CN110004111B - 一种类器官球体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种类器官球体的制备方法，所述制备方法包括：将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到细胞球体，经过培养后形成类器官球体；本发明提供的类器官球体的制备方法，利用微流控的方法生成单分散的生物材料类器官，实现了高通量生产，类器官的大小、形状和结构可控并且均一，相比于2D肿瘤敏感性预测模型，本发明制备的类器官结合了肿瘤微环境因素预测结果更准确；相比于PDX小鼠肿瘤敏感性预测模型，本发明的建模周期更短，费用更低；相比于普通的基因测序，本发明临床预测率更高；本发明提供的类器官的制备方法对于临床应用具有重要意义和价值，为相关结果的检测提供了重要的依据。

Description

一种类器官球体的制备方法
技术领域
本发明属于医疗器械领域，涉及一种类器官球体的制备方法。
背景技术
类器官(organoid)是体外三维(3D)培养构建出的多细胞团，具有自我更新和自我组织能力，并且维持了其来源组织的生理结构和功能的特点。肿瘤类器官则是来源于肿瘤组织的类器官，是研究肿瘤生物学新型有力工具。类器官技术是近十年来发展最为迅猛的一类体外培养技术，曾被誉为2013年度最为重要的科学进展之一。2014年，Lancaster和Knoblich正式对类器官做出了系统科学的定义，为类器官技术未来的发展奠定了理论基础。
目前类器官培养技术是将多能胚胎干细胞或者诱导多能干细胞包藏于细胞外基质matrigel中，然后在特定细胞因子的培养基中培养，例如含有表皮细胞生长因子、R-spondin蛋白和头蛋白足以长期维持小肠的类器官生长，而结肠来源的类器官需要添加烟酰胺、p38抑制剂SB202190、前列腺素E2和Alk抑制剂A83-01等。进过一段时间培养干细胞会形成器官特异性细胞类型集合并具有器官的某些特定的功能，如分泌，收缩等。目前已培养成功的类器官包括：脑、肺、肝、肾、前列腺、胰腺、结直肠等。
癌症一直是影响全球人体健康的最主要的问题，虽然近几年癌症的研究和治疗取得很多突破性的成果，包括免疫检查点的发现，CAR-T免疫疗法的诞生。但是随着越来越多的肿瘤药物及治疗方法的面世，临床病人可供选择药物也越来越多，基于患者的个体化治疗越来越受到医生和患者的重视。传统的肿瘤筛选模型主要是2D肿瘤细胞系模型，该模型虽然培养简单建模速度快，但由于缺乏肿瘤微环境导致肿瘤基因表达改变，不能很好的反应生理情况下肿瘤的生长，因此基于3D培养的肿瘤类器官能够为肿瘤的研究和治疗提供可靠的模型。目前肿瘤类器官的模型大多停留在实验阶段，很难进行高通量的药物筛选，同时不同大小的类器官在一定程度上影响实验结果的准确性。
微流控技术是一项在微米尺度空间对流体进行操控的技术，以其高通量、高灵敏度、低消耗等优点备受研究者关注，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。微流控技术主要应用流体的层流和液滴现象。层流与湍流相对应，是指流体的层状流动，其流线与管壁相互平行。在粘性力远远大于惯性力，或雷诺数小于3000时，层流就会出现。当几相不同颜色的流体从不同的入口进入同一个微通道时，即使它们互溶，也会形成层次分明的多相平行流动。利用层流的这种几何规律性，可以实现材料、化学环境和细胞在微通道中的有序排布。微流控能够以非常高的通量制备高度单分散性的液滴乳液。常见的微通道结构为T型和ψ型。在某些情况下，含有不同高分子聚合物的水相液体在微流控通道中也会形成不互溶的液滴。
CN109136185A公开了一种类脑器官器的制备方法和应用，具体是提供干细胞在体外分化发育形成三维结构且具有血管结构的类皮层组织结构(cortical organoid)的方法和培养条件。而且随着持续的培养还能够建立具有神经元功能和成熟神经环路连接的3D体系，使其更加接近于大脑皮层从胚胎期神经发生到出生后突触发育和功能建立的发育过程。用此培养系统培养的产品可以应用于疾病研究和药物筛选等。
CN108486035A公开了一种三维类器官的液滴培养方法，涉及一种三维类器官的液滴培养方法以及其在生物医学中的应用。将移液枪头与常规细胞培养方法相结合，利用移液枪头形成球形构象的液滴作为培养载体，在其中培养制备毫米级的三维类器官组织。通过对移液枪头剪截位置、注入液体体积、液滴与截面间的接触角角度等因素的筛选分析，获得了比较理想的类器官液滴培养条件。但是这种方法无法保证均一性，操控性较差。
因此，如何开发一种制备类器官的形状大小均一、达到高通量生产并使得应用临床时抗癌药物预测准确度高对于类器官的应用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种类器官球体的制备方法，以解决现有方法制备类器官存在的无法高通量制备，生成的类器官形状大小不均一，影响预测结果的准确性和可重复性的问题。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种类器官球体的制备方法，所述制备方法包括：所述制备方法包括：将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到细胞球体，经过培养后形成类器官球体。
本发明提供的类器官球体的制备方法，利用微流控的方法生成单分散的生物材料类器官，实现了高通量生产，类器官的大小、形状和结构可控并且均一，相比于2D肿瘤敏感性预测模型，本发明制备的类器官结合了肿瘤微环境因素预测结果更准确；相比于PDX小鼠肿瘤敏感性预测模型，本发明的建模周期更短，费用更低；相比于普通的基因测序，本发明临床预测率更高。
目前抗肿瘤药物繁多，同时肿瘤存在异质性以及患者对于药物敏感性差异，导致病人无法得到最优的个体化治疗。现有的抗癌药物敏感性测试模型包括2D肿瘤细胞模型和PDX模型，2D细胞肿瘤细胞模型由于缺失了肿瘤组织微环境，对抗癌药物的预测准确率较低，而PDX小鼠模型周期过长，成本太高，成功率太低，且存在物种差异性而导致预测不准确。
此外，传统的肿瘤类器官制作过程无法做到高通量的应用，无法应用于大量的药物筛选，同时生成的类器官形状大小不一，一定程度上影响结果的准确性和可重复性。
优选地，所述含细胞的基质胶由细胞与基质胶混合后制备得到。
优选地，所述细胞的个数为1.0×105～1.0×107个；，例如可以是1.0×105个、1.0×106个、2.0×106个、3.0×106个、4.0×106个、5.0×106个、1.0×107个等，优选为2.0×106个。
在本发明中，细胞的个数不能过高或者过低，如果细胞个数过低，则细胞几乎不能够生长；如果细胞的个数过高，则会使得形成的球体易爆。
优选地，所述细胞为原代细胞。
本发明所述原代细胞经过提取得到。原代细胞提取方法：通过手术或穿刺得到的癌组织或动物组织，4度条件下剪切成1mm左右的小块，利用I型胶原酶在37度细胞培养箱中消化1小时，利用100μm滤网过滤细胞，利用红细胞裂解液裂解红细胞，离心并用培养基重悬细胞，细胞计数后备用。
优选地，所述基质胶的体积为10～1000μL，例如可以是10μL、50μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、550μL、600μL、650μL、700μL、750μL、800μL、850μL、900μL、950μL或1000μL等，优选为100μL。
优选地，所述混合的温度为2～8℃，例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等，优选为4℃。
在本发明中，氟油能够更好的产生液滴现象，对于含细胞的基质胶能够产生良好的液液界面张力和剪切力作用，使得含细胞的基质胶流体形成高度均一的间断流，而氟油与含细胞的基质胶会形成乳液，通过这种微流控的方法，自下而上的将类器官剪切包裹成球体，使得最终可形成类器官球体。
优选地，所述通入的方法为注射。
本发明所述通入的方法不仅限于注射，任何可以将两种液体加入到三通中的方法均适用于本发明。
优选地，所述注射的方法为：将含细胞的基质胶和氟油分别置于两个注射装置中，然后分别通过管道注射进三通装置中。
在本发明中，注射装置一般通过管道与三通装置的其中两个管道连接，三通装置的另一个管道用来转移形成的类器官。
优选地，所述含细胞的基质胶的流速为1～100μL/min，例如可以是1μL/min、5μL/min、10μL/min、15μL/min、16μL/min、17μL/min、18μL/min、19μL/min、20μL/min、21μL/min、22μL/min、23μL/min、24μL/min、25μL/min、30μL/min、40μL/min、50μL/min、60μL/min、70μL/min、80μL/min、90μL/min、100μL/min等，优选为20μL/min。
优选地，所述氟油的流速为1～500μL/min；例如可以是1μL/min、5μL/min、10μL/min、15μL/min、20μL/min、25μL/min、30μL/min、40μL/min、45μL/min、46μL/min、47μL/min、48μL/min、49μL/min、50μL/min、51μL/min、52μL/min、53μL/min、54μL/min、55μL/min、75μL/min、100μL/min、200μL/min、300μL/min、400μL/min、500μL/min等，优选为50μL/min。
优选地，所述注射装置的温度为2～8℃，例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等，优选为4℃。
优选地，所述管道的直径为200～1000μm，例如可以是200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，优选为800μm。
优选地，所述培养的方法为经过凝固后，置于培养基中培养。
优选地，所述凝固的温度为35～40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等，优选为37℃。
在本发明中，加热的过程使得类器官凝固，如果不经过加热过程，类器官则不能够形成规则的球体形状，影响其均一稳定可控的效果。
优选地，所述凝固在含有浓度为5％的CO2的气氛下进行，之后得到类器官。
本发明所述浓度为5％的CO2指的是普通空气中，通入一定量的CO2后使得混合气体中CO2体积占比为5％。
优选地，所述培养的培养基为DMEM/F12培养基。
优选地，所述改良的DMEM/F12培养基含有生长因子。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：所述制备方法包括以下步骤：将1.0×105～1.0×107个细胞与10～1000μL基质胶在2～8℃下混合得到含细胞的基质胶，然后将含细胞的基质胶和氟油分别置于两个温度为2～8℃的注射装置中，分别通过直径为200～1000μm的管道注射进三通装置中得到细胞球体，其中含细胞的基质胶的流速为1～100μL/min，氟油的流速为1～500μL/min；而后将生成的细胞球体在温度为35～40℃，含有浓度为5％的CO2的气氛下进行凝固，加入改良的DMEM/F12培养基培养得到类器官球体。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的类器官球体的制备方法，利用微流控的方法生成单分散的生物材料类器官，实现了高通量生产，类器官的大小、形状和结构可控并且均一，相比于2D肿瘤敏感性预测模型，本发明制备的类器官结合了肿瘤微环境因素预测结果更准确；相比于PDX小鼠肿瘤敏感性预测模型，本发明的建模周期更短，费用更低；相比于普通的基因测序，本发明临床预测率更高；综上可知，本发明提供的类器官的制备方法对于临床应用具有重要意义和价值，为相关结果的检测提供了重要的依据。
附图说明
图1是本发明提供的一种类器官制备过程的示意图。
图2是本发明中水相和氟油汇合的局部放大图。
图3是本发明实施例1中制备的类器官球体。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明提供的其中一种制备过程示意图如图1所示，由图1可以看出，水相中的含细胞的基质胶由其中一个注射器进入三通，氟油由另一个注射器进入三通，而后在三通中汇合形成类器官。其中，图2是图1中的三通中两相汇合的局部放大图，由图2可以看出形状大小均一的类器官的形成过程。
本发明所用的基质胶品牌：R&D systems，货号：3533-010-02。
本发明所述改良的(Advanced)DMEM/F12培养基组成：20％胎牛血清，100ng/mLNoggin，50ng/mL FGF4,50ng/mL FGF-basic,200ng/mL R-spondin 1。
实施例1
本实施例提供一种类器官球体的制备方法，包括以下步骤：
利用原代细胞提取方法提取原代细胞，细胞计数；在4℃环境中将2.0×106个原代细胞与100μL基质胶充分混匀，注入1mL注射器中，另外一个注射器注入氟油，分别将氟油和基质胶分别置于两个注射泵中并放入4℃冰箱；注射器分别连接直径为800μm的聚四氟乙烯(PTFE)管，两管汇合至聚二甲基硅氧烷(PMDS)三通装置中得到细胞球体，然后三通装置连接另外一根直径800μm的PTFE管，整个平台置于4℃冰箱中；含基质胶注射泵流速20μL/min，含氟油注射泵流速50μL/min，然后将细胞球体在37℃下，含有浓度为5％的CO2的气氛下进行凝固，最后加入改良的DMEM/F12培养基进行培养得到类器官球体。得到的类器官球体显微镜观察图如图3所示。
由图3可知，得到的类器官球体形状、大小均一。
实施例2
本实施例提供一种类器官球体的制备方法，包括以下步骤：
利用原代细胞提取方法提取原代细胞，细胞计数；在4℃环境中将5.0×106个原代细胞与200μL基质胶充分混匀，注入1mL注射器中，另外一个注射器注入氟油，分别将氟油和基质胶分别置于两个注射泵中并放入4℃冰箱；注射器分别连接直径为800μm的聚四氟乙烯(PTFE)管，两管汇合至聚二甲基硅氧烷(PMDS)三通装置中得到细胞球体，然后三通装置连接另外一根直径800μm的PTFE管，整个平台置于4℃冰箱中；含基质胶注射泵流速25μL/min，含氟油注射泵流速55μL/min，然后将细胞球体在37℃下，含有浓度为5％的CO2的气氛下进行凝固，最后加入改良的DMEM/F12培养基进行培养得到类器官球体。
实施例3
本实施例提供一种类器官球体的制备方法，包括以下步骤：
利用原代细胞提取方法提取原代细胞，细胞计数；在4℃环境中将1.0×106个原代细胞与80μL基质胶充分混匀，注入1mL注射器中，另外一个注射器注入氟油，分别将氟油和基质胶分别置于两个注射泵中并放入4℃冰箱；注射器分别连接直径为600μm的聚四氟乙烯(PTFE)管，两管汇合至聚二甲基硅氧烷(PMDS)三通装置中得到细胞球体，然后三通装置连接另外一根直径600μm的PTFE管，整个平台置于4℃冰箱中；含基质胶注射泵流速15μL/min，含氟油注射泵流速45μL/min，然后将细胞球体在37℃下，含有浓度为5％的CO2的气氛下进行凝固，最后加入改良的DMEM/F12培养基进行培养得到类器官球体。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例原代细胞的个数为3.0×107个，其余均与实施例1相同。
由于细胞数过多，基质胶粘稠度增加，氟油所产生的剪切力不足以匀速快速切割基质胶，导致形成的类器官球体大小不一，同时形成的球体不易交连成型，易破损。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例原代细胞的个数为0.1×105个，其余均与实施例1相同。
由于细胞数过低，细胞之间相互作用降低，细胞生长较慢，不能够达到快速筛选药物的目的。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，不使用三通装置，而是直接将氟油和含原代细胞的基质胶混合。
由于没有三通装置，氟油和含原代细胞的基质胶是不相容的，会形成氟油在下，水相在上的分成。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的类器官球体的制备方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (12)

1.一种类器官球体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到细胞球体，经过培养后形成类器官球体；
所述含细胞的基质胶由细胞与基质胶混合后制备得到；
所述细胞的个数为1.0×106~5.0×106个；
所述培养的方法为经过凝固后，置于培养基中培养；
所述凝固的温度为35~40℃；
所述凝固在含有浓度为5%的CO2的气氛下进行；
所述培养的培养基为改良的DMEM/F12培养基；
所述改良的DMEM/F12培养基含有生长因子；
所述细胞为原代细胞；
所述基质胶的体积为80~200 μL；
所述混合的温度为2~8℃；
所述含细胞的基质胶的流速为10~50 μL/min；
所述氟油的流速为10~75 μL/min；
所述管道的直径为400~900 μm。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞的个数为2.0×106个。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基质胶的体积为100 μL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合的温度为4℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述通入的方法为注射。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述注射的方法为：将含细胞的基质胶和氟油分别置于两个注射装置中，然后分别通过管道注射进三通装置中。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含细胞的基质胶的流速为20 μL/min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氟油的流速为50 μL/min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述注射装置的温度为2~8℃。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述注射装置的温度为4℃。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述管道的直径为800 μm。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述凝固的温度为37℃。
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