CN109652359A - 一种基于双水相液滴的细胞3d培养水凝胶微球的制备方法 - Google Patents

一种基于双水相液滴的细胞3d培养水凝胶微球的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法。该方法包括微流控芯片泵阀的集成、水凝胶材料的选择、水凝胶微球合成及细胞负载、细胞的3D培养等。本发明利用生物相容性极佳的微流控双水相液滴作为载体可控合成均一的水凝胶微球，并用于细胞体外3D培养，基于双水相体系良好的生物相容性及微流控技术的精准控制，该方法在体外微组织构建等方面具有极大的应用价值。

Description

一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法
技术领域
本发明属于微流控技术、组织工程、材料化学、再生医学等领域，具体涉及一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微的球制备方法。
背景技术
水凝胶材料作为细胞3D培养支架，已经在仿生组织、体外器官模型、干细胞诱导分化和细胞共培养体系建立等方面得到了广泛的应用。然而，利用传统技术所得到的细胞3D培养水凝胶块，存在比表面积小，细胞营养物质交换不畅、材料尺寸及形貌可控性差，影响细胞表型、细胞易贴壁生长，不满足3D培养的要求等缺点。人们需要一种微观可控的水凝胶支架材料制备方法，而微流控的方法恰好满足这些要求，开始在微型水凝胶(微凝胶)材料的合成方面得到应用。
利用微流控方式合成微型水凝胶主要是基于微流控液滴技术(微球结构)和湿法纺丝技术(微丝结构)。其中微流控液滴技术更加成熟，应用也更加广泛。基于微流控液滴技术合成微凝胶，只需将原来形成液滴的分散相从简单的水溶液换成水凝胶预聚体溶液即可，然后在微流控通道内部或出口外部通过离子交联、光聚合、热聚合等方式得到固化的水凝胶；如果在水凝胶预聚体溶液中混入细胞悬浮液就可以得到细胞3D负载的培养支架。目前，用这种方式合成微凝胶已涉及到很多水凝胶种类，如人工合成的聚乙二醇(PEG)类材料，天然的海藻酸盐、明胶、琼脂等；所利用的微流控液滴芯片也已基本包含套管类、聚焦流类和剪切流类等常见形式；利用这些技术和材料制备的微凝胶在细胞3D培养、干细胞诱导分化以及体外组织或器官构建方面存在很大的应用价值。然而，传统的液滴微流控技术都涉及到对有机相和表面活性剂的使用，其中有机溶剂需要后续的额外步骤进行清除，且清除效果不佳；而表面活性剂更是极易残留，且具有生物毒性；加之操作过程中细胞处于有机相包围环境中，物质交换受阻，限制了操作的时间。
近年来，微流控液滴体系中出现了利用双水相体系进行液滴制备的例子。与传统油水体系不同的是，该体系的两相溶液均为水溶液，具有更好的生物相容性。双水相体系利用的是聚合物的不相容性质，从而使两种不同聚合物的溶液在混合后可能自动分层，形成两相体系。最初，这一体系被用于双水相萃取，回收蛋白质等生物活性物质。目前，最常用的是PEG与Dextran构成的体系，这两种物质都有很好的生物相容性，近年来被引进到微流控液滴体系中。对这类液滴技术的研究主要集中在如何形成更稳定可控的液滴的方法方面。用于制备细胞3D培养微凝胶的研究尚未出现。本发明就致力于填补这一空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于微流控技术和双水相体系的微型水凝胶微球材料合成平台，致力于发展生物相容性更好的合成细胞3D培养水凝胶材料的方法。
本发明的技术解决方案是：一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，包括下列步骤：
(1)芯片泵阀的集成：利用常规软光刻的方法，制备PDMS芯片。在一个传统的“十字”流微流控液滴芯片中，集成气动阀控制系统，所述芯片主要由连续相入口，气体入口，分散相入口，液滴出口，分散相通道，气体通道，连续相通道，主通道和气动泵阀组成；连续相入口、分散相入口分别通过连续相通道、分散相通道与主通道连接，分散相通道与连续相通道汇聚到主通道处形成“十字”交叉口；气体入口经气体通道到达气动泵阀，其中的气体驱动泵阀侧壁发生弹性形变。
泵阀的位置在“十字”交叉口上游的分散相通道两侧，通过泵阀充气与静息两种状态周期性挤压分散相通道，从而使分散相间断性地进入连续相中，稳定可控地形成液滴；
(2)水凝胶材料的选择：选用生物相容性和稳定性都很好的聚乙二醇(PEG)-葡聚糖组成的双水相体系。所述PEG分子量范围：8000-20000Da、浓度范围：10-50％；葡聚糖分子量范围：70k-500kDa、浓度范围：10-30％。为了产生水凝胶微球，在分散相中可混入水凝胶预聚体。选用可以快速交联的水凝胶材料海藻素钠，使用的粘度范围：55-1000cps、浓度范围：0.1-2％；
(3)水凝胶微球合成及细胞负载：细胞经消化后，细胞密度为105-108个/ml的悬液与分散相溶液(PEG或葡聚糖)充分混匀后，作为整体通入到分散相通道中，经过泵阀的分离与连续相(葡聚糖或PEG)的维持作用，在主通道内稳定形成含有细胞的液滴。芯片出口0.5-4％通入CaCl2溶液中，快速原位交联海藻酸钠形成水凝胶微球，如图1所示。通过分散相流速(0.01-1μl/min)、连续相流速
(0.5-5μl/min)和泵阀开关周期(0.1-1s)的调节，可以控制液滴的大小、间距和其他参数。
(4)细胞的3D培养:经过(3)中制备的负载细胞的水凝胶微球可以经过离心收集，转速300-800rpm，1-3min，后直接转移到培养基中；即可在常规细胞培养条件下进行培养，培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养。期间可以进行相关生物学表征。
所述芯片主通道宽度100-300μm，长1-2cm。泵阀与分散相通道间距40-60μm，泵阀间的分散相通道宽40-60μm，芯片各部分通道高度均为100-300μm；
使用的水凝胶材料可以是任何能快速交联的物质；具体为：海藻酸钠、壳聚糖、光聚明胶、PEGDA等；可以进行负载的细胞包括有癌细胞、干细胞、内皮细胞等。
本发明利用生物相容性极佳的微流控双水相液滴作为载体可控合成均一的水凝胶微球，并用于细胞体外3D培养，基于双水相体系良好的生物相容性及微流控技术的精准控制，该方法在体外微组织构建等方面具有极大的应用价值。
附图说明
图1是泵阀芯片的结构示意图，其中：a总体图；b泵阀结构局部图；c水凝胶负载细胞原理图，
其中：1连续相入口；2气体入口；3分散相的入口；4液滴的出口；5分散相的通道；6气体通道；7连续相通道；8主通道；9气动泵阀。
图2是实例1中不含细胞的水凝胶微球的表征图，其中：a明场表征图(标尺：100μm)；b SEM表征图。
图3是实施例1中负载HepG2细胞的水凝胶微球，其中：a明场表征图(标尺：50μm)；b负载的细胞在7天内的活力表征。
图4是实施例2中负载β-TC-6细胞的水凝胶微球，其中：a明场表征图(标尺：100μm)；b负载的细胞在7天内的活力表征。
具体实施方式
在双水相液滴体系中加入水凝胶预聚体和细胞悬液，并通过集成的泵阀可控地形成均一的细胞负载液滴，然后经过快速原位交联反应制备水凝胶微球，对负载的细胞进行体外3D培养可进一步形成微组织。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，包括下列步骤：(1)芯片泵阀的集成：利用常规软光刻的方法，制备PDMS芯片。在一个传统的“十字”流微流控液滴芯片中，集成气动阀控制系统，所述芯片主要由连续相入口1，气体入口2，分散相入口3，液滴出口4，分散相通道5，气体通道6，连续相通道7，主通道8和气动泵阀9组成；连续相入口1、分散相入口3分别通过连续相通道7、分散相通道5与主通道8连接，分散相通道与连续相通道汇聚到主通道处形成“十字”交叉口；气体入口2经气体通道6到达气动泵阀9，其中的气体驱动泵阀侧壁发生弹性形变。
气动泵阀9的位置在“十字”交叉口上游的分散相通道5两侧，通过泵阀充气与静息两种状态周期性挤压分散相通道，从而使分散相间断性地进入连续相中，稳定可控地形成液滴。芯片主通道8宽度200μm，长1.5cm。泵阀9与分散相通道5间距50μm，泵阀间的分散相通道宽40μm，芯片各部分通道高度均为200μm。
(2)水凝胶材料的选择：选用生物相容性和稳定性都很好的聚乙二醇(PEG)-葡聚糖组成的双水相体系。所述PEG分子量为20kDa、浓度为17％；葡聚糖分子量为500kDa、浓度为15％。为了产生水凝胶微球，在分散相中混入海藻酸钠，使用的粘度为55cps、浓度为1％；
(3)制备水凝胶微球：在不混入细胞的条件下，以葡聚糖为分散相、PEG为连续相，制备单独的海藻酸钙微球。使用的条件为：分散相流速0.1μl/min，连续相流速2μl/min，泵阀开关周期0.4s。然后对制得的微球进行形貌表征，如图2所示。
(4)水凝胶微球合成及细胞负载：经消化后密度为6×106个/ml的HepG2细胞悬液与含有海藻酸钠的分散相溶液充分混匀后，作为整体通入到分散相通道中，经过泵阀的分离与连续相PEG的维持作用，在主通道8内稳定形成含有细胞的液滴。芯片出口4通入1％CaCl2溶液中，快速原位交联海藻酸钠形成水凝胶微球。使用的参数同3中。如图3a所示。
(5)细胞的3D培养:经过(4)中制备的负载细胞的水凝胶微球可以经过离心收集，转速500rpm，1min，后直接转移到DMEM培养基中；即可在常规细胞培养条件下进行培养，培养期间每隔2天换液一次，保证细胞营养。期间对细胞七天内的活力进行了表征，如图3b所示。
实施例2
一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)芯片泵阀的集成：利用常规软光刻的方法，制备PDMS芯片。在一个传统的“十字”流微流控液滴芯片中，集成气动阀控制系统。所述芯片主要由连续相入口1，气体入口2，分散相入口3，液滴出口4，分散相通道5，气体通道6，连续相通道7，主通道8和气动泵阀9组成；连续相入口1、分散相入口3分别通过连续相通道7、分散相通道5与主通道8连接，分散相通道与连续相通道汇聚到主通道处形成“十字”交叉口；气体入口2经气体通道6到达气动泵阀9，其中的气体驱动泵阀侧壁发生弹性形变。
气动泵阀9的位置在“十字”交叉口上游的分散相通道5两侧，通过泵阀充气与静息两种状态周期性挤压分散相通道，从而使分散相间断性地进入连续相中，稳定可控地形成液滴。芯片主通道8宽度200μm，长1.5cm。泵阀9与分散相通道5间距50μm，泵阀间的分散相通道宽40μm，芯片各部分通道高度均为200μm；
(2)水凝胶材料的选择：选用生物相容性和稳定性都很好的聚乙二醇(PEG)-葡聚糖组成的双水相体系。所述PEG分子量为20kDa、浓度为17％；葡聚糖分子量为500kDa、浓度为15％。为了产生水凝胶微球，在分散相中混入海藻素钠，使用的粘度为55cps、浓度为1％；
(3)水凝胶微球合成及细胞负载：经消化后密度为1×107个/ml的β-TC-6细胞悬液与含有海藻酸钠的分散相溶液葡聚糖充分混匀后，作为整体通入到分散相通道中，经过泵阀的分离与连续相PEG的维持作用，在主通道8内稳定形成含有细胞的液滴。芯片出口4通入1％CaCl2溶液中，快速原位交联海藻酸钠形成水凝胶微球。使用的参数：分散相流速0.2μl/min，连续相流速2μl/min，泵阀开关周期0.4s。如图4a所示。
(4)细胞的3D培养:经过(3)中制备的负载细胞的水凝胶微球可以经过离心收集，转速500rpm，1min，后直接转移到DMEM培养基中；即可在常规细胞培养条件下进行培养，培养期间每隔2天换液一次，保证细胞营养。期间对细胞七天内的活力进行了表征，如图4b所示。

Claims (3)

1.一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)芯片泵阀的集成：利用常规软光刻的方法，制备PDMS芯片；在一个传统的“十字”流微流控液滴芯片中，集成气动阀控制系统；所述芯片主要由连续相入口(1)，气体入口(2)，分散相入口(3)，液滴出口(4)，分散相通道(5)，气体通道(6)，连续相通道(7)，主通道(8)和气动泵阀(9)组成；
连续相入口(1)、分散相入口(3)分别通过连续相通道(7)、分散相通道(5)与主通道(8)连接，分散相通道与连续相通道汇聚到主通道处形成“十字”交叉口；气体入口(2)经气体通道(6)到达气动泵阀(9)，其中的气体驱动泵阀侧壁发生弹性形变；
气动泵阀(9)的位置在“十字”交叉口上游的分散相通道(5)两侧，通过泵阀充气与静息两种状态周期性挤压分散相通道，从而使分散相间断性地进入连续相中，稳定可控地形成液滴；
(2)水凝胶材料的选择：选用生物相容性和稳定性都很好的聚乙二醇(PEG)-葡聚糖组成的双水相体系；所述PEG分子量范围：8000-20000Da、浓度范围：10-50％；葡聚糖分子量范围：70k-500kDa、浓度范围：10-30％；
为了产生水凝胶微球，在分散相中可混入水凝胶预聚体；选用可以快速交联的水凝胶材料海藻素钠，使用的粘度范围：55-1000cps、浓度范围：0.1-2％；
(3)水凝胶微球合成及细胞负载：细胞经消化后，细胞密度为105-108个/ml的悬液与含有海藻酸钠的分散相溶液充分混匀后，通过分散相入口(3)作为整体通入到分散相通道(5)中，经过泵阀的分离与连续相的维持作用，在主通道(8)内稳定形成含有细胞的液滴；芯片出口(4)通入浓度为0.5-4％CaCl2溶液，快速原位交联海藻酸钠形成水凝胶微球；分散相流速0.01-1μl/min，连续相流速0.5-5μl/min，泵阀开关周期0.1-1s，通过分散相流速、连续相流速、和泵阀开关周期的调节，可以控制液滴的大小、间距和其他参数；
(4)细胞的3D培养:经过上述步骤制备的负载细胞的水凝胶微球可以经过离心收集，离心速率300-800rpm，1-3min，后直接转移到培养基中；即可在常规细胞培养条件下进行培养，培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征。
2.根据权利要求1所述的一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述芯片主通道(8)宽度100-300μm，长1-2cm；泵阀(9)与分散相通道(5)间距40-60μm，泵阀间的分散相通道宽40-60μm，芯片各部分通道高度均为100-300μm。
3.根据权利要求1所述的一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，其特征在于：使用的水凝胶材料是任何能快速交联的物质；具体为海藻酸钠、壳聚糖、光聚明胶、PEGDA；进行负载的细胞包括有癌细胞、干细胞、内皮细胞等。
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