CN107109319A - 用于处理包含样品的微滴的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在微流体系统中处理包含样品(16)的微滴(14)的方法，包括以下步骤：在油中形成含有样品(16)的水溶液的微滴(14)，所述油和/或含有样品(16)的水溶液包含胶凝剂；通过预先布置在捕集区(10)中的表面张力捕集阱(12)捕集微滴(14)；以及至少部分胶凝化捕集区中的油和/或至少部分胶凝化被捕集的微滴(14)。

Description

用于处理包含样品的微滴的方法
技术领域
本发明涉及用于处理水凝胶微滴中的样品、特别是生物样品的微流体方法。本发明还涉及用于进行这种方法的装置和涉及通过进行这种方法获得的样品的产品。
背景技术
从Guo、Rotem、Heyman和Weitz，“Droplet microfluidics for high-throughputbiological assays”，Lab.Chip.12(2012)中已知，微流体系统中的液滴(或“微滴”)可用于包含化学反应或生物反应。在这些系统中，可以当液滴在聚焦激光器前面通过时观察液滴的荧光来测定这些液滴的含量。然而，在不将这些液滴从微流体装置中提取出来时，这些系统不能观察这些液滴的含量随时间的变化。
关于微滴中的个体化细胞的研究也是已知的，例如来自Joensson,H.N.和Andersson Svahn,H.，“Droplet microfluidics-a tool for single-cell analysis”，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.51,12176-12192(2012)。事实上，这些微滴形成了明确界定的隔室，其例如使得能够分离出诸如细胞的生物样品。该文献特别教导可以通过在培养室中、在细长通道中或在静态捕集阱中积聚液滴来控制包封细胞群体的定位。该文献还教导细胞可以被包封在被油相包围的官能化水凝胶中。
然而，在这种装置中细胞的营养物质或更一般的生物感兴趣的分子的供应被证明是有限的，并且使用的方法(例如通过电融合或皮升注射)证明是复杂的。因此，这些装置对细胞行为的研究具有许多限制，特别是在时间方面。
此外，从L.Yu，M.C.W.Chen和K.C.Chang，“Droplet-based microfluidic systemfor multicellular tumor Spheroid formation and anticancer drug testing”，LabChip(2010)，已知一种处理含有多细胞球体的水凝胶微滴的方法。根据该方法，在第一微流体系统中产生包括细胞的水凝胶微珠。然后将它们回收并在浴中洗涤，然后注入包含捕集阱的第二微流体系统，使得可以固定微滴。
然而，这种方法是复杂的，总共需要两个单独的微流体系统和三个装置。另外，不能连续观察样品。特别地，它不能观察到液滴的形成和其捕获之间的初始时刻。
发明内容
因此，需要一种用于处理含有样品的微滴的方法，该方法更简单并且还允许对样品进行大范围的测试。还需要一种用于处理微滴的方法，该方法能够更有效地分选微滴。
为此，本发明提出了一种用于在微流体系统中处理包含样品的微滴的方法，包括以下步骤：
i)在油中形成含有样品的水溶液的微滴，油和水溶液中的至少一者包含胶凝剂，
ii)通过预先布置在捕集区中的表面张力捕集阱捕集微滴，和
iii)将来自捕集区中的至少一部分油和至少一部分被捕集的微滴中的至少一者胶凝化。
因此，根据本发明，为了对感兴趣的微滴(也就是说含有感兴趣的样品的微滴)进行分选，这些微滴首先被捕集在表面张力捕集阱(或毛细管捕集阱)中，然后一些微滴和/或其周围的一部分油被胶凝化。微滴和/或其周围的油的胶凝化通过提高捕集阱中捕集微滴的强度有助于分选。换言之，胶凝化步骤使得可以防止感兴趣的微滴损失。
此外，这种胶凝化使得可以防止微滴融合，该融合将引起这些微滴的样品的混合。
表面张力捕集阱旨在表示微流体系统的捕集区，其几何形状与微滴的界面张力可以使微滴固定就位。
该方法的所有步骤在单个微流体系统中进行。微流体系统旨在表示其部分是根据微细加工工艺制造的系统。这种系统具有导管，该导管的至少一个维度通常小于一毫米。
可以控制微滴的形状。对微滴形状的这种控制可以与控制微滴或其周围的一部分油胶凝化的时刻相结合，以实现各种应用，特别是在细胞操控方面。
细胞旨在表示真核细胞(例如植物细胞、伞菌细胞、酵母菌细胞或哺乳动物细胞)和原核细胞(例如细菌)。对于哺乳动物细胞，区分非锚定依赖性细胞(例如血细胞系的一些细胞和高度转化的肿瘤细胞)和锚定依赖性细胞(大多数其它细胞类型)，其中一些亚型会组织成球状体形式。球状体旨在表示以微组织形式组织的多细胞结构，其功能类似于衍生自器官的组织的功能。
根据优选实施方式，根据本发明的方法单独或组合地包括以下特征的一个或多个：
-步骤iii)为将捕集区的至少一部分油胶凝化，而不将微滴胶凝化；
-步骤iii)为将至少一部分微滴胶凝化，而不将捕集区中的微滴周围的油胶凝化；
-样品是一个或多个细胞(特别是细胞的球状体)、一个或多个捕集分子的珠(珠特别是由塑料制成)、或一个或多个分子中的一者；
-步骤iii)在被捕集的微滴中的样品(特别是细胞样品)沉降之后、特别是在形成球状体之后进行；
-步骤iii)在被捕集的微滴中的样品沉降之前进行；
-该方法还包括以下步骤：
iv)用水溶液代替胶凝化的微滴周围的油；
-代替油的水溶液含有生物化学溶液，生物化学溶液优选包含一种或多种pH缓冲液或盐缓冲液、一种或多种营养物质、一种或多种生长因子、细胞因子、一种或多种抗体、一种或多种抗原、一种或多种分子(特别是药剂分子)、一种或多种细胞、脂质、碳水化合物(特别是以单体形式或多糖形式的碳水化合物)、氨基酸和/或蛋白质中的至少一者；
-捕集区由包含表面张力捕集阱的微流体芯片形成；
-步骤i)为：
a)将含有样品和在适当的情况下含有胶凝剂的水溶液注入捕集区上游的区域，
b)将在适当的情况下含有胶凝剂的油注入捕集区上游的区域，以将含有样品的水溶液驱向捕集区的出口，注入油以形成含有样品的微滴，然后
c)将微滴移至捕集区并将微滴捕集在捕集区中；
-通过进行以下操作而同时在捕集区中进行步骤i)和步骤ii)：
-用含有样品和在适当的情况下含有胶凝剂的水溶液填充捕集区，然后
-将在适当的情况下含有胶凝剂的油注入捕集区，以将含有样品的水溶液驱向捕集区的出口，使表面张力捕集阱适于使含有样品的微滴在表面张力捕集阱处破裂；
-步骤iii)为以下项中的至少一者：
-冷却或加热微滴和/或油，
-注入含有化学胶凝剂的溶液，
-将微滴和/或油暴露于引起胶凝化的光，所述光特别是UV光；
-油含有表面活性剂，该方法优选地包括在步骤iv)之前洗涤表面活性剂的步骤；
-该方法包括在步骤i)之前根据微滴的期望形状来选择表面张力捕集阱的形状的步骤；
-捕集区和捕集阱被选择以：
-形成具有平坦的底部的被捕集的微滴，或
-形成具有非平坦的、特别是弯曲的、优选凸起的底部的被捕集的微滴；
-该方法包括在步骤iii)之后的步骤v)，优选在步骤iv)之后的步骤v)，该步骤v)为使步骤iii)中胶凝化的至少一些微滴去胶凝化；
-该方法包括在步骤v)之后的步骤vi)，步骤vi)为将去胶凝化的微滴和/或包含在这些去胶凝化的微滴中的样品从捕集区排出；
-该方法包括对包含在至少一部分被捕集的、胶凝化或未胶凝化的微滴中的样品施加刺激的步骤；以及
-该方法包括在步骤iii)之后的步骤，该步骤iii)之后的步骤为使周围的油未胶凝化的微滴离开捕集区，以便在捕集区中仅保留那些周围的油被胶凝化的微滴。
根据另一方面，本发明涉及一种用于执行如上所描述的以其所有组合的方法的装置，包括：
-形成含有样品的微滴的构件，
-用于在预定位置处捕集微滴的捕集区，特别是微流体芯片，以及
-用于胶凝化至少一部分被捕集的微滴和/或至少一部分油的构件。
该胶凝化构件可以包括用于将化学试剂注入捕集区的元件。
该装置还可以包括用于使至少一些胶凝化的水凝胶微滴和/或一部分胶凝化的油去胶凝化的构件。
本发明还涉及具有胶凝化的微滴的产品，其包括用于捕集微滴的区域、特别是微流体芯片，以及各自包含样品并且被捕集在捕集区中的胶凝化的微滴，该胶凝化的微滴优选被冷冻保存。
为此，并且考虑到储存和/或分配该微滴产物，生物化学溶液可以含有冷冻保护剂(DMSO、甘油、海藻糖等)以使样品能够冷冻保存。
胶凝化的微滴也可以被浸入流体中，优选浸入水溶液中或浸入油中，流体和微滴优选被冷冻保存。
本发明还涉及具有微滴的产品，包括捕集区、特别是微流体芯片，以及各自包含样品并且被捕集在捕集区中的微滴，微滴浸入胶凝化的油中，微滴和胶凝化的油优选被冷冻保存。
样品可以是哺乳动物细胞(优选除人类细胞外的来自哺乳动物的细胞)、细菌细胞、酵母细胞或在生物过程中使用的其它细胞、分子、或在表面捕集分子的珠。
附图说明
根据附图，阅读本发明的示例性实施方式的以下描述将更好地理解本发明，其中：
-图1示意性地示出微流体芯片；
-图2示意性地示出图1的微流体芯片，其中一些捕集阱被含有样品的水凝胶微滴占据；
-图3示意性地示出含有水凝胶和待测试样品的混合物的图1的微流体芯片；
-图4至图6示意性地示出了用于将捕集在微流体芯片中的水凝胶微滴中包含的一部分样品从该微流体芯片排出的装置；
-图7至图12示意性地示出表面张力捕集阱的几何形状和它们使得可以获得的微滴形状的示例；以及
-图13至图15示意性地示出水凝胶微滴中样品沉降的示例。
具体实施方式
本发明涉及一种处理包含待测试样品的水凝胶微滴的方法。
下文将更特别地涉及细胞形式的样品，但是当然可以使用其它类型的样品。
该方法基本上包括三个步骤，全部在单个微流体系统中进行，所述三个步骤为：
-在油中形成含有一个或多个细胞的液体水溶液的微滴，所述油和/或所述水溶液包含胶凝剂，
-通过预先布置在捕集区中的表面张力捕集阱捕集液体微滴，以及
-将油和至少一部分被捕集的微滴中的至少一者胶凝化。
下文将更特别涉及其中水溶液是水凝胶溶液、油不包含胶凝剂的情况，以及其中上述最后步骤为将至少一部分被捕集的微滴胶凝化，而油本身未被胶凝化的情况。在这种情况下，在上述三个步骤之后，可以通过进行不同的步骤来继续该方法，特别是取决于希望进行的测试。
该方法可以特别地通过用水溶液代替胶凝化微滴周围的油而不将微滴从表面张力捕集阱移除的步骤来继续进行。水溶液可以含有具有营养物质、生长因子、抗体、药剂分子和pH缓冲液和/或盐缓冲液中的至少一者的生物化学溶液。
根据另一方面，该方法使得可以控制在微流体通道和/或表面张力捕集阱中的水凝胶珠的三维形状，其主要应用是将细胞包封在这些微滴中。因此，根据微滴的形状和每个微滴的细胞浓度，细胞包封在水凝胶中使得在例如向其输入生物化学溶液或对其施加物理刺激(例如热或光)时，能够进行其培养或分析。
凝胶旨在表示主要由液体组成并含有分子或颗粒的介质，分子或颗粒可被组织以赋予凝胶固体外观，例如在其稳定状态下不存在流动。该溶液可以以液态处理，然后可以通过化学方法或物理方法“胶凝化”。在某些情况下，胶凝化可以是可逆的。当液体是水时，涉及水凝胶。
如上所述，所提出的微流体方法包括在油中形成含有生物细胞的水凝胶微滴的第一步骤。
在这种情况下，微滴(或微珠)的直径为微米级，特别是直径在10微米和1000微米之间。
水凝胶是例如包含胶凝剂的水溶液。用户根据应用选择胶凝剂。可以物理胶凝化的胶凝剂的实例是琼脂糖，其在室温下为液体，并且其在低温下胶凝化。可以化学胶凝化的胶凝剂例如是藻酸盐，其在溶液中为液体，并且当供应钙离子Ca2+时胶凝化。
在生物学水平上，水凝胶的生物化学性质和生物力学性质可以使锚定敏感细胞与由此形成的基质建立特异性的相互作用。这些相互作用对于锚定依赖性哺乳动物细胞的存活是必需的，并且在调节其表型中起作用。基质的性质例如可以使得能够观察细胞迁移或蛋白水解(由细胞消化基质)。使用琼脂糖、藻酸盐和PEG-DA(聚乙二醇二丙烯酸酯)、也使用明胶、I型胶原或进行特别有说服力的实验。例如，含有各种蛋白、糖胺聚糖和细胞外基质的其它组分(例如I型胶原、明胶或)的水凝胶表现出其维持活力、支持增殖的能力以及迁移和维持某些锚定依赖性细胞群体的表型的能力。应当注意，可以通过例如提供连续的微滴来组合凝胶。所提及的每个水凝胶具有特定的相应胶凝化程序。一些水凝胶(例如PEG-DA)也可以通过以下被功能化以使细胞存活和/或发育：掺入模拟肽(例如水凝胶可以用RGD型共有序列功能化，一些类型的哺乳动物细胞与该RGD型共有序列可以建立特异性相互作用，或者对金属蛋白酶特异的PRCG[V/N]PD或HEXGHXXGXXH共有序列)、或通过掺入抗体或适配体的特异性分子的传感器，例如原位捕获由包封的淋巴细胞分泌的细胞因子。通过改变例如它们的交联度和/或它们的浓度，这些水凝胶的力学性能也可以被改变用于不同的应用。所有这些物理化学性质可以在捕集区内的一个捕集阱与另一个捕集阱之间不同。在捕集的水凝胶微滴中建立严格梯度使得例如干细胞可控分化成不同的细胞类型。最后，在混合或者在捕集阱中胶凝化核心周围连续形成若干个层之后，多种水凝胶可以在相同的微滴中共存。
先验地在形成微滴之前，细胞与水凝胶混合。然而，在形成微滴之前，水凝胶和细胞可以在微流体装置中直接混合。
已经提出了许多方法在流动相(诸如油)中形成这种微滴。例如，可以提及以下示例方法：
-称为“流动聚焦”的方法，例如在S.L.Anna,N.Bontoux和H.A.Stone，“Formationof dispersions using‘Flow-Focusing’in microchannels”，Appl.Phys.Lett.82,364(2003)中所描述的，其内容通过引用并入本文，
-“T连接”方法，例如在“Dynamic pattern formation in a vesicle-generatingmicrofluidic device”由T.Thorsen,R.W.Roberts,F.H.Arnold et S.R.Quake,Phys.Rev.Lett.86,4163–4166(2001)中所描述的，其内容通过引用并入本文，或者
-“约束梯度”方法，例如在申请FR-A-2 958 186中所描述的，其内容通过引用并入本文。
这些方法使得可以形成具有基本相等尺寸的微滴。
在形成这些微滴之后，微滴通过微通道从其形成的区域输送到捕集区，该微通道由油流和/或由斜坡或轨道承载。已经观察到，这种输送有助于在微滴中形成球状体。然后由布置在捕集区中、特别是在微流体芯片中的表面张力捕集阱将微滴捕集。捕集区(或微流体芯片10)通过疏水表面处理进行处理，并填充含有表面活性剂的油。使用表面活性剂能够使微滴稳定及再现微滴的形成。表面活性剂还可以在从生产装置输送到捕集区的捕集阱期间如果发生接触则防止微滴的聚结。
如图1所示的微流体芯片10由可能数平方厘米的培养室组成，包含以表格或矩阵形式组织的许多表面张力捕集阱。表面张力捕集阱12可以具有各种形状。例如，在圆柱形捕集阱的情况下，根据所需的应用，它们的直径可以从几十微米到几百微米。对于单个细胞或在微滴中个体化的细胞的包封，捕集阱的直径可以是例如50微米，其对应于每平方厘米大约5000个捕集阱的密度。对于大的细胞聚集体或球状体的研究，该直径可以达到250微米，则其对应于每平方厘米大约250个捕集阱的捕集阱密度。
如图1所示，在微流体芯片10外部形成的包括生物细胞16的微滴14例如通过箭头18所示的油流被运送到微流体芯片10中，使得这些微滴中的一些被捕集在表面张力捕集阱12中。
然而，作为变型，这里提出在油中形成含有生物细胞的水凝胶微滴，而不精确控制在油中含有生物细胞的水凝胶的流动。这是因为只有那些具有合适尺寸的微滴随后被捕集在捕集区中，使得捕集区被实际上具有很大的尺寸均匀性、形状均匀性和生物细胞浓度均匀性的微滴占据。
根据图3所示的另一变型，捕集区，特别是微流体芯片10，包含含有生物细胞16的水凝胶溶液20。然后将油注入捕集区(注射由箭头18示意性地表示)，其驱动含有生物细胞16的水凝胶溶液20朝向捕集区的出口。然后通过将水凝胶捕集在微流体芯片的这些捕集阱中直到获得与图2所示的构造基本相同的构造，微滴直接在表面张力捕集阱12中形成。因此，通过在表面张力捕集阱上含有生物细胞的水凝胶溶液的自发分离(或破裂)来形成微滴。在这种情况下，也不需要对流量的精确控制，甚至可以用手推动注射器，而不必使用复杂的仪器。在这种情况下，优选的是深的表面张力捕集阱，以便在表面张力捕集阱处能够使微滴破裂(也就是说微滴的形成)。这样的捕集阱将随后描述。
这里应当注意，捕集阱可以具有非常不同的形状，特别是根据所需的应用，也就是说特别是根据被捕集的微滴的所需形状，捕集阱可以具有非常不同的形状。形成捕集阱的空腔也可以没有优先地位于捕集区、特别是微流体芯片的上壁、下壁或一个侧壁上。
图7至图12示出可以设想用于微流体芯片10的表面张力捕集阱12的形状以及可以通过这些表面张力捕集阱12获得的微滴14的形状。
特别地，捕集阱12的形状使得可以根据形成有捕集阱12的微流体通道的几何参数和捕集的微滴的体积来控制捕集的微滴的形状。图7示意性地示出了确定微滴的轮廓所要考虑的参数，即限制在含有捕集阱12的通道中的微滴的半径R、该通道的高度h(其小于该通道中的微滴的半径R)、以及捕集阱12的直径d和深度p。
当捕集阱12是圆柱形的并且具有大于通道高度h两倍的直径d时，如图8至图10所示，则微滴14尽可能多地装入捕集阱12中。根据捕集阱12和微滴14的相对体积，微滴14可以具有或不具有半球状的圆顶，并且可以具有或不具有由通道的壁限制的平坦部分。因此，在图8中，微滴14的体积大于捕集阱12的体积。在这种情况下，微滴14几乎完全填充捕集阱12，并且具有抵着通道的壁和捕集阱的壁扁平化的形状。在图9中，微滴14的体积略小于捕集阱12的体积，因此微滴14具有两个半球状的圆顶，并且仅轻微接触通道的壁。最后，如图10所示，如果微滴14的体积明显小于捕集阱12的体积，则微滴14(或甚至几个微滴14)完全容纳在捕集阱12内。
另一方面，在图11的情况下，捕集阱的直径d小于通道高度h的一半。因此，微滴14基本上仍被限制在通道中，并且在捕集阱12中仅具有小的半球状的圆顶。
最后，在图12的情况下，捕集阱12是圆锥形的并且直径d为通道高度h的两倍。微滴14因此紧密地装入捕集阱12的壁的形状中，以便在捕集阱12中形成半球状的圆顶。
此外，如图13所示，如果捕集在捕集阱12中的微滴14具有平坦的底部，则细胞16在统计学上均匀地沉降和沉淀其自身于微滴14的底部。于是可以观察到单个的细胞并且不聚集。另一方面，如图14和图15所示，如果捕集在捕集阱12中的微滴14具有非平坦的底部、特别是凸起的底部，则细胞16在其沉降期间与微滴12的界面接触，并且必须沿着这个界面滑动。细胞16因此集中在微滴14的底部，并且可以任选地在一些锚定依赖性细胞的情况下聚集并形成球状体。
这里提出的微流体方法包括在捕集这些微滴之后对微滴胶凝化的步骤。
该步骤可以以各种方式进行，特别是根据所用的水凝胶胶凝剂。因此，根据第一实施例，水凝胶含有琼脂糖，优选是琼脂糖。然后通过冷却微流体芯片将微滴胶凝化。当水凝胶含有藻酸盐或优选地为藻酸盐时，可以在其中浸入微滴的油中提供钙离子Ca2+，或者甚至将钙质颗粒与藻酸盐预混合并使其中浸入微滴的油在二氧化碳中饱和。藻酸盐因此被酸化并释放钙离子。当然，由于可以使用其它胶凝剂，因此可以使用其它胶凝化方法。
此外，根据所寻求的应用，该胶凝化步骤可以在该处理方法期间的不同时刻进行。特别地，可以在捕集后立即进行胶凝化，以将细胞适当固定在微滴中并防止它们沉降。然后可以彼此独立地观察细胞。可替选地，在细胞沉降以形成球状体之后进行胶凝化。这使得可以观察到已经形成球状体的细胞的行为。根据另一替代方案，微滴仅在用于处理液体介质中的细胞的操作之后胶凝化，例如选择性提取某些细胞-非胶凝化微滴中的细胞。这对于例如细菌或红细胞和白细胞的细胞(其是锚定非依赖的)可是有用的。
胶凝化后，例如可以用含有特别是包含生物化学成分(例如营养物质、生长因子、抗体、药物或药剂分子)的生物化学溶液的水溶液来代替其中浸渍有微滴的油。这些生物化学成分通过凝胶扩散并到达细胞。因此，可以研究独立的或以球状体的形式的细胞对这些刺激的反应。因此，在将细胞包封在微滴期间，水凝胶使得可以将细胞保持在精确的位置，同时允许细胞通过水相输入并且预先划分生物样品。
为了成功地进行该操作，优选地迫使表面活性剂从微滴的界面出来。这是因为表面活性剂在微滴界面处形成的壳会非常有效地阻止被注入以代替油的水相填充微流体芯片，从而保持微滴在其各自的捕集阱中胶凝化。由于聚结被表面活性剂的存在所抵抗，故水相界面到达捕集阱产生施加到胶凝化微滴的力，如果构成胶凝化微滴的水凝胶是足够可压缩的，则胶凝化微滴会被迫使离开捕集阱。这就是优选通过降低界面处的表面活性剂的浓度来促进聚结的原因。为此，在注入水相之前，使微流体芯片注满油，该油与之前使用的油不同，不含有表面活性剂。微流体芯片的油中的表面活性剂的浓度降低，这使得可以将界面处的表面活性剂吸附的平衡转向解吸附。对于高浓度的表面活性剂，例如几个重量百分数的数量级，优选使微流体芯片注满相当于微流体芯片体积的50倍的量的油。该比例取决于表面活性剂的性质及其对两相的亲和力。
捕集阱的形状也可以进行优化，以确保胶凝化微滴保持在捕集阱中的适当位置。因此，在足够深的圆柱形捕集阱的情况下，如果通道的高度大于捕集阱的半径，则进入捕集阱的微滴将是最少的，导致低的捕集效率。随后，外部流动的速度有一个限制，超过该速度，迫使微滴离开捕集阱。相反，当通道的高度小于捕集阱的半径时，只要微滴足够大，微滴就能明显地渗透到捕集阱的空腔中，从而产生高的捕集效率。无论外部流的速率如何，微滴保持在适当的位置。在第一种情况下，微滴的形状非常接近其通道中的形状，而在第二种情况下，其在局部呈现捕集阱的形状。
当选择的水凝胶的胶凝剂为可逆的时候，可以将微滴去胶凝化，然后从微流体芯片释放出其内容物，如图4至图6所示。在这些图4至图6的情况下，微滴14例如是胶凝化的琼脂糖微滴。这些琼脂糖微滴14通过局部加热(通过闪电栓21所示的加热)，特别是通过红外激光或电极，逐个去胶凝化。热使琼脂糖液化。当微滴14周围的相是水性时，去胶凝化琼脂糖的内容物16与水相混合。然后可以使用水相的流22携带该内容物，任选地以便回收该内容物。因此，也可以通过微流体芯片10消除被认为不感兴趣的细胞。再次，优选地选择捕集阱的形状和尺寸以使得能够提取细胞。例如，在细胞必须保持存活的情况下，捕集阱的尺寸足够大以致加热水凝胶不诱导细胞死亡机制。
可替选地，当微滴周围的相是油性时，可以施加油流以将液体微滴从捕集阱移出。在这种情况下，捕集阱的形状和强度优选为仅允许提取所选择的微滴而不是其它微滴的尺寸。该尺寸特别取决于水相和油之间的表面张力的值，也取决于凝胶微滴的刚性及其在捕集阱内的形状。
另一种替代方案是保持微滴为液体，用于处理悬浮液中的细胞，例如细菌。然后仅进行胶凝化以选择性提取微滴。在这种情况下，可以在提取前胶凝化所有微滴并且应用上述方案，或者另一方面仅胶凝化那些期望保留在捕集阱中的微滴。
经由轻微的修改，所提供的方法能够检测非常多样化的生物应用。在每种情况下，当然也可以通过调节微流体芯片中的通道的高度以及捕集阱的几何形状来修改该装置。
因此，例如快速胶凝化低浓度的细胞使得可以使在每个微滴中的几个单细胞个体化，同时试图限制它们的直接相互作用。这些细胞例如可以是细菌、酵母或哺乳动物细胞。
可替选地，快速胶凝化高浓度的细胞使得仍然可以获得仍被个体化但彼此接近的大量细胞。例如可以通过旁分泌分泌物检查细胞(可能地在共培养中)之间的相互作用。
然而，在胶凝化之前，细胞可以在液相中长时间保持包封。然后，低浓度的细胞使得可以例如在悬浮液中研究锚定依赖性细胞，例如淋巴细胞。能够使细胞沉降的高浓度的细胞和捕集的微滴的形状使得可以将能够将其自身重组为球状体的细胞聚集在一起。
该方法还可以以受控的方式直接在芯片中形成球状体。所产生的微滴的体积可以由用于在微流体芯片上游形成微滴的装置来控制。优选地调节该体积，使得一旦被捕集，则微滴的直径等于捕集阱的直径并且微滴具有球形形状。为此，捕集阱的深度优选至少等于其直径。捕集的微滴的直径与捕集阱的直径一致的事实使得可以确保高的捕集效率。球形形状促进球状体的形成。对于该特定应用，微滴优选含有悬浮在包含培养基和水凝胶或由培养基和水凝胶构成的水相中的细胞。一旦捕集阱填充了这样的微滴，则外部的油的流动停止，这停止在微滴中的再循环并促进细胞的沉降。然后，捕集阱中的微滴的球形形状使得细胞在微滴的最低点处集中，直到它们接触。然后，在有利于细胞的存活和适当的代谢功能的条件下，特别是在温度方面，在几个小时到几天的持续时间内，将芯片静置，使得能够将集中在被捕集的微滴底部的细胞重组为球状体。
球状体形成所需的持续时间会特别取决于所使用的细胞类型和取决于水凝胶的组成。对于在培养基中稀释的1重量％的琼脂糖溶液中的H4IIEC3大鼠肝细胞，观察到该持续时间小于24小时。当然，在球状体形成期间，水凝胶保持液体。
这种方法使得可以快速形成大量的具有非常均匀尺寸的球状体。事实上，球状体的尺寸由每个微滴中包封的细胞数量确定，并因此由注入到微流体芯片中的细胞溶液的浓度来确定。只要细胞在注入时充分个体化，则每个微滴的细胞数量的分布、并因此形成的球状体的尺寸的分布就非常均匀。在本发明人进行的实验中，在孵育24小时之后，平均98％的捕集阱填充有一个含有良好重组的球状体的液体琼脂糖的微滴。
在微流体芯片中获得的球状体可以保持培养若干天。例如，包封在琼脂糖中的H4IIEC3细胞的球状体可以在芯片中培养一周，而不显著改变其活力并且同时保持高功能性(在该实例中，强烈和连续的白蛋白分泌)。
这里提出的方法和通过进行该方法获得的微流控芯片构成了用于筛选药剂的优良工具。例如，可以形成癌细胞的球状体并观察根据暴露于被测分子其活力随时间是否降低。通过向芯片添加能够在室内设置浓度梯度的装置，或者通过设置平行芯片，可以在同一系统中测试整个浓度范围。形成这些球状体的方法的高效率也使得可以从非常有限的样品开始产生大量的这些球状体。因此，仅用100 000个细胞可以形成直径约70μm的500个球状体。
构成球状体的细胞也可以是不同的类型，以便接近共培养的主题。这些细胞类型可以在注入芯片中之前均匀地混合在溶液中，或者在几个连续的水凝胶层中按照某种结构组织排列或者仅通过在输入在外部水相中之后粘附水凝胶而排列。例如，可以将成纤维细胞和上皮细胞联合以形成皮肤模型并测试化妆品的毒性，将神经元和星形胶质细胞联合以模拟脑部，或者将如在血管壁中的内皮细胞和平滑肌细胞联合。
由于这里提出的方法可以实现对培养细胞微环境的非常高度的控制，故它还是研究干细胞分化的优良工具。事实上，包封的细胞可以经受全范围的分化因子的浓度，并且潜在地同时经受全范围的基质的刚性，同时调节例如水凝胶浓度。类似地，该方法可用于观察胚胎随时间的发育，与来自外部培养基的物理化学因子的相互作用。
在来自患者的原代细胞的情况下，该方法使得可以基于细胞对某些标记的响应来进行医学诊断。在这种情况下，细胞以非常低的损失程度被捕获。然后可以使细胞进行已知的用于诊断某些疾病的测试，例如癌症活检的表征。例如，可以例如通过原位聚合酶链反应(PCR)或通过FISH方法来测试包封细胞的基因组中突变的存在。也可以通过标记方法，例如通过提供用于免疫标记的抗体或用于原位免疫酶法、ELISA(酶联免疫吸附试验)的抗体，检测特异性蛋白的表达。
上述方法提供了借助微滴在芯片中被捕集后的胶凝化，在微流体芯片中进行细胞分析和培养的所有步骤的可能性。这使得可以使用比在多孔板或培养皿中进行的测试少得多的量的试剂。这也使得可以在不同的刺激之后监测随时间的细胞响应。
上述方法可以容易地在包括以下的装置中进行：
-形成含有细胞的水凝胶微滴的构件，
-捕集区，特别是微流体芯片，用于在预定位置处捕集水凝胶微滴，以及
-用于胶凝化至少一部分的被捕集的微滴的构件。
该胶凝化构件包括例如用于将化学试剂注入捕集区中的元件和/或用于温度调节(例如用于冷却微流体芯片)的元件。
该装置还可以包括用于使至少一些胶凝化的水凝胶微滴去胶凝化的构件，例如激光器。
上述方法也使得可以生产具有胶凝化微滴的产品，其包括用于捕集微滴的区域，特别是微流体芯片，以及各自包括一个或多个捕集在捕集区中的细胞的胶凝化微滴，胶凝化微滴优选被冷冻保存。细胞可以以簇或球状体的形式聚集。胶凝化微滴可以浸入流体中，优选浸入水溶液中或浸入油中，流体和微滴优选被冷冻保存。这种冷冻保存使得特别能够在稳定条件下长时间保持细胞，以便运输或存储它们用于随后的分析。
包封在微滴中的生物细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、优选除人类细胞外的哺乳动物细胞，更优选大鼠细胞或来自其它哺乳动物的细胞，或从其天然环境分离的人类细胞。
当然，本发明不限于仅上述示例，在所附权利要求的范围内，对于本领域技术人员来讲可存在许多变型。
除了细胞之外，使用的样品还可以特别地是通过将它们与分子偶联而官能化的分子或塑料珠。
此外，捕集的微滴可以与由水溶液流提供的其它微滴融合。
构成微滴的水溶液也可含有生物化学溶液，生物化学溶液优选包含脂质(脂肪酸等)、碳水化合物(以单体形式或多糖形式等)、氨基酸和蛋白质(生长因子、细胞因子、抗体、抗原等)以及盐缓冲液和/或pH缓冲液中的至少一者。
最后，根据一个变型，微滴周围的油(或油相)可以含有氟油(FC40型)或者可光交联的水不混溶溶液(Norland Optical Adhesive型)，其一旦聚合就可以使油胶凝化，从而物理性和选择性地分离微滴。因此，可以更可靠地相对于彼此使微滴区室化。这使得可以防止两个微滴融合，防止引起它们含有的样品的混合。这也使得可以持久地储存样品，由于通过胶凝化的油使微滴区室化，在微滴周围形成固体隔室，故微滴蒸发的风险尤其极大地降低。
一旦一部分油已被胶凝化，就可以驱动周围的油未胶凝化的微滴从捕集区排出。为此，可以在捕集区中使用油或另一种流体的流动，该流动足够强以携带微滴。因此，可以仅保留周围的油在捕集区中胶凝化的那些微滴。
在此应当注意，即使在油被胶凝化的情况下，微滴也可以被胶凝化。此外，该方法当然可以包括使胶凝化的油去胶凝化的后续步骤，在这种情况下一部分油被胶凝化。

Claims (26)

1.一种用于在微流体系统中处理含有样品(16)的微滴(14)的方法，包括以下步骤：
i)在油中形成含有样品(16)的水溶液的微滴(14)，所述油和所述含有样品(16)的水溶液中的至少一者包含胶凝剂，
ii)通过预先布置在捕集区(10)中的表面张力捕集阱(12)捕集所述微滴(14)，以及
iii)将来自所述捕集区中的至少一部分所述油和至少一部分被捕集的微滴(14)中的至少一者胶凝化。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤iii)为将所述捕集区中的至少一部分所述油胶凝化。
3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤iii)为将至少一部分所述微滴胶凝化。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述样品(16)是一个或多个细胞、一个或多个捕集分子的珠或一个或多个分子中的一者，所述一个或多个细胞特别是细胞的球状体，所述珠特别是由塑料制成。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤iii)在所述被捕集的微滴(14)中的所述样品(16)沉降之后、特别是在形成球状体之后进行，所述样品(16)尤其是细胞样品。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，步骤iii)在所述被捕集的微滴(14)中的所述样品(16)沉降之前进行。
7.如前述权利要求中任一项结合权利要求3所述的方法，还包括以下步骤：
iv)用水溶液代替胶凝化的微滴(14)周围的所述油。
8.如权利要求7所述的方法，其中，代替所述油的所述水溶液含有生物化学溶液，所述生物化学溶液优选包含一种或多种pH缓冲液或盐缓冲液、一种或多种营养物质、一种或多种生长因子、细胞因子、一种或多种抗体、一种或多种抗原、一种或多种分子、特别是药剂的分子、一种或多种细胞、脂质、碳水化合物、特别是以单体形式或多糖形式的碳水化合物、氨基酸和/或蛋白质中的至少一者。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述捕集区由包含所述表面张力捕集阱(12)的微流体芯片(10)形成。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤i)为：
a)将含有样品(16)和在适当情况下含有胶凝剂的水溶液注入所述捕集区(10)上游的区域，
b)将在适当情况下含有胶凝剂的油注入所述捕集区上游的区域，以将含有样品(16)的所述水溶液驱向所述捕集区(10)的出口，注入所述油以形成含有样品(16)的微滴(14)，然后
c)将所述微滴(14)移至所述捕集区(10)，并将所述微滴(14)捕集在所述捕集区(10)中。
11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，通过进行以下操作而在所述捕集区(10)中同时进行步骤i)和步骤ii)：
-用含有样品(16)和在适当情况下含有胶凝剂的水溶液填充所述捕集区(10)，然后
-将在适当情况下含有胶凝剂的油注入所述捕集区(10)，以将含有样品(16)的所述水溶液驱向所述捕集区(10)的出口，使所述表面张力捕集阱(12)适于使所述含有样品(16)的微滴(14)在所述表面张力捕集阱(12)处破裂。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤iii)为以下项中的至少一者：
-冷却或加热微滴(14)和/或所述油，
-将含有化学胶凝剂的溶液注入所述捕集区，
-使所述微滴(14)和/或所述油暴露于引起胶凝化的光，所述光特别是UV光。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述油含有表面活性剂，所述方法优选地包括在步骤iv)之前洗涤所述表面活性剂的步骤。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，包括在步骤i)之前根据所述微滴(14)的期望形状来选择所述表面张力捕集阱(12)的形状的步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述捕集区和捕集阱被选择以：
-形成具有平坦的底部的被捕集的微滴(14)，或
-形成具有非平坦的、特别是弯曲的、优选凸起的底部的被捕集的微滴(14)。
16.如前述权利要求中任一项结合权利要求1或3所述的方法，包括在步骤iii)之后的步骤v)，优选在步骤iv)之后的步骤v)，所述步骤v)为使步骤iii)中胶凝化的至少一些所述微滴(14)去胶凝化。
17.如权利要求16所述的方法，包括在步骤v)之后的步骤vi)，所述步骤vi)为将去胶凝化的微滴(14)和/或包含在这些去胶凝化的微滴(14)中的所述样品(16)从所述捕集区(10)排出。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，包括对包含在至少一部分被捕集的、胶凝化或未胶凝化的微滴(14)中的所述样品(16)施加刺激的步骤。
19.如前述权利要求中任一项结合权利要求1或2所述的方法，包括在步骤iii)之后的步骤，所述在步骤iii)之后的步骤为使周围的所述油未胶凝化的所述微滴离开所述捕集区。
20.一种用于执行前述权利要求中任一项所述的方法的装置，包括：
-用于形成含有样品(16)的微滴(14)的构件，
-用于在预定位置处捕集所述微滴(14)的捕集区，特别是微流体芯片，以及
-用于胶凝化至少一部分被捕集的微滴(14)和/或至少一部分所述油的构件。
21.如权利要求20所述的装置，其中，胶凝化构件包括用于将化学试剂注入所述捕集区(10)的元件。
22.如权利要求21所述的装置，其中，还包括用于使至少一些胶凝化的水凝胶微滴(14)和/或一部分胶凝化的油去胶凝化的构件。
23.一种具有胶凝化的微滴的产品，所述产品包括用于捕集微滴的区域、特别是微流体芯片(10)，以及各自包含样品(16)并且被捕集在捕集区(10)中的胶凝化的微滴(14)，所述胶凝化的微滴(14)优选被冷冻保存。
24.如权利要求23所述的产品，其中，所述胶凝化的微滴被浸入流体中，优选浸入水溶液中或浸入油中，所述流体和所述微滴(14)优选被冷冻保存。
25.一种具有微滴的产品，所述产品包括用于捕集微滴的区域、特别是微流体芯片(10)，以及各自包含样品(16)并且被捕集在捕集区(10)中的微滴(14)，所述微滴(14)被浸入胶凝化的油中，所述微滴(14)和所述胶凝化的油优选被冷冻保存。
26.如权利要求23至25中任一项所述的产品，其中，所述样品(16)是哺乳动物细胞、优选除人类细胞外的来自哺乳动物的细胞、细菌细胞、酵母细胞或在生物过程中使用的其它细胞、分子、或在表面捕集分子的珠。
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