CN109810935A

CN109810935A - 细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法

Info

Publication number: CN109810935A
Application number: CN201711155319.1A
Authority: CN
Inventors: 秦建华; 王慧; 刘慧�
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2037-11-20
Also published as: CN109810935B

Abstract

本发明提供了一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法。该方法主要包括以下步骤：明胶甲基丙烯酰胺材料的合成、明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核/壳内细胞负载、细胞3D单独/分区共培养等。本发明实现一步、可控、制备核壳微球，并用于细胞3D区域化培养，基于材料良好的生物相容性，该发明在细胞培养、微组织模型构建、组织块移植、药物缓释与筛分等生物学应用方面具有极大的应用价值。

Description

细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法

技术领域

本发明涉及材料化学与微流控技术领域，具体涉及一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法。。

背景技术

体外构建功能化的组织模型在组织工程、再生医学、伤口愈合、药物筛分等领域已被广泛关注。在体内，功能化组织涉及多种类型的细胞以及细胞与细胞外基质间的相互作用。此外，在体外构建功能化组织中，细胞外基质也提供了3D支架材料用于区域化培养不同种类的细胞。

水凝胶材料作为细胞3D培养支架材料，已经在细胞分区化培养、体内微组织模型构建、血管形成、组织块移植等方面得到了广泛的应用。然而，利用传统技术(图案化、纺丝等)所得到的细胞3D培养水凝胶组织块，存在不可控、不均一、营养物质交换能力差等缺点，这就需要提出一种可控水凝胶支架材料的制备方法。而微流控技术的提出，正好能弥补这些不足，逐渐在体外3D组织构建中得到应用。

当前，利用微流控技术制备的细胞3D培养体系主要是实心微球的制备，而实心微球用于细胞3D培养存在流体剪切力对细胞的损伤、细胞在微球内生长的不可控、多种细胞不能区域化培养等缺点，不能更真实的模拟人体内多种细胞间的相互作用，所以核壳区域化微球的构建解决了以上问题。目前，用于细胞核壳区域化培养的方法主要是分步负载，即先制备负载细胞的实心微球，再将另一种细胞悬液与微球混合使得第二种细胞粘附在微球表面，从而将不同种类的细胞区域化培养，其本质还是基于实心微球的构建，操作还比较繁琐。本发明提出一步法制备核壳微球并用于细胞3D分区化培养，也就是说在形成微球的同时可完成核壳分区化细胞的负载。

明胶材料，几十年来成为科研工作者关注的对象。由于其具有独特的优势，比如，明胶包含许多能促进细胞粘附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列；含有适合细胞重新构造的基质金属蛋白酶(MMP)序列；含有很多氨基、羧基、羟基，故可用于修饰嫁接官能团。且由于其低温呈现固态、高温呈现液态的性质，在用于细胞3D培养中需要将其固化从而形成稳定的支架材料。如在明胶用甲基丙烯酸酐修饰后在光引发剂存在的条件下，紫外条照射发生自由基聚合反应，从而将明胶固化，即形成明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料。目前，采用明胶甲基丙烯酰胺材料制备的微球主要是实心微球，形式单一、不能区域化，而本发明结合生物相容性极好的明胶甲基丙烯酰胺材料，一步法制备核壳微球能解决细胞区域化培养问题，且体系稳定、操作简单。

发明内容

本发明提供了一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，致力于发展生物相容性很好的且用于细胞3D分区单独/共培养的水凝胶材料的方法。

本发明一种微流控芯片，主要由连续相入口、壳流体入口、核流体入口、微球出口、连续相通道、壳流体通道、核流体通道、层流通道及主通道组成，连续相入口通过连续相通道与主通道连接，壳流体入口、核流体入口分别通过壳流体通道、核流体通道均与层流通道及主通道连接。

所述的微流控芯片，连续相通道、壳流体通道、核流体通道、层流通道、主通道宽度范围均为100-500μm，芯片各部分通道高度范围为50-400μm，主通道长1-2cm，层流通道长范围为0.5-1.5mm。

一种微流控芯片的制备方法，该微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为洁净的玻璃片。PDMS层和玻璃片分别用等离子体处理15s进行封接，通道用1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷疏水处理。所述1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷浓度为0.5％-5％。

本发明一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，采用上述微流控芯片，具体包括下列步骤：

(1)明胶甲基丙烯酰胺材料的合成：将明胶溶于DPBS溶液，然后加入甲基丙烯酸酐溶液，之后加入DPBS溶液来终止反应；随后用去离子水透析，接着将以上透析液过滤，最后将滤液冻干数天从而得到多孔的明胶甲基丙烯酰胺材料；

所述DPBS配制成分为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.15g，KH₂PO₄ 0.2g于1L蒸馏水中，明胶浓度为0.01-0.2g/mL，甲基丙烯酸酐溶液浓度5％-10％，

所述明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为5:4，甲基丙烯酸酐与首次加入的DPBS体积比为2:25，先后两次加入的DPBS体积比为1:4，甲基丙烯酸酐加入速率为0.5mL/min。透析时间为1-10天，过滤器孔径为0.22-8μm，冻干天数为1-10天；

(2)明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核/壳内细胞负载：将甲基纤维素溶于DPBS中制得甲基纤维素溶液备用，将步骤(1)中制备的多孔明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料和光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于DPBS中制得明胶甲基丙烯酰胺混合液备用；

一种或多种细胞经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的甲基纤维素溶液充分混匀，得到细胞密度为10⁴-10¹⁰个/ml的悬液，最终得到悬有细胞的甲基纤维素溶液，通过微流控芯片的核流体入口通入到核流体通道中，

一种或多种细胞经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺混合液充分混匀，得到细胞密度为10⁴-10¹⁰个/ml的悬液，最终得到悬有细胞的明胶甲基丙烯酰胺混合液，通过微流控芯片的壳流体入口通入到壳流体通道中，通过调节流速使得两种水溶液在层流通道中形成稳定的层流，

再由连续相入口通入的含span80的矿物油将层流截断，形成负载细胞的液滴，液滴在微球出口处经过紫外光固化，即形成含有负载了细胞的固化的壳及负载了细胞的核结构的微球；通过核流速、壳流速、连续相流速的调节，控制微球核尺寸、壳厚度以及微球整体大小等参数；

所述甲基纤维素溶液浓度为1％-10％，悬有细胞的甲基纤维素溶液浓度为0.5％-5％，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮浓度为0.5％-5％，明胶甲基丙烯酰胺浓度为4％-30％，悬有细胞的明胶甲基丙烯酰胺浓度为8％-60％，

所述span80浓度为0.1％-10％，紫外固化光强度为58J/cm²，固化时间为10-25s；核流速范围：0.01-20μL/min，壳流速范围：0.01-60μL/min，连续相流速范围：1-80μL/min。

(3)细胞3D单独/分区共培养：经过上述步骤制备的核/壳内负载细胞的微球可以经过离心收集，离心速率300-800rpm，1-3min，后直接转移到培养基中进行3D单独/分区培养，培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征。

本发明实现一步、可控、制备核壳微球，并用于细胞3D区域化培养，基于材料良好的生物相容性，该发明在细胞培养、微组织模型构建、组织块移植、药物缓释与筛分等生物学应用方面具有极大的应用价值。

附图说明

图1是明胶甲基丙烯酰胺核壳微球芯片示意图。其中，1代表连续相入口；2代表壳流体入口；3代表核流体入口；4代表微球出口；5代表连续相通道；6代表壳流体通道；7代表核流体通道；8代表层流通道；9代表主通道。

图2是实施例1中核负载HepG2，壳中不负载细胞的水凝胶微球，其中：a是核内负载细胞第一天的明场表征图(标尺：400μm)；b是负载的细胞在十五天内的死活情况统计表征图。

图3是实施例2中核中负载HepG2，壳中负载HUVEC细胞的水凝胶微球，其中：a是核壳分区负载细胞第一天的明场表征图(标尺：200μm)；b是核壳分区负载细胞在十五天内的尿素分泌情况统计图。

具体实施方式

在体系中加入细胞悬液，并通过层流技术及油水不相容原理，可控地形成均一、稳定的细胞分区负载液滴，然后在在外灯照射下，水凝胶预聚体经过自由基反应快速交联形成含固化的壳和水溶液的核结构的3D微球，通过对微球核内负细胞并进行体外3D培养可进一步形成微组织。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

本发明一种其微流控芯片，如图1所示，主要由连续相入口1、壳流体入口2、核流体入口3、微球出口4、连续相通道5、壳流体通道6、核流体通道7、层流通道8及主通道9组成；连续相入口1通过连续相通道5与主通道8连接，壳流体入口2、核流体入口3分别通过壳流体通道6、核流体通道7均与层流通道8及主通道9连接；

所述的微流控芯片，连续相通道高度和宽度分别为310μm、270μm，壳流体通道高度和宽度分别为150μm、150μm，核流体通道高度和宽度分别为150μm、130μm，层流通道高度和宽度分别为150μm、150μm，主通道高度和宽度分别为310μm、350μm，主通道长1cm，层流通道长为1mm。

芯片的制备及修饰：所述的微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为洁净的玻璃片。PDMS层和玻璃片分别用等离子体处理15s进行封接，通道用2％的1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷疏水处理。

所述所述DPBS配制成分为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.15g，KH₂PO₄0.2g于1L蒸馏水中，明胶浓度为0.2g/mL，甲基丙烯酸酐溶液浓度5％，

所述明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为5:4，甲基丙烯酸酐与首次加入的DPBS体积比为2:25，先后两次加入的DPBS体积比为1:4，甲基丙烯酸酐加入速率为0.5mL/min。透析时间为7天，过滤器孔径为0.45μm，冻干天数为3天；(2)明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核内细胞负载：将甲基纤维素溶于DPBS中制得甲基纤维素溶液备用，将步骤(1)中制备的多孔明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料和光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于DPBS中制得明胶甲基丙烯酰胺混合液备用；

一种细胞(HepG2细胞)经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的甲基纤维素溶液充分混匀，得到细胞密度为9×10⁶个/mL的悬液，最终得到悬有细胞的甲基纤维素溶液，通过微流控芯片的核流体入口3通入到核流体通道7中，

将溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺混合液从壳流体入口2通入到壳流体通道6中，通过调节流速使得两种水溶液在层流通道8中形成稳定的层流，

再由连续相入口1通入的含span80的矿物油将层流截断，形成负载细胞的液滴，液滴在微球出口处4经过紫外光固化，即形成含有固化的壳及负载细胞的核结构的微球；通过核流速、壳流速、连续相流速的调节，控制微球核尺寸、壳厚度以及微球整体大小等参数；

所述甲基纤维素溶液浓度为2％，悬有细胞的甲基纤维素溶液浓度为1％，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的浓度为1％，溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺溶液浓度为8％；span80浓度为2％，紫外固化光强度为58J/cm²，固化时间为20s；核流速：2μL/min，壳流速：2μL/min，连续相流速：20μL/min。,

(3)细胞3D单独养：经过上述步骤制备核中的负载一种细胞(HepG2细胞)的微球可以经过离心收集，离心800rpm，3min，后直接转移到培养基中进行培养，培养期间每天换液一次，保证细胞营养，期间对微球核内负载HepG2细胞的培养生长情况进行表征，如图2所示。

实施例2

本发明一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，采用上述微流控芯片；具体包括下列步骤：

所述明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为5:4，甲基丙烯酸酐与首次加入的DPBS体积比为2:25，先后两次加入的DPBS体积比为1:4，甲基丙烯酸酐加入速率为0.5mL/min。透析时间为7天，过滤器孔径为0.45μm，冻干天数为3天；(3)明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核/壳内细胞负载：将甲基纤维素溶于DPBS中制得甲基纤维素溶液备用，将步骤(1)中制备的多孔明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料和光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于DPBS中制得明胶甲基丙烯酰胺混合液备用；

一种细胞(HUVEC细胞)经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺混合液充分混匀，得到细胞密度为9×10⁶个/mL的悬液，最终得到悬有细胞的明胶甲基丙烯酰胺混合液，通过微流控芯片的壳流体入口2通入到壳流体通道6中，通过调节流速使得两种水溶液在层流通道8中形成稳定的层流，

所述甲基纤维素溶液浓度为2％，悬有细胞的甲基纤维素溶液浓度为1％，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的浓度为1％，溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺浓度为16％，悬有细胞的明胶甲基丙烯酰胺浓度为8％；span80浓度为2％，紫外固化光强度为58J/cm²，固化时间为20s；核流速：2μL/min，壳流速：2μL/min，连续相流速：20μL/min。

(3)细胞3D分区共独养：经过上述步骤制备核中的负载一种细胞(HepG2细胞)，壳中负载一种细胞(HUVEC细胞)的微球可以经过离心收集，离心800rpm，3min，后直接转移到培养基中进行培养，培养期间每天换液一次，保证细胞营养，期间对2种细胞共培养十五天内的尿素分泌情况进行了表征，如图3所示。

Claims

1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由连续相入口(1)、壳流体入口(2)、核流体入口(3)、微球出口(4)、连续相通道(5)、壳流体通道(6)、核流体通道(7)、层流通道(8)及主通道(9)组成；连续相入口(1)通过连续相通道(5)与主通道(8)连接，壳流体入口(2)、核流体入口(3)分别通过壳流体通道(6)、核流体通道(7)与层流通道(8)及主通道(9)连接。

2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：连续相通道(5)、壳流体通道(6)、核流体通道(7)、层流通道(8)、主通道(9)宽度范围均为100-500μm，芯片各部分通道高度范围为50-400μm，主通道(9)长1-2cm，层流通道(8)长范围为0.5-1.5mm。

3.按照权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述的微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为洁净的玻璃片；PDMS层和玻璃片分别用等离子体处理15s进行封接，通道用1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷疏水处理；所述1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷浓度为0.5％-5％。

4.一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于采用上述芯片，按照以下步骤进行：

一种或多种细胞经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的甲基纤维素溶液充分混匀，得到细胞密度为10⁴-10¹⁰个/ml的悬液，最终得到悬有细胞的甲基纤维素溶液，通过微流控芯片的核流体入口(3)通入到核流体通道(7)中；

一种或多种细胞经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺混合液充分混匀，得到细胞密度为10⁴-10¹⁰个/ml的悬液，最终得到悬有细胞的明胶甲基丙烯酰胺混合液，通过微流控芯片的壳流体入口(2)通入到壳流体通道(6)中，通过调节流速使得两种水溶液在层流通道(8)中形成稳定的层流；

再由连续相入口(1)通入的含span80的矿物油将层流截断，形成负载细胞的液滴，液滴在微球出口处(4)经过紫外光固化，即形成含有负载了细胞的固化的壳及负载了细胞的核结构的微球；通过核流速、壳流速、连续相流速的调节，控制微球核尺寸、壳厚度以及微球整体大小及其他参数；

5.按照权利要求4所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述DPBS配制成分为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.15g，KH₂PO₄0.2g溶于1L蒸馏水中。

6.按照权利要求4所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤(1)所述明胶浓度为0.01～0.2g/mL，甲基丙烯酸酐溶液浓度5％-10％，所述明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为5:4，甲基丙烯酸酐与首次加入的DPBS体积比为2:25，先后两次加入的DPBS体积比为1:4，甲基丙烯酸酐加入速率为0.5mL/min。

7.按照权利要求4所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤(1)透析时间为1-10天，过滤器孔径为0.22-8μm，冻干天数为1-10天。

8.按照权利要求4所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)甲基纤维素溶液浓度为1％-10％，悬有细胞的甲基纤维素溶液浓度为0.5％-5％，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮浓度为0.5％-5％，明胶甲基丙烯酰胺浓度为8％-60％，悬有细胞的明胶甲基丙烯酰胺浓度为4％-30％，span80浓度为0.1％-10％，紫外固化光强度为58J/cm²，紫外固化时间为10-25s。

9.按照权利要求4所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)核流速范围：0.01-20μL/min，壳流速范围：0.01-60μL/min，连续相流速范围：1-80μL/min。

10.按照权利要求4所述的一种细胞分区培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于：制备得到的核壳微球核壳尺寸均一、可控。该发明在细胞分区化培养、微组织模型构建、组织块移植、药物缓释与筛分及其他生物学应用方面具有极大的应用价值。