KR20090021703A - 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐 및 그의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 오일과 유화제 및 한천용액을 사용한 유중수적형(W/O) 에멀젼으로부터 얻어진 한천 마이크로캡슐에 피브로인 피막을 형성한 후 에탄올로 세척하여 피브로인 피막을 경화시킴으로써, 마이크로캡슐 내에 포집되는 물질의 보관상 안정성 향상 및 투과율 조절이 가능하고, 마이크로캡슐을 응집체 상태로 쉽게 회수할 수 있으며, 회수된 마이크로캡슐의 응집체를 수용액에 분산시킬 경우 마이크로캡슐의 형태를 유지하면서 재분산되며 외부 단백질분해효소에 의하여 방출이 조절되는 효과를 기대할 수 있는 신규한 한천 피브로인 마이크로캡슐 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

유중수적형, 에멀젼, 한천, 피브로인, 마이크로캡슐, 응집체, 재분산

Description

재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐 및 그의 제조방법{Redispersible agar fibroin microcapsule and its preparing method}

본 발명은 재분산이 가능하며 단백질 분해효소에 의하여 방출 조절이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

한천(agar)은 홍조류 우뭇가사리에서 얻어지는 중성 다당인 아가로오스(agarose)와 산성 다당인 아가로펙틴(agaropectin)이 약 7:3 비율로 구성된 갈락탄(galactan)의 혼합물이다.

한천은 상온에서 겔을 형성하는 특성을 나타내며, 이러한 특성을 이용하여 미생물을 배양하는 배지를 제조하는데 오랫동안 사용되어 왔으며, 최근에는 마이크로캡슐의 소재로 활용되어 미생물의 고정화, 화장품 소재용 소프트캡슐 및 동물세포를 캡슐화한 인공장기[Chang TMS(1997), Artificial cells and bioencapsulation in bioartificial organs, Ann. N. Y. Acad. Sci. 831, 249-259. Stegemann J. P., J. J. O'Neil and C. J. P. Mullon, US patent 6,399,341(2002)]의 제조에 활용되고 있다.

또한, 한천 겔은 투과성이 매우 높기 때문에 미생물이나 동물세포와 같이 매우 큰 물질을 포괄법으로 고정시키는데 유리하다.

한천 또는 아가로오스 마이크로캡슐은 40 ℃ 이하에서 겔을 형성하는 성질을 이용하여 구형의 틀을 사용하거나 분무냉각(spray cooling) 및 유중수적형(water in oil, W/O) 에멀젼으로부터 제조할 수 있다.

상기 W/O 에멀젼을 이용하는 방법은 온도를 높여서 한천을 용융된 상태로 만든 후 오일을 연속상으로 하는 W/O 에멀젼을 만들고, 이를 냉각시켜 얻어진 한천 마이크로캡슐을 필터 등의 수단으로 회수하는 것으로 이루어져 있음이 잘 알려져 있다. W/O 에멀젼을 이용하면 분무냉각법에 비하여 작은 크기의 마이크로캡슐을 제조할 수 있으며, 대량 생산이 가능하다는 장점을 갖고 있다.

Miyazawa 는 W/O 에멀젼으로부터 제조되는 한천 마이크로캡슐의 크기를 에멀젼의 온도 및 교반속도를 변화시켜 조절가능하며, 에멀젼의 온도와 교반속도를 높이면 캡슐의 크기가 작아진다고 보고하였다[Miyazawa K., I. Yajima, I. Kaneda and T. Yanaki(2000), Preparation of a new soft capsule for cosmetics, J. Cosmet. Sci. 51, 239?252].

Esquisabe 는 점도가 다른 기름과 아가로오스를 사용하여 마이크로캡슐을 제조할 때 마이크로캡슐의 크기는 유화단계에서 사용하는 기름의 점도에 의하여 정해진다고 보고하였다[Esquisabel A., R. M. Hernandez, M. Igartua, A. R. Gascon, B. Calvo and J. L. Pedraz(2002), Preparation and stability of agarose microcapsules containing BCG, J. Microencapsul. 19, 237 - 244.].

또한, 에멀젼에 과량의 유화제를 사용할 경우 한천 마이크로캡슐의 크기를 작게 할 수 있음이 알려져 있다.

그러나, 한천 마이크로캡슐은 원심분리, 필터링 등의 다양한 방법에 의하여 회수하고 있으나, 한천 마이크로캡슐의 회수단계에서 입자들이 서로 뭉치는 경향을 나타내고 있는데, 현재까지는 마이크로 크기의 한천 캡슐을 서로 엉기지 않게 회수하는 방법은 알려지지 않고 있다.

한편, 마이크로캡슐에 내포된 물질의 방출을 제한하거나 조절하기 위해서는 마이크로캡슐의 표면에 다른 물질로 피막을 형성시켜 투과율을 조절하는 방법이 시도되고 있다. 이러한 예로서, 해조류 유래의 알긴산 겔로 제조된 마이크로캡슐의 표면을 폴리라이신으로 처리하는 정도를 달리함으로써, 투과한계 분자량을 100,000과 50,000 으로 조절할 수 있다는 보고가 있다[Brissova M., M. Petro, I. Lacik , A. C. Powers and T. Wang(1996), Evaluation of microcapsule permeability via inverse size exclusion chromatography. Anal. Biochem. 242, 104-111.].

그러나, 상기의 알긴산 겔에 시도된 양전하를 띠는 폴리라이신 처리는 알긴산과 같이 음전하 표면을 가지는 입자에 국한되는 문제점이 있으며 한천 마이크로캡슐의 표면에 피막을 형성하는 시도는 이루어지고 있지 않다.

이에 본 발명의 발명자들은 상기한 문제점을 해결하고, 한천 마이크로캡슐들이 마이크로캡슐의 형태를 유지하면서 분리 및 회수될 수 있으며, 수용액에 개별적인 마이크로캡슐 형태로 재분산시킬 수 있고, 마이크로캡슐의 내부에 포집된 성분의 보관안정성 향상 및 투과율 조절이 가능한 방법을 찾기 위하여 연구 노력하였다.

상기한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일구현예로서 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐은, 유화제가 첨가된 오일(oil)에 한천용액을 분산시킨 유중수적형(W/O) 에멀젼으로부터 제조된 한천 마이크로캡슐의 외층에, 경화된 실크 피브로인 피막층이 형성된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 일구현예로서 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법은, 1) 유화제를 첨가한 오일을 20 ~ 90 ℃ 온도 조건에서 교반하면서 용융된 한천용액을 적가하여 유중수적형(W/O) 에멀젼을 제조하고, 이를 10 ~ 30 ℃ 범위의 온도로 냉각시켜 한천 현탁액을 제조하는 단계와, 2) 상기 한천 현탁액에 실크 피브로인 수용액을 적가, 교반, 여과 및 건조하여 얻은 실크 피브로인이 코팅된 한천 마이크로캡슐을 에탄올로 세척하여 실크 피브로인 층을 경화시킨 후 여과 및 건조하여 분말화하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 한천 피브로인 마이크로캡슐을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 한천 피브로인 마이크로캡슐은, 한천 마이크로캡슐의 외층에 경화된 실크 피브로인 코팅층이 형성된 것을 특징으로 한다.

상기 한천 마이크로캡슐은 유화제가 첨가된 오일(oil)에 한천용액을 분산시킨 유중수적형(W/O) 에멀젼으로부터 제조되는데, 이때 유화제가 포함되지 않을 경우에는 한천 캡슐의 크기가 크고 균일하지 않으며, 캡슐들이 서로 엉기게 되므로 개별적인 한천 마이크로캡슐 표면에 피브로인 코팅층이 형성되지 않는다.

유화제는 비이온성 계면활성제를 사용하는 것이 좋으며, 당분야에서 사용가능한 것으로 알려진 다양한 비이온성 계면활성제를 사용할 수 있다. 이러한 비이온성 계면활성제로 잘 알려진 제품으로는 SPAN 계열의 비이온성 계면활성제를 예로 들 수 있으나, 이로써 한정되는 것은 아니다.

점도가 다른 여러 종류의 오일에 유화제를 일정량 부가하여 한천이 균일한 유적을 형성하는 조건을 얻을 수 있는 잇점이 있으며, 오일과 유화제 혼합물의 점도는 40 mPa/s 이하, 구체적으로 10 ~ 40 mPa/s 범위로 조절하는 것이 본 발명의 목적하는 바에 적합하다.

상기 오일은 구체적으로 예를들면, 미네랄 오일, 스쿠알란, 스쿠알렌, 실리콘 오일, 각종 식물성 오일, 동물성 오일 및 합성 오일 등을 선택사용할 수 있으며, 이들의 종류에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

한편, 피브로인은 실크 섬유의 중심가닥을 형성하는 대표적인 구조단백질로 서 고온 고농도의 염화칼슘 용액에서 용융시키고 이를 투석하여 수용액을 얻을 수 있다[Takano, R., K. Hirabayashi and K. Chen(1991), Preparation of soluble silk fibroin powder by hydrochloric acid hydrolysis, Soviet. Phys. Crystallogr. 60, 358-362.].

한천 마이크로캡슐을 제조하는 과정에서 감압 건조 동안에 피브로인이 첨가되지 않은 상태의 한천 마이크로캡슐은 형태를 유지하지 못하고 수분이 증발될 때 서로 응집되어 매우 매끄러운 한천 겔 덩어리로 변하지만, 본 발명에서의 경우처럼 피브로인을 첨가하면 피브로인이 한천 마이크로캡슐의 표면에 흡착되어 피브로인 피막을 형성하게 되고, 에탄올 세척과정에서 경화되어 한천 마이크로캡슐이 겔 덩어리로 변하는 것을 차단하게 된다.

즉, 피브로인은 에탄올에 녹지 않고 경화되므로 한천 마이크로캡슐의 표면에서 일정한 피막을 형성하면서 경화된다. 경화된 피브로인 피막층에 의해 마이크로캡슐들이 개별적으로 구형의 마이크로캡슐의 모양을 유지하면서 응집체를 이루어 침전한다. 침전된 마이크로캡슐의 응집체는 평균 300 ~ 400 ㎛ 범위의 불규칙한 형태를 나타내며, 필터지 등의 간단한 여과수단으로 간단하게 분리 및 회수할 수 있고, 이를 수용액에 분산시킬 경우 개별적인 마이크로캡슐을 이루면서 재분산된다.

상기와 같이 본 발명의 한천 피브로인 마이크로캡슐은 경화된 피브로인 피막층에 의하여 구형의 마이크로캡슐 형태를 유지할 수 있을 뿐 아니라, 마이크로캡슐의 회수를 쉽게 할 수 있다는 잇점 및 수용액에 재분산되는 잇점을 제공한다.

상기와 같이 특징을 가지는 본 발명의 한천 피브로인 마이크로캡슐은 1 ~ 10 ㎛ 범위의 균일한 직경을 나타내어, 10 ㎛ 이하의 직경을 가지는 한천 피브로인 마이크로캡슐이 전체 얻어진 한천 피브로인 마이크로캡슐의 90 % 이상으로 나타난다.

상기한 본 발명의 한천 피브로인 마이크로캡슐을 구성하는 한천, 피브로인 및 유화제는 각각 50 ~ 55 : 12 ~ 14 : 1 ~ 2 중량비로 구성된다.

또한, 상기한 본 발명의 한천 피브로인 마이크로캡슐은 수용성인 다양한 기능성 물질을 캡슐 내에 안정적으로 포집하여 분말상으로 보관할 수 있으며, 수용액에 다시 재분산시키면 서서히 팽윤하여 마이크로캡슐 내부에 포집된 기능성 물질이 외부로 분출되는데, 경화된 피브로인 피막층이 단백질 분해효소에 의하여 일부 분해되어 투과율이 변하여 방출을 조절할 수 있다. 상기 기능성 물질은 한천 피브로인 마이크로캡슐의 용도에 따라서 다양하게 변형될 수 있으며, 구체적으로 예를 들면 약물 전달체, 기능성 식품 첨가제, 화장품소재 및 인공장기소재 등이 사용될 수 있는데, 이들로서 본 발명이 한정되는 것이 아님은 자명하다.

이하, 본 발명의 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 유화제를 첨가한 오일을 20 ~ 90 ℃ 온도 조건에서 교반하면서 용융된 한천용액을 적가하여 유중수적형(W/O) 에멀젼을 제조하고, 이를 10 ~ 30 ℃ 범위의 온도로 냉각시켜 한천 현탁액을 제조하는 제 1 단계이다.

한천 마이크로캡슐을 제조하기 위하여 먼저 가열된 오일에 유화제를 혼합하고, 여기에 한천용액을 서서히 첨가하여 W/O 에멀젼을 제조한 다음 이를 서서히 냉 각시켜 한천 현탁액을 제조한다.

상기 오일과 유화제 혼합물의 점도가 40 mPa/s 이하, 구체적으로 10 ~ 40 mPa/s 범위인 것을 교반하여 광학현미경 하에서 균일한 에멀젼이 형성되는 것을 확인한 후 사용하며, 유화제는 비이온성 계면활성제를 사용한다.

오일과 유화제의 혼합물은 20 ~ 90 ℃ 범위에서 혼합하는데, 온도가 낮으면 적하된 한천이 바로 겔화 되며, 40℃ 이상에서는 유중수적형 에멀젼 상태를 유지하다 냉각시키면 겔화가 이루어진다. 오일과 유화제 혼합물의 교반은 100 ~ 900rpm 범위, 바람직하기로는 600 ~ 700 rpm 범위로 이루어지는 것이 캡슐의 크기를 소형화 시키는 측면에서 좋다.

광학현미경으로 한천 현탁액을 관찰한 결과, 유화제의 농도가 높으면 구형의 한천 입자뿐만 아니라 미세한 한천 입자들이 공존함을 확인하였다. 유화제의 최적농도를 찾기 위하여 오일 중 유화제의 함량을 혼합액 전체 부피의 5 부피%, 10 부피%, 15 부피%, 20 부피%, 25 부피% 및 30 부피%로 첨가하여 점도와 광학현미경으로 현탁액의 성상을 관찰하였다. 유화제가 전혀 첨가되지 않으면 한천 마이크로캡슐이 생성되지 않았다.

동시에 오일과 유화제가 혼합된 분산상의 점성을 측정하여 비교하였다. 오일과 유화제가 혼합된 분산상의 점성은 유화제의 농도가 상승함에 따라 함께 상승하였고, 더불어 한천 현탁액의 점성도 유화제의 농도가 증가함에 따라 증가하였다.

오일과 유화제 혼합물 중 유화제의 사용량이 10 부피% 이하에서는 한천 현탁액의 점도는 20 mPa/s 이하로 나타났고, 유화제의 사용량이 15 부피% 이상일 때부 터는 한천 현탁액의 점도가 매우 빠르게 증가하였다. 그리고, 큰 입자사이의 연속상이 탁하게 변하는 것을 광학현미경으로 관찰할 수 있었다. 따라서 마이크로캡슐의 균일도를 향상시키기 위하여 오일에 유화제를 첨가하여 혼합물의 점도가 40 mPa 이하 범위가 되도록 조정해야 한다.

한편, Esquisabe 는 각각 점도가 다른 스윗 아몬드 오일(sweet almond oil, 67.1 mPa/s)과 호호바 오일(jojoba oil, 37.7 mPa/s)을 사용하여 각각 23.1 ㎛ 와 42.6 ㎛ 크기의 아가로오스 마이크로캡슐을 얻었다고 보고하고 있다[Esquisabel A., R. M. Hernandez, M. Igartua, A. R. Gascon, B. Calvo and J. L. Pedraz (2002), Preparation and stability of agarose microcapsules containing BCG, J. Microencapsul. 19, 237 - 244.].

본 발명에서는 W/O 에멀젼을 형성시키는데 사용된 유화제와 오일 혼합물의 점도는 40 mPa/s 이하로 다른 오일에 비하여 점도가 낮은 조건에서 제조되었으나, 캡슐의 크기는 오히려 10 ㎛ 이하로 작았다. 이것은 제조과정에서 한천 마이크로캡슐을 건조시켜 수분을 감소시키는 과정이 있고 유화제를 사용한 점이 다르기 때문인 것으로 판단된다.

상기 한천용액은 1 ~ 5 중량% 농도 범위의 수용액인 것을 사용할 수 있으며, 농도가 상기 범위 미만으로 낮으면 구형입자를 형성하지 못하며, 상기 범위를 초과하여 높을 경우 오일과 유화제 혼합물에 적가하기가 곤란해지는 경향이 있다. 이러한 한천용액은 40 ~ 100 ℃ 범위로 미리 가열하여 제조하여 한천 겔이 형성되는 것을 미연에 방지하도록 한다.

상기 유화제를 첨가한 오일 중 한천용액은 5 ~ 30 부피% 범위로 포함되도록 하는 것이 좋으며, 바람직하기로는 10 ~ 20 부피% 범위로 포함시키는 것이 생산성의 측면에서 좋다. 한천용액의 함량이 상기 범위 미만으로 낮으면 수율이 낮으며, 상기 범위를 초과하여 높으면 한천 입자끼리 응집하는 경향이 있다.

상기 한천용액은 0.5 ~ 5 mL/ min 범위의 속도로 유화제가 포함된 오일에 적가시키는데, 이때 한천용액의 적가 속도가 빠르면 한천 입자들끼리 응집하는 경향이 있고, 적가 속도가 느리면 수율이 떨어지므로 균일하고 높은 수율의 한천 마이크로캡슐을 얻기 위해서는 상기 범위를 유지하는 것이 좋다.

기능성 물질은 상기 오일과 유화제의 혼합물에 투입하고 여기에 한천용액을 적가하여 에멀젼화함으로써 마이크로캡슐 내부에 포집시킬 수 있으며, 기능성 물질의 캡슐화는 기능성 물질의 종류와 마이크로캡슐의 용도 및 당업자의 선택에 의하여 적의 조절될 수 있는바, 이에 의하여 본 발명이 한정되는 것이 아님은 자명하다.

다음으로, 상기 한천 현탁액에 피브로인 수용액을 적가, 교반, 여과 및 건조하여 얻은 피브로인이 코팅된 한천 마이크로캡슐을 에탄올로 세척하여 피브로인 피막층을 경화시킨 후 건조하여 분말화하는 제 2 단계이다.

상기 오일과 유화제의 혼합물에 한천용액을 적가하여 W/O 에멀젼을 만들고, 이들의 온도를 낮추어 얻어진 한천 현탁액에 실크 피브로인을 투입하여 한천 마이크로캡슐을 피브로인으로 코팅하였다(도 2 참고). 유화제가 첨가된 오일에 한천용 액을 용융상태에서 주사기로 서서히 투입하여 한천 현탁액을 제조하는데, 이 용액을 식힌 후 한천 마이크로캡슐이 형성된 것은 광학 현미경을 통하여 확인하였다.

상기 피브로인 수용액은 0.5 ~ 5 중량% 농도 범위, 바람직하기로는 1 ~ 3 중량% 농도 범위의 것을 사용하는 것이 좋은데, 피브로인 수용액의 농도가 상기 범위 미만으로 적으면 한천 마이크로캡슐을 충분히 코팅하지 못하는 경향이 있고, 상기 범위를 초과하여 높을 경우에도 추후 공정에 의하여 피브로인이 한천 마이크로캡슐에 코팅되지 않고 회수되므로 실익이 적은 경향이 있다.

상기 피브로인 수용액은 한천 현탁액 중 10 ~ 20 부피% 범위로 포함되는 것이 공정의 효율성 측면에서 좋다.

상기 피브로인 수용액은 0.5 ~ 5 mL/ min 범위의 속도로 적가하는데, 이때 적가 속도가 빠르면 한천 입자들끼리 응집하는 경향이 있고, 적가 속도가 느리면 수율이 떨어지므로 균일하고 높은 수율의 한천 마이크로캡슐을 얻기 위해서는 상기 범위를 유지하는 것이 좋다.

피브로인 수용액 적가 후 서서히 교반하여 한천 마이크로캡슐에 피브로인이 충분히 코팅되도록 한 후 건조 및 여과한다. 상기 건조수단 및 여과수단은 다양한 방법을 선택할 수 있다. 여과하여 얻어진 침전물은 에탄올로 세척하는데, 필요할 경우 에탄올 세척을 수회 수행할 수 있다. 에탄올 세척에 의하여 한천 마이크로캡슐에 코팅된 피브로인이 경화되는데, 경화된 피브로인은 물에 녹지 않으므로 한천 마이크로캡슐을 수용액에 분산시킬 경우 뭉쳐져서 겔화하지 않게 된다.

상기한 에탄올 세척에 의하여 경화된 피브로인 피막층이 형성된 한천 피브로 인 마이크로캡슐은 건조하여 분말형태로 수득할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 마이크로캡슐 내에 포집되는 물질의 보관상 안정성 향상 및 방출 조절이 가능하고, 마이크로캡슐을 응집체 상태로 쉽게 회수할 수 있으며, 회수된 마이크로캡슐의 응집체를 수용액에 분산시킬 경우 마이크로캡슐의 형태를 유지하면서 재분산되는 효과를 기대할 수 있는 한천 피브로인 마이크로캡슐을 제조할 수 있다.

상기한 본 발명의 한천 피브로인 마이크로캡슐은 약물 전달체 등으로 유용하며, 한천, 피브로인 등의 생체적합성 물질을 사용하고 피부에 도포, 혹은 인체에 투입할 경우 피부 혹은 인체에 상존하는 단백질 분해 효소에 의하여 방출이 조절되므로 상처 치유용 외용제나 인공장기 등의 용도로의 사용이 가능한 등 다양한 산업분야에 사용될 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명하겠는 바, 다음 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

참고예 : 재료 및 방법

본 실험에 사용된 한천은 미생물 배지 제조용으로 판매되는 정제 분말 한천 을 Junsei Chemical (Japan)에서 구입하였다. 실크 피브로인은 견사를 고농도의 염에서 가용화시키고 이를 투석을 통하여 탈염시킨 후 동결건조된 분말을 (주)화인코 (Chuncheon, Korea)에서 제공 받아 사용하였다.

실시예 : 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조

250 mL 비이커에 미네랄 오일(8 mPa/s) 45 mL을 넣고, 유화제(Sorbitan monooleate, Span 80) 5 mL을 첨가한 후 마그네틱 바를 이용하여 일정한 속도(600 rpm)로 30 분간 교반하였다. 한천용액은 0.2 g의 한천 분말을 10 mL의 증류수에 녹인 후 70 ℃의 열을 가하여 제조하였다. 상기 일정한 속도로 교반중인 미네랄 오일 용액에 한천용액을 분당 1 mL의 속도로 총 6 mL을 주입하여 에멀젼을 제조한 후, 25 ℃로 냉각시켜 한천 현탁액을 제조하였다.

증류수 10 mL에 실크 피브로인 0.2 g을 녹인 실크 피브로인 수용액을 상기 교반중인 한천 현탁액에 분당 1 mL의 속도로 나누어 총 6 mL을 주입하였다. 약 40분간 교반 후 회전식 감압 증발기(JP/N 1000S-W, Eyela, Japan)를 사용하여 30분 동안 55 ℃에서 건조시킨 후, 이를 50 mL 튜브에 옮겨 2000 rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물을 2 ~ 3회 에탄올 세척하였으며, 세척이 끝난 시료는 건조하여 분말형태로 회수하였다.

6 mL의 2 중량% 농도인 한천 겔과 0.2 g의 피브로인이 한천 마이크로캡슐의 제조에 사용되었으나, 회전 감압 증발기를 이용한 건조 과정에서 약 8.7 mL의 수분이 제거되고 에탄올 세척과정을 통하여 얻은 침전물을 건조시켜 최종적으로 0.141 g의 한천 마이크로캡슐을 회수하였다. 피브로인과 한천은 각각 0.12 g씩 모두 0.24 g이 사용되었으므로 투입된 피브로인과 한천을 기준으로 수율은 0.59 (g/g)이었다.

실험예 1 : 한천 현탁액의 점도관찰

한천 현탁액 및 미네랄 오일과 유화제 혼합액의 점도는 회전점도계(Brabender viscometer, Brabender Instruments, Inc., Germany)를 사용하여 상온에서 측정하였다. 측정용 컵(E17)에 시료액 8 mL을 넣고 0 ~ 130 rpm의 회전속도로 변화시키며 전단응력(shear stress)을 측정하여 점도를 계산하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험예 2 : 주사 전자 현미경(SEM)에 의한 마이크로캡슐의 관찰

마이크로캡슐을 진공 상태에서 골드코팅한 후 표면과 형태를 주사 전자 현미경(S-4300, Hitachi, Japan)을 사용하여 관찰하였다.

도 3은 제조된 한천 피브로인 마이크로캡슐의 에탄올 침전물[(d),(e) 및 (f)]과 피브로인을 첨가하지 않은 한천 현탁액의 에탄올 침전물[(a),(b) 및 (c)]의 주사 전자 현미경사진이다. 각각의 시료들은 100배[(a),(d)], 500배[(b),(e)] 및 1000배[(c),(f)]의 배율로 관찰 하였다.

한천 피브로인 마이크로캡슐의 에탄올 침전물 크기는 약 300 ~ 400 ㎛로 불규칙한 모양을 가지고 있다. 한천 피브로인 마이크로캡슐의 에탄올 침전물은 구형의 작은 입자들이 뭉쳐져 큰 덩어리를 형성하고 있는 것으로 관찰되는 반면, 피브 로인이 첨가되지 않은 한천 현탁액의 경우는 이와 같은 표면을 관찰할 수 없었다.

즉, 한천 피브로인 마이크로캡슐의 에탄올 침전물은 피브로인 피막으로 싸인 미세한 구형의 한천 마이크로입자들이 뭉쳐진 것으로 판단된다.

뭉쳐진 한천 피브로인 마이크로캡슐의 응집체를 물에 녹여 분산시켜 이들이 분산되는 과정 및 각각의 입자를 광학현미경[200 배율]과 전자현미경으로 관찰하였다.

도 4(a)는 한천 피브로인 마이크로캡슐의 응집체를 물에 첨가하여 재분산되는 과정을 도식화한 것이다. 도 4(b)는 한천 피브로인 마이크로캡슐 응집체의 광학 현미경 사진이고, 도 4(c)는 개별적으로 분산된 한천 피브로인 마이크로캡슐의 사진이다. 도 4(d)와 도 4(e)는 이들의 주사 전자 현미경사진이다. 현미경 사진 상으로 한천 피브로인 마이크로캡슐은 다양한 크기 분포를 나타내며, 대부분의 마이크로캡슐의 크기는 10 ㎛ 이하임을 확인할 수 있다.

실험예 3 : 공초점 현미경(CLM)에 의한 마이크로캡슐의 관찰

마이크로캡슐을 탄산나트륨 완충용액(0.1M, pH 9)에 2 mg/mL으로 녹인 후 50 ㎕의 FITC 용액(1 mg/mL DMSO)과 혼합하였다. 암실에서 4시간의 반응시간을 거친 샘플을 0.45 ㎛ 필터지에 인산 완충용액을 통과시키며 세척한 후 건조시켰다. 건조된 샘플은 공초점 현미경(Olympus, FLUROVIEW- FV300, Japan)을 사용하여 관찰하였다.

단백질을 형광 염색시키는 FITC로 한천 마이크로캡슐을 처리한 후 공초점 현 미경을 사용하여 한천 마이크로캡슐 외면에 피브로인 피막 형성 여부를 확인하였다. 즉, 먼저 마이크로캡슐을 제조하는 과정에 첨가하는 피브로인 수용액의 농도는 0.5 중량%에서 4 중량% 까지 변화시켜 한천 마이크로캡슐을 제조하고, 이를 FITC로 염색한 후 공초점 현미경을 사용하여 1800 배로 초점면을 상하로 이동시키며 관찰하였다.

도 5(a)는 초점면을 마이크로캡슐의 중간에 위치하였을 경우 촬영한 사진을 확대한 것이다. 형광이 마이크로캡슐의 외부 표면에서 주로 나타나므로 FITC에 염색된 단백질이 주로 마이크로캡슐의 표면에 위치하고 있음을 확인할 수 있다. 도 5의 (b) 내지 (f)는 피브로인 수용액의 농도를 각각 0.5 중량%, 1 중량%, 2 중량%, 3 중량% 및 4 중량%로 변화시켜 제조한 마이크로캡슐의 공초점 현미경 사진이다. 초점면이 통과하지 않는 캡슐은 표면이 보이므로 캡슐전체가 밝게 보이지만, 초점면이 통과하는 캡슐은 FITC에 의하여 염색되지 않은 내부가 어둡게 보여 피브로인으로 피막이 형성되어 있음을 나타내고 있다.

열중량분석의 결과에서도 피브로인의 성분은 13.8 중량%로서 상당 부분 제조과정에서 손실되는 것을 보아 일부분만 피막을 형성하는데 사용되는 것으로 판단된다.

공초점현미경사진의 이미지분석을 통하여 한천 피브로인 마이크로캡슐의 크기를 분석하였으며, 4 중량% 농도의 피브로인 수용액을 사용하였을 때 제조된 한천 피브로인 마이크로캡슐의 90 % 가 1.32 ㎛에서 6.0 ㎛의 범위에 포함되었음을 확인할 수 있다.

실험예 4 : 열중량 분석기(TGA)에 의한 마이크로캡슐의 조성 관찰

마이크로캡슐의 조성을 알아보기 위하여 열중량분석법(thermogravimetric analysis)을 적용하였으며, 열중량분석기(SDT2960, TA Instruments, USA)를 사용하였다.

질소가스를 이용하였으며 상온에서부터 1000 ℃까지 분당 10 ℃의 속도로 온도를 증가시키면서 한천 피브로인 마이크로캡슐의 무게 감소를 측정하였다. 한천과 피브로인, Span 80의 각각의 단일 중량변화와 분해온도를 한천 피브로인 마이크로캡슐에 대한 결과와 비교하여 캡슐의 성분의 조성을 계산하였다.

제조된 한천 피브로인 마이크로캡슐과 한천, 피브로인, Span 80의 질량 감소 곡선을 구하였다. 각각의 질량감소곡선으로부터 마이크로캡슐의 조성은 한천 51.2 중량%, 피브로인 13.8 중량% 및 Span 80은 1.4 중량%로 관찰되었다.

한천과 피브로인은 0.12 g씩 같이 투입되었으나 캡슐의 성분은 피브로인의 함량이 더 적은 것으로 나타났다. 캡슐의 수율이 0.59 (g/g)인 점을 고려해보면 상당량의 피브로인은 원심분리를 통한 회수과정에서 손실된 것으로 판단된다.

실험예 5 : 입도분석기(PSA)를 이용한 마이크로캡슐의 입자크기 분석

2%의 피르로인 용액으로 코팅된 한천 마이크로캡슐를 증류수에 분산시키고 입도분석기(Mastersizer2000, Malven Instruments, U.K)를 사용하여 한천 마이크로캡슐의 입자크기 분포를 알아보았다. 분산된 단일 입자의 크기를 특정하기 위하여 초음파 분산 전처리를 시도하였다. 도 6은 입자의 크기에 따른 입자의 개수를 백분율로 나타내었다. 피브로인 마이크로캡슐의 90 % 가 반경 0.71 ㎛에서 2.80 ㎛의 범위에 포함되었음을 확인할 수 있었으며 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이것은 공초점 현미경사진의 이미지 분석을 통하여 얻어진 마이크로 캡슐의 크기 90%가 직경 1.32 ㎛에서 6.00 ㎛범위에 포함되어 있는 것과 대체적으로 일치하고 있다.

실험예 6 : 단백질 분해 효소에 의한 한천 마이크로캡슐의 방출조절

피브로인으로 코팅된 한천 마이크로캡슐의 내부물질의 방출특성을 조사하기 위하여, 제조시 용융된 한천용액에 1 중량%의 NaCl를 첨가하여 캡슐을 제조하였다. 건조된 캡슐 0.2 g을 100mL의 증류수에 투입하고, 약 300 rpm의 속도로 교반하면서 도전율측정기 (CD-55, Corning Instruments, USA)를 사용하여 시간에 따른 도전율을 알아보았다. 효소가 첨가된 후 캡슐로부터 NaCl이 방출되는 속도를 알아보기 위하여 파파인(Papain, Sigma-Aldrich Co., U.K)을 실크 피브로인 0.12 g 당 0.05 unit, 50 unit, 400 unit로 첨가하여 교반하며 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

50 unit 와 400 unit의 파파인이 첨가된 경우 약 13일 동안 각각 55 % 및 58 %의 NaCl이 캡슐로부터 서서히 방출되었고, 반면 0.05 unit이하에서는 용액의 도전율이 소폭 증가하였고, 10%이하의 NaCl이 방출되었다. 따라서 캡슐외부의 단백질 분해효소에 의해서 내부물질의 조절이 가능함을 알 수 있었다.

도 1은 한천 마이크로캡슐 제조방법의 일례를 나타낸 흐름도이다.

도 2는 미네랄 오일 중 유화제의 농도에 따른 한천 현탁액(agar suspension)의 점도를 나타낸 그래프이다.

도 3은 진공 증류 후의 한천 마이크로캡슐[(a), (b), 및 (c))]과 한천 피브로인 마이크로캡슐[(d),(e), 및 (f)]의 주사전자현미경(SEM) 사진이며, (a)와 (d)는 100 배율에서 관찰하였고, (b)와 (e)는 500 배율에서 관찰하였고, (c)와 (f)는 1000 배율에서 관찰한 결과이다.

도 4는 한천 피브로인 마이크로캡슐의 재분산의 도해(a), 광학현미경사진(b), (c), 주사전자현미경(SEM) 사진(d), (e)이며, 광학현미경사진은 200 배율에서 관찰한 결과이다.

도 5는 0.5% (b), 1% (c), 2% (a, d), 3% (e) 및 4% (f) 농도의 실크 피브로인 용액을 첨가하여 제조한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 공촛점현미경(CLM)사진이며, 사진 중 백색선은 10 ㎛를 나타낸다.

도6은 입도분석기(PSA)를 이용한 마이크로캡슐의 입자크기의 분포를 나타낸 그래프이다.

도 7은 효소 처리에 따른 한천 피브로인 마이크로캡슐의 방출량을 나타낸 그래프이다.

Claims (13)

1. 유화제가 첨가된 오일(oil)에 한천용액을 분산시킨 유중수적형(W/O) 에멀젼으로부터 제조된 한천 마이크로캡슐의 외층에, 경화된 피브로인 피막층이 형성된 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐.
2. 청구항 1에서,

   상기 유화제는 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐.
3. 청구항 1에서,

   상기 유화제가 첨가된 오일은 점도가 10 ~ 40 mPa/s 범위인 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐.
4. 청구항 1에서,

   상기 한천 피브로인 마이크로캡슐은 직경이 1 ~ 10 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐.
5. 1) 유화제를 첨가한 오일을 20 ~ 90 ℃ 온도 조건에서 교반하면서 용융된 한천용액을 적가하여 유중수적형(W/O) 에멀젼을 제조하고, 이를 10 ~ 30 ℃ 범위의 온도로 냉각시켜 한천 현탁액을 제조하는 단계와,

   2) 상기 한천 현탁액에 실크 피브로인 수용액을 적가, 교반, 여과 및 건조하여 얻은 실크 피브로인이 코팅된 한천 마이크로캡슐을 에탄올로 세척하여 실크 피브로인 층을 경화시킨 후 여과 및 건조하여 분말화하는 단계

   를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법.
6. 청구항 5에서,

   상기 유화제는 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법.
7. 청구항 5에서,

   상기 유화제가 첨가된 오일은 점도가 10 ~ 40 mPa/s 범위인 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법.
8. 청구항 5에서,

   상기 한천용액은 1 ~ 5 중량% 농도 범위의 수용액인 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법.
9. 청구항 5에서,

   상기 유화제를 첨가한 오일 중 한천용액은 5 ~ 30 부피% 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법.
10. 청구항 5에서,

    상기 한천용액은 0.5 ~ 5 mL/ min 범위의 속도로 적가시키는 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법.
11. 청구항 5에서,

    상기 피브로인 수용액은 0.5 ~ 5 중량% 농도 범위인 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법.
12. 청구항 5에서,

    상기 피브로인 수용액은 0.5 ~ 5 mL/ min 범위의 속도로 적가시키는 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법.
13. 청구항 5에서,

    상기 피브로인 수용액은 한천 현탁액 중 10 ~ 20 부피% 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는 재분산이 가능한 한천 피브로인 마이크로캡슐의 제조방법.

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