CN108486035B - 一种三维类器官的液滴培养方法 - Google Patents

一种三维类器官的液滴培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术和细胞培养技术领域，尤其涉及一种三维类器官的液滴培养方法以及其在生物医学中的应用。本发明将移液枪头与常规细胞培养方法相结合，利用移液枪头形成球形构象的液滴作为培养载体，在其中培养制备毫米级的三维类器官组织。本发明通过对移液枪头剪截位置、注入液体体积、液滴与截面间的接触角角度等因素的筛选分析，获得了比较理想的类器官液滴培养条件。同时，本发明可以通过对上述条件的适时调整，对三维类器官的形态(形状和大小)进行灵活有效的控制。此外，本发明方法还具有操作简便、培养成本低廉、培养效率高等优点。本发明方法培养制备的毫米级三维类器官组织可满足在个性化治疗早期进行体外药物筛选的需要。

Description

一种三维类器官的液滴培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术和细胞培养技术领域，尤其涉及一种三维类器官的液滴培养方法以及其在生物医学中的应用。
背景技术
类器官(Organoid)，是一类三维细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性，此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能。
近年来，以三维类器官模型为基础的生物医学研究已获得长足发展。由于类器官具有自我更新、自我组织能力并能够在相当程度上展示器官功能，因此其不仅仅可以作为提供物理支持的基质，还具有提供生物化学线索、调节信号通路、模拟组织在体内的特定功能和行为、参与体外药物筛选等多种用途。到目前为止，研究人员已培养获得了一系列的类器官组织，包括视网膜、肾、肠、胃、胰腺、肺、脑、肝等类器官，其应用范围涉及到基础研究、再生医学、新药开发、疾病的诊断和治疗等多个领域。
然而，目前的三维类器官培养技术仍具有许多严重的缺陷，例如操作过程繁冗复杂、成本高昂、器官形态(形状和大小)不可控等。生物医学领域亟待着新的类器官培养技术的出现。
另一方面，微液滴培养技术由于其培养载体特有的流体特性和球体形状而受到极大的关注。液滴技术早期被用来生产球形的微型有机化合物，后来被引入到细胞培养中，细胞在液滴中培养增殖，液滴底部的液体-空气界面大大降低了细胞粘附的风险，现今百微米级大小的微组织已被成功地培养。2014年，一个基于吊滴技术的“身体-芯片”微流体平台出现，并已得到商业化推广。然而，液滴培养技术由于受到培养腔尺度的限制，多用于生产微米尺度的肿瘤类器官并进行学术研究，尚未见到利用其进行毫米级三维类器官培养并应用于临床研究的相关报道。与此同时，目前宏观尺度的类器官培养设备仍饱受着产量低、费用高、操作复杂等因素的困扰。
发明内容
为了克服现有三维类器官培养技术存在的缺陷，并为液滴培养技术探索开辟新的适用领域，本发明在反复实验的基础上，建立了一种全新的三维类器官的液滴培养方法，并对各项培养条件进行了筛选和优化，本发明方法可推广适用于各种类器官组织的培养，以满足生物医学领域中的各类研究需求。
本发明将移液枪头(或吸管)与常规细胞培养方法相结合，利用移液枪头形成球形构象的液滴作为培养载体，在其中培养制备毫米级的三维类器官组织，本发明方法通过控制液滴的大小及形状，可对所制备的三维类器官的形态和结构产生独特的控制能力，从而克服现有三维类器官培养技术在培养过程中无法有效控制器官形态(形状和大小)的缺陷。本发明方法培养制备的毫米级三维类器官组织可基本满足在个性化治疗早期进行体外药物筛选的需要。
本发明三维类器官的液滴培养方法，包括下述步骤：
(1)取100μl标准移液枪头，用剪刀将所述标准移液枪头在距其尖端5-11mm的位置平齐截断，将截面打磨光滑平整，90℃消毒灭菌30min后备用；
(2)将小鼠胚胎3T3成纤维细胞与待培养的类器官细胞分别培养至生长旺盛期，待其均铺满细胞培养瓶后，分别加入Trypsin将3T3成纤维细胞与待培养的类器官细胞消化1min，随后加入新鲜DMEM培养液终止消化并用移液枪将细胞轻轻吹打到DMEM培养液中，将所得DMEM培养液800r/min离心5min收集细胞，然后向所收集的细胞中加入新鲜DMEM培养液并吹打成细胞悬浮液，将细胞浓度均控制为106个/ml，并按照1﹕1的细胞数量比例将两者混合均匀，即得到3T3成纤维细胞-待培养类器官细胞混合液；
(3)将上述经过处理的移液枪头尖端向下竖直放置，从其上端向其中注入40-100μl的所述3T3成纤维细胞-待培养类器官细胞混合液，细胞混合液在重力作用下向移液枪头下端移动，并通过液体表面张力在移液枪头下端形成液滴，该液滴的下凹液面即为细胞的生长附着基底层，细胞堆积在液滴的下凹液面上，形成三维组织，在水接触角仪下观察移液枪头下端所形成的液滴与移液枪头截面间的接触角，并将液滴与截面间的接触角角度控制在26°-33°；
(4)将上述载有细胞混合液的移液枪头放入细胞培养箱内培养一周，培养箱温度控制为37℃，二氧化碳浓度控制为5％，每间隔一天用移液枪吸出一半上清培养液，同时加入等体积新鲜的DMEM培养液，具有球形形态、结构致密的类器官组织在培养的第三天开始形成，培养一周后即获得毫米级的三维类器官。
在实验中，我们在100μl标准移液枪头距其尖端5-11mm的不同位置进行了剪截，从而获得了不同直径的开口截面，并通过从移液枪头上端开口注入不同体积溶液，在其下端开口处形成不同曲率的液滴，在此基础上，通过优化加载溶液的体积来获得具有最理想接触角的液滴，该液滴应该兼具良好的稳定性、尽可能大的斜面曲率和最佳的球状结构。经反复测试，我们发现，无论在移液枪头的哪个位置进行剪截，当液滴与截面间的接触角角度处于26°-33°之间时，所得到的液滴最有利于进行类器官组织培养，而当液滴与截面间的接触角角度为30°时，其各项培养性能最佳(参见附图1-2)。
同时，我们还观察到，所培养的类器官的形状主要取决于悬挂液滴的形状，当液滴与截面间的接触角角度大于30°时，类器官形状接近球体，而当接触角较小时，类器官形状不规则，由此也证明了利用本方法培养类器官对器官结构和形态具有相当的可控性。其原因在于，在没有摩擦力的情况下，单个细胞的定位是由相邻细胞提供的重力和反作用力的平衡决定的，当接触角较大时，使细胞向液滴底部迁移的重力作用更大，从而将细胞推到液滴底部，随着时间的推移，在相邻细胞的帮助作用下细胞聚集在液滴底部的概率明显更高，逐渐累积的细胞聚集成三维类器官组织结构。
因此，优选地，本发明三维类器官的液滴培养方法，其第(3)步骤中从移液枪头上端向其中注入50-80μl的3T3成纤维细胞-待培养类器官细胞混合液。
还优选地，其第(3)步骤中将液滴与截面间的接触角角度控制为30°。
进一步地，本发明三维类器官的液滴培养方法，其中所述待培养的类器官细胞为人体肿瘤细胞。
优选地，上述人体肿瘤细胞为人肝肿瘤HepG2细胞。
作为一种具体的优选方案，本发明三维类器官的液滴培养方法，包括下述步骤：
(1)取100μl标准移液枪头，用剪刀将所述标准移液枪头在距其尖端8mm的位置平齐截断，将截面打磨光滑平整，90℃消毒灭菌30min后备用；
(2)将小鼠胚胎3T3成纤维细胞与人肝肿瘤HepG2细胞分别培养至生长旺盛期，待其均铺满细胞培养瓶后，分别加入Trypsin将3T3成纤维细胞与HepG2细胞消化1min，随后加入新鲜DMEM培养液终止消化并用移液枪将细胞轻轻吹打到DMEM培养液中，将所得DMEM培养液800r/min离心5min收集细胞，然后向所收集的细胞中加入新鲜DMEM培养液并吹打成细胞悬浮液，将细胞浓度均控制为106个/ml，并按照1﹕1的细胞数量比例将两者混合均匀，即得到3T3成纤维细胞-HepG2细胞混合液；
(3)将上述经过处理的移液枪头尖端向下竖直放置，从其上端向其中注入80μl的所述3T3成纤维细胞-HepG2细胞混合液，细胞混合液在重力作用下向移液枪头下端移动，并通过液体表面张力在移液枪头下端形成液滴，该液滴的下凹液面即为细胞的生长附着基底层，细胞堆积在液滴的下凹液面上，形成三维组织，在水接触角仪下观察移液枪头下端所形成的液滴与移液枪头截面间的接触角，并将液滴与截面间的接触角角度控制为30°；
(4)将上述载有细胞混合液的移液枪头放入细胞培养箱内培养一周，培养箱温度控制为37℃，二氧化碳浓度控制为5％，每间隔一天用移液枪吸出一半上清培养液，同时加入等体积新鲜的DMEM培养液，具有球形形态、结构致密的肝脏类器官组织在培养的第三天开始形成，培养一周后即获得毫米级的三维肝脏类器官。
此外，本发明还涉及上述三维类器官的液滴培养方法在制备类器官培养试剂盒中的应用。
本发明还涉及上述三维类器官的液滴培养方法在制备体外药物筛选系统中的应用。
综上，本发明将移液枪头与常规细胞培养方法相结合，利用移液枪头形成球形构象的液滴作为培养载体，在其中培养制备毫米级的三维类器官组织。本发明通过对移液枪头剪截位置、注入液体体积、液滴与截面间的接触角角度等因素的筛选分析，获得了比较理想的类器官液滴培养条件。同时，本发明可以通过对上述条件的适时调整，对三维类器官的形态(形状和大小)进行灵活有效的控制。本发明由于作为培养载体的液滴底部表面是液体-空气界面，因此可避免不利的细胞粘附(尤其是针对HepG2等粘附性强的细胞)，并且有利于最大限度的保留三维类器官组织功能，同时，本发明采用开放的培养体系，可保证良好的气体交换(氧气和二氧化碳)和养分输送，为细胞提供理想培养环境。此外，本发明方法还具有操作简便、培养成本低廉、培养效率高等优点。本发明方法的出现在一定程度上克服了现有三维类器官培养技术的缺陷，并为液滴培养技术探索开辟新的适用领域，本发明方法培养制备的毫米级三维类器官组织可基本满足在个性化治疗早期进行体外药物筛选的需要，不仅如此，本发明方法还可推广适用于各种类器官组织的培养，以满足生物医学领域中的各类研究需求。
附图说明
图1为类器官液滴培养技术示意图(图注：A图为操作流程图，其中(1)在距100μl移液枪头尖端5-11mm的位置平齐截断；(2)将截面打磨光滑平整；(3)将细胞混合液注入移液枪头；(4)细胞集中在液滴底部，形成三维组织；B图为注入不同体积溶液所形成的液滴弯曲面，其中(1)注入50μl溶液；(2)注入80μl溶液；C图为当截断位置不同时，注入不同体积溶液所形成的液面曲率)。
图2为液滴形状对三维组织结构的影响示意图(图注：A图为明场下液滴内形成的三维组织，当液滴与截面间的接触角超过30°时能形成球形度高、更加均匀的三维组织；B图为细胞在液滴下凹液面曲线累积示意图，当液滴与截面间的接触角越大时，促使细胞迁移和聚集在液滴底部的分力越大，细胞累积概率越大)。
图3为三维肝脏类器官z-stack荧光成像检测图(图注：A图为明场下三维肝脏类器官的图像；B图为三维肝脏类器官纵剖面细胞分布示意图，图中显示3T3成纤维细胞和HepG2细胞自组织成分层结构，HepG2细胞集中分布在内核区域，通过自动化z-stack倒置显微镜成像，1-4层对应不同的z轴位置；C图为不同层面上肝脏类器官的荧光图像，荧光信号来源于3T3成纤维细胞中的H2B-GFP荧光标记物)。
图4为三维肝脏类器官Calcein-AM/PI组织染色检测图(图注：A图为三维肝脏类器官的明场(BF)和荧光图像(GFP)；B图为在96孔板中用Calcein-AM/PI对肝脏类器官组织染色20min后，分别在明场(BF)、FITC(Calcein-AM)和TRITC(PI)通道下拍摄的图像；C图为合并通路后的图像)。
图5为利用AO/EB染色法测定肝脏类器官中3T3成纤维细胞和HepG2细胞活性示意图(图注：A图为用AO/EB染色后肝脏类器官的明场图像，其中HepG2细胞和3T3成纤维细胞的比率为100﹕1；B图为用AO/EB染色后肝脏类器官的荧光图像，其中HepG2细胞和3T3成纤维细胞的比率为10﹕1；C图为3T3成纤维细胞和HepG2细胞对氧化铁纳米粒子的吸收量；D图为AMF治疗(300KHz，30A)10min后3T3成纤维细胞和HepG2细胞的细胞活性，在本实验中，所有肝脏类器官组织与氧化铁纳米粒子孵化24h后用AMF处理10min；E图为细胞活性对氧化铁纳米粒子内吞量归一化结果)。
注：附图2-5中所有标尺均为200μm。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例
(一)三维类器官的液滴培养方法
(1)取Thermo的100μl标准移液枪头，用剪刀将该标准移液枪头在距其尖端5-11mm的位置平齐截断，将截面打磨光滑平整，避免由于管壁长度不同造成液滴形貌不规则，90℃消毒灭菌30min后备用。
(2)将小鼠胚胎3T3成纤维细胞与人肝肿瘤HepG2细胞分别培养至生长旺盛期，待其均铺满细胞培养瓶后，分别加入Trypsin将3T3成纤维细胞与HepG2细胞消化1min，随后加入新鲜DMEM培养液终止消化并用移液枪将细胞轻轻吹打到DMEM培养液中，将所得DMEM培养液800r/min离心5min收集细胞，然后向所收集的细胞中加入新鲜DMEM培养液并吹打成细胞悬浮液，将细胞浓度均控制为106个/ml，并按照1﹕1的细胞数量比例将两者混合均匀，即得到3T3成纤维细胞-HepG2细胞混合液。
(3)将上述经过处理的移液枪头尖端向下竖直放置，从其上端向其中注入40-100μl的3T3成纤维细胞-HepG2细胞混合液，细胞混合液在重力作用下向移液枪头下端移动，并通过液体表面张力在移液枪头下端形成液滴，该液滴的下凹液面即为细胞的生长附着基底层，细胞堆积在液滴的下凹液面上，形成三维组织(实验设置为不同截面的枪头分别注入细胞混合液40-60μl，每组设置三个样本)，在水接触角仪下观察移液枪头下端所形成的液滴与移液枪头截面间的接触角，并将液滴与截面间的接触角角度控制为30°(参见附图1-2)。
(4)将上述载有细胞混合液的移液枪头放入细胞培养箱内培养一周，培养箱温度控制为37℃，二氧化碳浓度控制为5％，每间隔一天用移液枪吸出一半上清培养液，同时加入等体积新鲜的DMEM培养液，注意不要把液滴底部的类器官组织吸出。具有球形形态、结构致密的肝脏类器官组织在培养的第三天即开始形成，因为3T3成纤维细胞分泌的Fibronectin能够促进细胞与细胞之间的粘连，促使HepG2细胞粘连生长，并形成致密的类器官结构，培养一周后即获得毫米级的三维肝脏类器官。
(二)三维肝脏类器官检测
(1)z-stack荧光成像检测
向96孔板中加入100μl预热至37℃的DMEM培养液，取出培养获得的三维肝脏类器官加入到96孔板中，将其置于倒置荧光显微镜下观察细胞的状态；在倒置荧光显微镜下设置Z方向，调整Z轴，将拍摄STEP设置为20mm/step，分别在Bright Field、FITC和TRITC三个通道进行拍摄，并将拍摄的多层照片进行三维重构(参见附图3)。
z-stack荧光成像检测结果显示：在液滴中混合培养3T3成纤维细胞和HepG2细胞，最终形成了一种具有分层结构的三维肝脏类器官组织，3T3成纤维细胞均匀分布在类器官组织的边缘位置，并形成一个致密的外壳。
(2)Calcein-AM/PI组织染色检测
Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，当其进入细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)并留存在细胞内，发出强绿色荧光(激发光：490nm，发射光：515nm)，由于其细胞毒性很低，因此适合作为细胞染料。作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜，但其能够穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发光：535nm，发射光：617nm)，因此PI仅对死细胞染色。
配制Calcein-AM/PI染色剂，其中Calcein-AM的终浓度为2μmol/l，PI的终浓度为4μmol/l。取100μl Calcein-AM/PI染色剂加入到含肝脏类器官的96孔板中，随后放入培养箱中培养8h，使染色剂与类器官中的细胞充分结合。在与z-stack荧光成像检测相同的拍摄条件下对类器官进行拍摄。观察类器官的形态与荧光分布情况，通过荧光分布能反映出类器官中单个细胞的活性，以及类器官中HepG2细胞与3T3成纤维细胞的分布情况(参见附图4)。
Calcein-AM/PI组织染色检测结果显示：死亡细胞大多是HepG2细胞(缺乏H2B-GFP信号)，并集中在类器官的核心区域。此发现与先前的研究结果一致，即位于核心区域的细胞因缺氧和营养不足而更易于死亡。
(三)用于磁疗治疗的类器官模型
我们还研究了纳米颗粒的磁性热疗(MHT)对液滴培养获得的肝脏类器官的影响，以验证该策略是否适用于临床前药物筛选和治疗试验，我们发现磁性热疗的效率取决于肝脏类器官的结构。结果显示：肝脏类器官组织在形态上是松散的，没有任何迹象表明有3T3成纤维细胞形成的外壳，而且很有可能是由于没有壳层导致了肝脏类器官组织的不规则边缘。在没有壳层的情况下，小分子(AO)从细胞生长缝隙中渗透到组织中心，因此在组织中心可以观察到均匀分布的荧光信号。在高比例3T3成纤维细胞含量的情况下，AO荧光集中在边缘，与暗中心区域形成对比，显示出一个密集的壳层。加入大小为7nm的磁性纳米粒子(MNPs)并培养12h后，将肝脏类器官组织放置在高频率的交变磁场中10min。与AO的情况相似，死细胞染色主要集中在外壳和核心区域。很可能类似于AO这样的小分子，它们的扩散和交变磁场所驱动的穿透性被肝脏类器官的外壳所抑制。通过消解肝脏类器官并测定Fe的含量，对每个细胞的Fe3O4吸收量进行评估，与我们的假设相一致的是，在单层细胞培养(最多18pg/细胞)中，Fe3O4的吸收量是最高的，而肝脏类器官组织中的吸收量最低，由此证实了类器官外壳对MNPs的入侵有抑制作用。在10min的磁性热疗后，肝脏类器官组织内的整体细胞生存能力与铁吸收量呈负相关。在MHT热疗过程中，通过使细胞生存能力值归一化到Fe3O4吸收量来测定MNPs的效率，我们发现，将HepG2细胞维持为单层细胞时，MHT效应诱导细胞凋亡的作用最为显著，并且在热疗肝脏类器官的过程中效率最低(参见附图5)。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (8)

1.一种三维类器官的液滴培养方法，其特征在于：所述液滴培养方法包括下述步骤：
（1）取100μl标准移液枪头，用剪刀将所述标准移液枪头在距其尖端5-11mm的位置平齐截断，将截面打磨光滑平整，90℃消毒灭菌30min后备用；
（2）将小鼠胚胎3T3成纤维细胞与待培养的类器官细胞分别培养至生长旺盛期，待其均铺满细胞培养瓶后，分别加入Trypsin将3T3成纤维细胞与待培养的类器官细胞消化1min，随后加入新鲜DMEM培养液终止消化并用移液枪将细胞轻轻吹打到DMEM培养液中，将所得DMEM培养液800r/min离心5min收集细胞，然后向所收集的细胞中加入新鲜DMEM培养液并吹打成细胞悬浮液，将细胞浓度均控制为106个/ml，并按照1﹕1的细胞数量比例将两者混合均匀，即得到3T3成纤维细胞-待培养类器官细胞混合液；
（3）将上述经过处理的移液枪头尖端向下竖直放置，从其上端向其中注入40-100μl的所述3T3成纤维细胞-待培养类器官细胞混合液，细胞混合液在重力作用下向移液枪头下端移动，并通过液体表面张力在移液枪头下端形成液滴，该液滴的下凹液面即为细胞的生长附着基底层，细胞堆积在液滴的下凹液面上，形成三维组织，在水接触角仪下观察移液枪头下端所形成的液滴与移液枪头截面间的接触角，并将液滴与截面间的接触角角度控制在26°-33°；
（4）将上述载有细胞混合液的移液枪头放入细胞培养箱内培养一周，培养箱温度控制为37℃，二氧化碳浓度控制为5%，每间隔一天用移液枪吸出一半上清培养液，同时加入等体积新鲜的DMEM培养液，具有球形形态、结构致密的类器官组织在培养的第三天开始形成，培养一周后即获得毫米级的三维类器官。
2.如权利要求1所述的三维类器官的液滴培养方法，其特征在于第（3）步骤中将液滴与截面间的接触角角度控制为30°。
3.如权利要求1所述的三维类器官的液滴培养方法，其特征在于第（3）步骤中从移液枪头上端向其中注入50-80μl的3T3成纤维细胞-待培养类器官细胞混合液。
4.如权利要求1所述的三维类器官的液滴培养方法，其特征在于所述待培养的类器官细胞为人体肿瘤细胞。
5.如权利要求4所述的三维类器官的液滴培养方法，其中所述人体肿瘤细胞为人肝肿瘤HepG2细胞。
6.如权利要求1所述的三维类器官的液滴培养方法，包括下述步骤：
（1）取100μl标准移液枪头，用剪刀将所述标准移液枪头在距其尖端8mm的位置平齐截断，将截面打磨光滑平整，90℃消毒灭菌30min后备用；
（2）将小鼠胚胎3T3成纤维细胞与人肝肿瘤HepG2细胞分别培养至生长旺盛期，待其均铺满细胞培养瓶后，分别加入Trypsin将3T3成纤维细胞与HepG2细胞消化1min，随后加入新鲜DMEM培养液终止消化并用移液枪将细胞轻轻吹打到DMEM培养液中，将所得DMEM培养液800r/min离心5min收集细胞，然后向所收集的细胞中加入新鲜DMEM培养液并吹打成细胞悬浮液，将细胞浓度均控制为106个/ml，并按照1﹕1的细胞数量比例将两者混合均匀，即得到3T3成纤维细胞-HepG2细胞混合液；
（3）将上述经过处理的移液枪头尖端向下竖直放置，从其上端向其中注入80μl的所述3T3成纤维细胞-HepG2细胞混合液，细胞混合液在重力作用下向移液枪头下端移动，并通过液体表面张力在移液枪头下端形成液滴，该液滴的下凹液面即为细胞的生长附着基底层，细胞堆积在液滴的下凹液面上，形成三维组织，在水接触角仪下观察移液枪头下端所形成的液滴与移液枪头截面间的接触角，并将液滴与截面间的接触角角度控制为30°；
（4）将上述载有细胞混合液的移液枪头放入细胞培养箱内培养一周，培养箱温度控制为37℃，二氧化碳浓度控制为5%，每间隔一天用移液枪吸出一半上清培养液，同时加入等体积新鲜的DMEM培养液，具有球形形态、结构致密的肝脏类器官组织在培养的第三天开始形成，培养一周后即获得毫米级的三维肝脏类器官。
7.如权利要求1-6任一项所述的三维类器官的液滴培养方法在制备类器官培养试剂盒中的应用。
8.如权利要求1-6任一项所述的三维类器官的液滴培养方法在制备体外药物筛选系统中的应用。
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