 냉각된 아세톤을 혼합하고 스티어링하여 젤라틴 마이크로 입자를 생성하는 단계 및 생성된 젤라틴 마이크로 입자를 여과하고 아세톤으로 세척하여 잔류 오일을 제거한 후 자연건조하는 단계를 포함하는 젤라틴 마이크로 입자 제조 방법이 제공된다.

Description

젤라틴 마이크로 입자 제조방법
본 발명은 젤라틴 마이크로 입자 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기존에 보고되지 않았던 1 시간 이내의 빠른 분해가 가능한 젤라틴 마이크로 입자(Gelatin MicroSphere; GMS)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
젤라틴은 콜라겐의 산 또는 알칼리 가수분해에 의해 얻어진 유도체로서 FDA 로부터 승인된 안전한 천연 고분자이다. 젤라틴은 양이온, 음이온 및 소수성 그룹을 1:1:1 로 포함한 다중 양극성 물질이며 가공 조건에 따라 등전점이 다른 Type A 와 B 로 나뉜다. 젤라틴을 이루는 아미노산 서열 중 13%는 양전하를 갖는 Lysine과 Arginine, 12%는 음전하를 갖는 Glutamic과 Aspartic acid, 나머지 사슬은 glycine, proline 및 hydroxyproline이다. 이처럼 젤라틴은 콜라겐의 단백질 특성을 유지하면서 양극성 물질인 동시에 우수한 생체적합성과 생분해성을 갖는다. 이러한 젤라틴 구조 및 특징은 다른 물질과의 높은 친화성과 가공성을 제공하고 이로 인해 젤라틴은 의약품, 화장품 및 식품 등에 안전하게 사용되어 왔다. 한편, 젤라틴을 의료용 재료로 사용하기 위해서는 적용 부위와 치료 목적 및 기능에 따라 생체 환경에 최적화되어야 한다. 하지만 복잡한 생체 환경에서 젤라틴의 거동을 파악하고 제어하는 것은 어려운 과정이기 때문에 의료용 재료 분야에서의 젤라틴은 다른 분야에 비해 조건이 까다롭고 상용화 가능성이 낮다. 따라서 생체 내 젤라틴의 기능 활성 구조 안정성 및 분해 속도를 최적화하기 위한 연구가 지속적으로 수행되어야 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적인 과제는 젤라틴 입자를 제조하기 위한 에멀젼 형성 방법에서 입자 형성에 영향을 미치는 파라미터를 제어함으로써 생성된 젤라틴 입자의 분해속도를 제어할 수 있는 전략을 제시하고, 체내 온도에서 빠른 속도로 분해가 가능한 의료용 젤라틴 입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 혈관에 주입되었을 때 유연한 이동을 통해 빠르고 정확한 약물 전달이 필요한 체내 부위에 도달하여 1 시간 내지 3 시간 이내에 급속히 분해됨으로써 약물 전달 기능을 완수하는 젤라틴 입자를 제조하는 것을 목적으로 한다. 이 때의 입자는 혈관을 막지 않는 50 내지 150 마이크로미터의 크기이어야 하며 목적으로 하는 부위에 따라 젤라틴 입자의 분해 거동을 제어할 수 있는 에멀젼 형성 방법이 확립될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 젤라틴 수용액을 제조하는 단계-여기서, 상기 젤라틴 수용액은 2wt% 내지 10wt% 농도이며, 45℃로 예열됨-, 상기 젤라틴 수용액을 소정의 반응 온도의 올리브 오일에 드롭와이즈(dropwise)로 가하고 스티어링(stirring)하여 워터 오일 에멀전을 형성하는 단계, 형성된 워터 오일 에멀전을 스티어링하면서 냉각하여 겔(gel)화하는 단계, 겔화된 워터 오일 에멀전에 냉각된 아세톤을 혼합하고 스티어링하여 젤라틴 마이크로 입자를 생성하는 단계 및 생성된 젤라틴 마이크로 입자를 여과하고 아세톤으로 세척하여 잔류 오일을 제거한 후 자연건조하는 단계를 포함하는 젤라틴 마이크로 입자 제조 방법이 제공된다.
일 실시예에서, 상기 반응 온도는 4℃ 내지 50℃ 인 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 반응 온도는 25℃ 인 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 젤라틴 수용액을 제조하는 단계는, 에멀전 반응에서의 젤라틴 사슬의 알짜 전하를 조절하기 위하여 상기 젤라틴 수용액의 수소 이온 농도를 소정의 pH 수치가 되도록 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 pH 수치는, 젤라틴 수용액의 초기 수소 이온 농도(initial pH) 내지 젤라틴 수용액의 등전점(isoelectric point)의 수소 이온 농도인 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 젤라틴 수용액을 제조하는 단계는, 에멀전 반응에서의 젤라틴 사슬의 알짜 전하를 조절하기 위하여 상기 젤라틴 수용액에 염화 나트륨(NaCl)을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 기술적 사상에 의하면, 젤라틴 마이크로 입자 형성에 영향을 미치는 파라미터를 제어함으로써 생성된 젤라틴 마이크로 입자의 분해속도를 제어할 수 있는 전략을 제시하고, 체내 온도에서 빠른 속도로 분해가 가능한 의료용 젤라틴 입자를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에 의하면, 혈관에 주입되었을 때 유연한 이동을 통해 빠르고 정확한 약물 전달이 필요한 체내 부위에 도달하여 1 시간 내지 3 시간 이내에 급속히 분해됨으로써 약물 전달 기능을 완수하는 젤라틴 입자를 제조할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 상세한 설명에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 의하여 구성되는 젤라틴 마이크로 입자 제조방법을 개략적으로 도시한 흐름도이다.
도 2는 <실험 1>의 젤라틴 입자 제조를 위한 Water/Oil 에멀젼 방법에 의해 제조된 세 종류의 젤라틴 입자의 육안 이미지를 나타낸다.
도 3은 오일 온도에 따른 세 종류의 젤라틴 입자의 크기 및 모폴로지(Morphology)를 보여주는 SEM 이미지이다.
도 4의 a) 내지 c)는 오일 온도에 따른 젤라틴 입자들의 분산된 이미지를 나타내며, 도 4의 d)는 오일 온도가 25℃인 경우의 크기 분산 그래프이며, 도 4의 e)는 오일 온도가 4℃인 경우의 크기 분산 그래프이다.
도 5는 <실험 2>에서 초기 pH 5.5를 유지한 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자의 SEM 이미지이다.
도 6은 <실험 2>에서 NaCl 이 첨가된 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자의 SEM 이미지이다.
도 7은 NaCl이 첨가된 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자의 분산된 이미지와 크기 분포 그래프를 나타낸다.
도 8은 등전점 조건의 젤라틴 수용액의 pH인 pH 8.5의 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자의 SEM 이미지와 크기 분산 그래프를 나타낸다.
도 9는 BCA assay로부터 도출된 각 젤라틴 입자의 분해 정도를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 제1, 제2 등의 용어는 특별한 순서를 나타내는 것이 아니며, 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 명세서에 있어서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예들을 중심으로 본 발명을 상세히 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조부호는 동일한 부재를 나타낸다.
본 발명에서는 1 시간 내지 3 시간 내로 빠른 분해가 발생하여 치료가 필요한 체내의 특정 부위에 정확한 양의 약물을 빠르게 전달할 수 있는 젤라틴 마이크로 입자를 제조하기 위한 방법을 확립한다 젤라틴의 분해 원리는 열에 의한 가수분해와 효소적 분해로 나뉜다 효소적 분해는 효소에 의해 폴리펩타이드 결합이나 다른 공유결합을 화학적으로 파괴시키는 분해이다. 반면 가수 분해의 경우에는 젤라틴이 보관되는 환경에 영향을 받는다. 이러한 점을 고려하여 젤라틴 입자의 가수분해는 입자를 제조하는 워터 인 오일 에멀전(Water/Oil emulsion) 방법에서 오일 온도 pH, Salt 유무 및 건조 방법 등의 파라미터를 변경하여 제어될 수 있다는 가정하에 본 발명을 수행한다. 본 발명은 에멀전 방법의 파라미터 중 오일 온도에 따라 젤라틴 입자의 크기와 모폴로지를 제어하고 pH 조절 및 Salt 첨가에 의해 젤라틴 입자의 분해 속도를 제어하는 전략을 세운다. 젤라틴은 생리적 환경에서 24 시간 이내로 분해되기 때문에 기존의 타 문헌들은 젤라틴의 분해를 늦추기 위한 연구들을 주로 보고하였으며 현재까지 1 시간 내지 3 시간 내로 빠른 분해가 가능한 젤라틴을 제조하기 위한 연구들은 보고된 바가 없다. 따라서 본 발명은 미세한 크기와 매끈한 표면으로 혈관을 유연하게 통과하여 정확한 위치에 도달 후 빠른 약물 방출이 필요한 부위에 약물을 효과적으로 방출할 수 있는 젤라틴입자 플랫폼을 제공한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 의하여 구성되는 젤라틴 마이크로 입자 제조방법을 개략적으로 도시한 흐름도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 젤라틴 마이크로 입자 제조방법에서는, 먼저 젤라틴 수용액을 제조하는 과정이 수행된다(S100). 일 실시예에서는, 정제수에 젤라틴을 용해시키고 교반하여 젤라틴 수용액을 제조한다. 이때 제조된 젤라틴 수용액은 5.55w% 농도일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 2 내지 10 wt% 범위의 농도일 수 있다. 젤라틴 수용액의 농도는 젤라틴 크기에 영향을 주며, 위 범위의 농도는 본 발명이 의도하는 크기의 젤라틴 입자를 제조하기에 적당한 농도이기 때문이다. 또한 본 공정(S100)에서는 제조된 젤라틴 수용액은 45℃로 예열된 상태일 수 있다.
한편 실시예에 따라서는 젤라틴 수용액을 제조하는 과정에서는 상기 젤라틴 수용액의 수소 이온 농도를 소정의 pH 수치가 되도록 조절하는 과정이 더 수행될 수 있으며, 이때, 상기 pH 수치는, 젤라틴 수용액의 초기 수소 이온 농도(initial pH) 내지 젤라틴 수용액의 등전점(isoelectric point)의 수소 이온 농도 중 어느 하나의 값일 수 있다. 구체적으로 젤라틴 수용액의 초기 수소 이온 농도는 pH 5.5정도이며, 젤라틴 수용액의 등전점의 수소 이온 농도는 pH 8.5정도이다.
한편, 실시예에 따라서는 젤라틴 수용액을 제조하는 과정에서는 염화나트륨(NaCl)을 첨가하는 과정이 더 포함될 수도 있다. 이때 첨가되는 염화나트륨은 1.5wt% 농도일 수 있다.
한편, 또한 본 발명의 일 실시예에 따른 젤라틴 마이크로 입자 제조방법은 소정의 반응 온도의 오일 준비하는 과정을 포함할 수 있다(S110). 이때, 상기 반응 온도는 4℃ 내지 50℃일 수 있다. 상기 반응 온도는 준비된 오일의 온도이다,
상기 오일은 바람직하게는 올리브 오일일 수 있으며, 이하에서는 상기 오일이 올리브 오일인 실시예 예를 설명하지만 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니며 올리브 오일 외 다양한 종류의 오일이 사용될 수 있음은 물론이다.
젤라틴 수용액 및 소정의 반응 온도를 가지도록 조절된 올리브 오일이 준비되면, 제조된 젤라틴 수용액을 상기 올리브 오일에 드롭와이즈(dropwise)로 가하고 스티어링하여 워터 인 오일 에멀전을 형성한다(S120). 보다 구체적으로는 젤라틴 용액을 상기 반응 온도가 유지되는 오일에 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하고 500rpm 에서 10분 동안 스티어링(stirring)한다. 이때, 첨가된 젤라틴과 오일의 비율은 1:10로 고정될 수 있다.
이후 형성된 워터 오일 에멀전을 스티어링하면서 냉각하여 겔(gel)화하는 과정이 수행된다(S130). 보다 구체적으로는 형성된 워터 오일 에멀전을 4℃로 천천히 냉각하여 겔화시키며 30 분 동안 스티어링을 유지하면서 워터 오일 에멀전을 겔화한다.
이후 겔화된 워터 오일 에멀전에 냉각된 아세톤을 혼합하고 스티어링하여 젤라틴 마이크로 입자를 생성한다(S140). 보다 상세하게는 겔화된 워터 오일 에멀전을 냉각된 아세톤과 혼합하여 1 시간 동안 스티어링 한다. 이후 냉각된 아세톤을 추가로 혼합하여 1000rpm에서 5 분 동안 스티어링한다.
이후 생성된 젤라틴 마이크로 입자를 통해 모으고 아세톤으로 세척하여 잔류 오일을 제거한 후 자연 건조하는 과정을 수행한다(S150).
앞서 살펴본 바와 같이, 이제, 본 발명에서 제안하는 젤라틴 마이크로 입자 제조방법에서는 오일의 반응 온도, 젤라틴 수용액의 pH 및/또는 염화나트륨 첨가 유무와 같은 파라미터가 조절될 수 있다. 즉 본 발명에 의해 제조되는 젤라틴 마이크로 입자의 용도에 따라 그에 맞는 특징을 가지는 젤라틴 마이크로 입자가 생성될 수 있도록 적절히 파라미터가 조절될 수 있는데, 이하에서는 이러한 파라미터들이 조절됨으로 인해 어떠한 특성을 가지는 젤라틴 마이크로 입자가 생성되는지를 확인해 보고자 한다.
<실험 1> 오일 온도가 제어된 Water/Oil emulsion 방법으로 형성된 젤라틴 입자 분석: 먼저 45℃ 로 예열된 5.55wt% 젤라틴 용액을 준비한다. 이어서 5℃, 25℃ 및 44℃의 올리브 오일을 각각 준비한다 젤라틴 용액을 각 온도의 오일에 dropwise로 가하고 500rpm 에서 10분 동안 스티어링한다 이때, 첨가된 젤라틴과 오일의 비율은 1:10 으로 고정한다 그 다음, 4℃로 천천히 냉각하여 겔화시키며 30 분 동안 스티어링을 유지한 후, 냉각된 아세톤과 혼합하여 1 시간 동안 stirring 한다 이 후 냉각된 아세톤을 추가로 혼합하여 1000rpm 에서 5 분 동안 stirring 한다 생성된 마이크로 입자를 여과를 통해 모으고 아세톤으로 세척하여 잔류 오일을 제거한 후 자연 건조한다.
<실험 2> pH 및 Salt 조건이 제어된 Water/Oil emulsion 방법으로 형성된 젤라틴 입자 분석: 먼저 세 종류의 5.55 wt% 젤라틴 (Gelatin, 주 삼미산업 용액을 준비한다 첫 번째는 pH 를 조절하지 않은 즉 초기 pH 를 유지하는 젤라틴 용액, 두 번째는 용액의 pH 를 등전점(Isoelectric point)까지 조절한 젤라틴 용액, 세 번째는 NaCl을 첨가한 젤라틴 용액이다. 세 종류의 용액 모두 45℃ 로 예열 되어 준비된다. 또한 25℃의 올리브 오일을 준비한다. 준비된 각 젤라틴 용액을 올리브 오일에 드롭와이즈로 가하고 500rpm 에서 10분 동안 스티어링한다. 이 때, 첨가된 젤라틴과 오일의 비율은 1:10로 고정한다. 그 다음, 4℃로 천천히 냉각하여 겔화시키며, 30분 동안 스티어링을 유지한 후, 냉각된 아세톤과 혼합하여 1 시간 동안 스티어링 한다. 이후 냉각된 아세톤을 추가로 혼합하여 1000rpm 에서 5 분 동안 스티어링한다. 생성된 마이크로 입자를 여과를 통해 모으고 아세톤으로 세척하여 잔류 오일을 제거한 후 자연 건조한다.
한편, 각 실험을 완료한 후에는 광학 현미경과 주사전자현미경을 통해 입자의 크기와 형태를 분석하고 Bicinchoninic acid (BCA) assay를 통해 분해도를 측정한다. 젤라틴 입자의 분해실험은 12 mg의 입자를 3mL 의 1X phosphate buffered saline (1X PBS)에 넣은 후, 세포 배양 인큐베이터에 특정 시간 동안 보관되어 진행된다. 젤라틴 분해가 진행된 각 시점에서의 1X PBS 를 원심 분리기로 처리하여 남아있는 젤라틴 입자를 분리한 상층액의 용액을 떠서 BCA assay 를 진행한다.
도 2는 <실험 1>의 젤라틴 입자 제조를 위한 Water/Oil 에멀젼 방법에 의해 제조된 세 종류의 젤라틴 입자의 육안 이미지를 나타낸다. 1번, 2번, 3번은 각각 오일의 온도를 25℃, 50℃, 4℃로 조절했을 때의 젤라틴 입자의 육안 이미지이다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 위 <실험 1>과 같은 젤라틴 입자 제조를 위한 Water/Oil 에멀젼 방법에서 오일의 온도를 25℃(1번) 50℃(2번), 4℃(3번)로 다르게 설정하였을 때 각 그룹에서 제조된 젤라틴 입자의 형태가 현저히 다른 것을 알 수 있다.
도 3은 오일 온도(즉, 25℃, 50℃, 4℃)에 따른 세 종류의 젤라틴 입자의 크기 및 모폴로지(Morphology)를 보여주는 SEM 이미지이다. 이는 오일 온도에 따른 세 종류의 젤라틴 입자를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 관찰함으로써 획득할 수 있다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1번 샘플(25℃)의 경우 건조된 입자 크기는 10~200 μm 로 전반적으로 구형이며 비교적 매끄러운 표면을 가지는 것을 확인할 수 있으며, 2번 샘플(50℃)의 경우, 건조된 입자 크기는 10~50 μm 로 불규칙적인 모양을 가지며 응집되어 불안정한 형태로 존재함을 확인할 수 있다. 3번 샘플의 경우, 건조된 입자 크기는 100~600μm로 전반적으로 구형이며 주름진 형태의 표면이 관찰된다.
결과적으로, 에멀젼 기법에서 오일의 온도는 젤라틴 입자가 형성되는 반응 온도이며 이를 제어함으로써 젤라틴 입자의 크기 및 형태가 달라지는 것을 알 수 있다. 젤라틴의 경우 온도에 따라 Random coil(40℃ 이상), 알파 helix(약 37℃) 및 삼중 나선 구조(30℃ 이하)로 존재하기 때문에 위의 결과는 오일 온도에 따른 젤라틴 구조의 열역학적 안정성에 기인한 것으로 판단된다.
도 4의 a) 내지 c)는 오일 온도에 따른 젤라틴 입자들의 분산된 이미지를 나타낸다. 도 4의 a)는 오일 온도가 25℃인 경우이고, b)는 오일 온도가 50℃인 경우이며, c)는 오일 온도가 4℃인 경우이다. 도 4의 a) 내지 c)는 수중에 분산된 젤라틴 마이크로 입자를 광학현미경으로 관찰하여 확보할 수 있다. 도 4의 d)는 오일 온도가 25℃인 경우의 크기 분산(size distribution) 그래프이며, 도 4의 e)는 오일 온도가 4℃인 경우의 크기 분산 그래프이다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1번 샘플(25℃)과 3번 샘플(4℃)의 경우, 수중에서 안정적으로 분산이 잘 되었으며 응집 없이 입자의 형태를 유지한 반면, 50℃ 에서 형성된 2번 샘플은 응집되어 입자의 형태를 잃음을 확인할 수 있다. 한편, 수화된 1번 샘플의 평균 크기는 약 130μm, 4번 샘플의 평균 크기는 약 481μm 로 측정되었으며, 혈관의 직경을 고려하였을 때 1번 샘플이 혈관 주입 약물 전달 시스템에 적합할 것으로 판단된다.
도 5는 <실험 2>에서 초기 pH 5.5를 유지한 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자의 SEM 이미지이다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, pH 5.5 의 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자의 크기는 10~200μm 로 전반적으로 구형이다. 비교적 매끈한 표면을 가졌지만 미세한 기공이 존재하여 물 분자의 침투가 용이하고 이에 따라 빠른 가수분해가 발생할 수 있을 것이라 판단된다. 또한 사용된 젤라틴의 유형은 type A 이고 이의 등전점이 pH 7~9 인 것을 고려하면 해당 젤라틴 입자는 약한 알짜 전하(net charge)를 띤다는 것을 알 수 있다. 한편, pH 5.5의 젤라틴 수용액으로부터 생성된 젤라틴 마이크로 입자의 수화된 형태와 크기 분산은 각각 도 4 의 a) 및 d)와 같다.
도 6은 <실험 2>에서 NaCl 이 첨가된 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자의 SEM 이미지이다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1.5wt%의 NaCl이 첨가된 젤라틴 수용액으로부터 형성되어 수화된 젤라틴 입자의 크기 또한 10~200 μm 로 전반적으로 구형이다. 또한 표면이 NaCl로 덮여 있는 것이 관찰되었으며 이로 인해 젤라틴 입자의 전하 스크리닝(charge screening)이 발생하여 입자간 안정성이 증가되고 젤라틴 입자와 물 분자와의 상호작용에도 영향이 미칠 것으로 보이며, 이에 따라 젤라틴 입자의 가수분해 정도가 달라질 수 있다.
도 7은 NaCl이 첨가된 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자의 분산된 이미지와 크기 분선 그래프를 나타낸다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 NaCl이 첨가된 젤라틴 입자는 수중에 안정적으로 분산되며 응집 없이 입자 형태를 유지한다. 또한 수화되었을 때의 평균 크기는 약 123 μm로 측정되었으며 수화된 1번 샘플(초기 pH 5.5)의 평균 크기가 약 130 μm 인 것으로 고려하면 NaCl의 첨가가 입자의 크기에는 큰 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다.
도 8은 등전점 조건의 젤라틴 수용액의 pH인 pH 8.5의 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자의 SEM 이미지와 크기 분산 그래프를 나타낸다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, pH 8.5의 젤라틴 수용액으로부터 형성된 젤라틴 입자 또한 위의 다른 입자들과 같이 10~200μm의 크기를 가졌지만 구형과 원판 및 원기둥의 다양한 형태가 관찰된다. 등전점 조건에서는 젤라틴의 Net charge가 0에 가깝기 때문에 이는 젤라틴 구조 내 수소결합의 안정화와 관련된다. 또한 젤라틴 입자의 다양한 형태는 서로 다른 결정면 사이의 표면 에너지 차이로 인한 불안정성에 기인한 것으로 가정할 수 있으며 이 또한 젤라틴 입자의 분해속도에 영향을 끼칠 수 있는 요소이다.
도 9는 BCA assay로부터 도출된 각 젤라틴 입자의 분해 정도를 나타내는 그래프이다. 생리적 환경에서 젤라틴 입자가 24시간 후 완전히 분해될 것으로 가정하고, 분해 실험의 24시간 이후의 각 젤라틴 분해도를 100%로 설정하고 그에 따른 시간별 분해 정도를 평가하였다.
도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, pH 5.5 젤라틴 입자의 경우, 분해가 시작된 지 10분만에 약 76%의 분해가 진행되었으며 30분 이내로 100% 이상 완전히 분해된 것을 알 수 있다. 1.5wt%의 NaCl이 첨가된 젤라틴 입자의 경우, 1시간 동안 약 80% 분해가 진행되었다. pH 8.5 젤라틴 입자의 경우, 분해가 시작된 후 10분 동안은 30% 이하의 느린 분해가 진행되었지만 그 이후에 급격한 분해가 진행되어 30분 이내에 완전한 분해가 진행되었다. 결론적으로 pH 5.5와 pH 8.5 젤라틴 수용액으로부터 형성된 입자가 1시간 이내로 완전히 분해됨을 확인할 수 있다.
위 실험에서 확인할 수 있는 바와 같이, 적절한 크기로 1시간내 분해가 가능한 젤라틴 마이크로 입자가 형성되는 25℃로 오일 온도를 설정하고, 빠른 속도로 완전히 분해가 되는 5.5 pH의 NaCl이 첨가되지 않은 젤라틴 수용액을 제조함으로써 약물 방출에 가장 효과적인 젤라틴 입자를 제조할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 젤라틴 마이크로 입자 제조방법에 이용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 젤라틴 수용액을 제조하는 단계-여기서, 상기 젤라틴 수용액은 2 wt% 내지 10wt% 농도이며, 45℃로 예열됨;
    상기 젤라틴 수용액을 소정의 반응 온도의 오일에 드롭와이즈(dropwise)로 가하고 스티어링(stirring)하여 워터 오일 에멀전을 형성하는 단계;
    형성된 워터 오일 에멀전을 스티어링하면서 냉각하여 겔(gel)화하는 단계;
    겔화된 워터 오일 에멀전에 냉각된 아세톤을 혼합하고 스티어링하여 젤라틴 마이크로 입자를 생성하는 단계; 및
    생성된 젤라틴 마이크로 입자를 여과하고 아세톤으로 세척하여 잔류 오일을 제거한 후 자연건조하는 단계를 포함하는 젤라틴 마이크로 입자 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 반응 온도는 4℃ 내지 50℃ 인 것을 특징으로 하는 젤라틴 마이크로 입자 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 반응 온도는 25℃ 인 것을 특징으로 하는 젤라틴 마이크로 입자 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 젤라틴 수용액을 제조하는 단계는,
    에멀전 반응에서의 젤라틴 사슬의 알짜 전하를 조절하기 위하여 상기 젤라틴 수용액의 수소 이온 농도를 소정의 pH 수치가 되도록 조절하는 단계를 포함하는 젤라틴 마이크로 입자 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 pH 수치는,
    젤라틴 수용액의 초기 수소 이온 농도(initial pH) 내지 젤라틴 수용액의 등전점(isoelectric point)의 수소 이온 농도인 것을 특징으로 하는 젤라틴 마이크로 입자 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 젤라틴 수용액을 제조하는 단계는,
    에멀전 반응에서의 젤라틴 사슬의 알짜 전하를 조절하기 위하여 상기 젤라틴 수용액에 염화 나트륨(NaCl)을 첨가하는 단계를 포함하는 젤라틴 마이크로 입자 제조 방법.
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