CN113617403A - 一种新型单细胞western blot的微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型单细胞western blot的微流控芯片，涉及生物技术领域，微流控芯片包括：边梁、整流柱、导流三角、细胞捕获栏、基板；基于单缝微阱单细胞捕获结构，包括可分离的滑动芯片结构，微流控芯片的主体为开放式结构，上方覆盖一层透明玻璃，形成闭合微流控通道。本发明既有闭合微流控通道的高细胞捕获率优势，又兼容单细胞western原有的开放式的蛋白质电泳。

Description

一种新型单细胞western blot的微流控芯片
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新型单细胞western blot的微流控芯片。
背景技术
蛋白质印迹术(Western Blot)是细胞与分子生物学和免疫遗传学中常用的一种蛋白测定方法。具体流程是通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质，随后将蛋白质转移到膜(典型地，硝酸纤维素或PVDF)，接着用对靶蛋白质具有特异性的抗体探测来检测样品中的蛋白质。由于蛋白是经过电泳分离后再进行抗体结合反应，故较少受到抗体交叉反应性的影响。因此，即使在复杂的样品如细胞裂解物中，也能够清楚地区分靶上和靶外信号。然而，传统的蛋白印迹方法中所测定的结果是基于大量细胞样品的蛋白平均表达水平，其结果掩盖了单个细胞蛋白的表达量的特殊性和多样性。Hughes和Herr提出一种单细胞的蛋白质印迹术(Single-cell western blot)，采用基于N-(3-((4-benzoylphenyl)formamido)propyl)methacrylamide(BPMAC)光敏型凝胶原位固定电泳分离后的蛋白进行免疫印迹，在一块微芯片上实现数千个单细胞蛋白质表达水平的测定和细胞异质性的研究。
现有的单细胞的蛋白质印迹术(Single-cell western blot)基于微孔阵列的单细胞痕量蛋白检测方式，其含有5个基本步骤：(1)细胞重力沉降到微孔中；(2)每个微孔中细胞的化学裂解；(3)通过聚丙烯酰胺凝胶对每一个单细胞溶解产物进行电泳分离；(4)将凝胶暴露在紫外光下，将蛋白质印迹固定到凝胶基质上；(5)对固定化蛋白凝胶进行免疫探测。因为在抗体标记之前，蛋白质按质量分开，所以scWBs消除了由于抗体交叉反应和非特异性结合而产生的假阳性信号。
单细胞western blot结合了SDS-PAGE的分子筛效应，通过蛋白质的分子量和抗原抗体识别双重验证，保证了检测的特异性，同时可检测细胞表面蛋白、跨膜蛋白、胞内及核内的蛋白，可区分经表观遗传修饰蛋白。但基于微孔阵列的重力落孔方式捕获单细胞，存在细胞利用率低，微孔落孔率低，孔内单细胞达成率低，难以应用于稀有细胞类群的单细胞蛋白质分析，例如，循环肿瘤细胞(1-10个细胞/毫升血液)。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种新型单细胞western blot的微流控芯片,能够实现高细胞利用率、高微孔落孔率、高单细胞达成率。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何既有闭合微流控通道的高细胞捕获率优势，又兼容单细胞western原有的开放式的蛋白质电泳。
为实现上述目的，本发明提供了一种新型单细胞western blot的微流控芯片，所述微流控芯片包括：边梁、整流柱、导流三角、细胞捕获栏、基板；所述微流控芯片基于单缝微阱单细胞捕获结构，所述微流控芯片包括可分离的滑动芯片结构，所述微流控芯片的主体为开放式结构。
进一步地，所述基板为透明玻璃。
进一步地，所述边梁、所述整流柱、所述导流三角、所述细胞捕获栏由4％SDS-PAGE胶制成。
进一步地，所述细胞捕获栏的样式包括：单缝栏、U型栏和双缝栏。
进一步地，所述微流控芯片的上方覆盖一层透明玻璃，形成闭合微流控通道。
进一步地，所述微流控芯片能够同时非选择性捕获细胞，包括不同细胞周期的细胞和不同细胞活性的细胞。
一种的新型单细胞western blot的微流控芯片的工作流程，包括以下步骤：
步骤1、将细胞悬液充分震荡后，从芯片上方注入，细胞被单缝微捕获；
步骤2、将电泳胶凝从芯片上方注入，替换掉所有的细胞悬液中液体；
步骤3、通过紫外或加热方式将凝胶固化；
步骤4、移除透明玻璃，放入电泳槽分离蛋白。
进一步地，所述步骤1还包括：
步骤1.1、用注射器或移液枪抽取并滴加足量PBS溶液到芯片表面，使得表面全部浸润在PBS溶液中；
步骤1.2、将与玻璃基板相同大小的覆盖玻璃覆盖在芯片上并排出所有气泡，使用固定架将所述基板与所述覆盖玻璃夹紧，确保所述覆盖玻璃紧贴芯片两侧的所述边梁；
步骤1.3、在固定了30度斜坡的培养皿中加入适量的PBS溶液，将芯片放置在30度的斜坡上，且下端连通斜坡下的PBS溶液；
步骤1.4、将经过预处理的细胞样本通过注射器或移液枪滴加在芯片上端所述基板与所述覆盖玻璃之间，在表面张力的作用下细胞样本会进入芯片；
步骤1.5、细胞在从芯片上端流向细胞下端的过程中，所述细胞捕获栏将捕获单个的细胞。
进一步地，所述步骤2还包括：
步骤2.1、将PBS溶液通过注射器或移液枪滴加在芯片上端所述基板与所述覆盖玻璃之间，冲洗掉芯片内过量的未被捕获栏捕获的细胞；
步骤2.2、将浓度为8％或10％的SDS-PAGE胶通过注射器或移液枪滴加在芯片上端所述基板与所述覆盖玻璃之间，通过表面张力替换掉全部的PBS溶液。
进一步地，所述步骤4具体为：待所述步骤2.2加入的SDS-PAGE胶凝固后，移除所述覆盖玻璃，即可进行常规的单细胞电泳和免疫印迹测量。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益技术效果：
1、本发明具有高细胞利用率，可以将进入芯片的绝大多数细胞固定到微孔当中，避免稀有细胞的损失；
2、本发明具有高微孔落孔率，可以有效利用大部分的微孔孔位，提高芯片同时处理的细胞能力；
3、本发明具有高单细胞达成率，能够减少多个细胞占有同一个孔位的几率，提高单细胞达成率；
4、本发明细胞落孔时间更短，避免引起细胞性状改变引起的蛋白失活，节省实验时间，降低人力时间成本。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的微结构示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例的细胞捕获栏的样式示意图；
图3是本发明的一个较佳实施例的细胞样本进入芯片示意图；
图4是本发明的一个较佳实施例的单个细胞被捕获示意图；
图5是本发明的一个较佳实施例的未被捕获栏捕获的细胞被冲洗示意图。
其中，1-边梁，2-整流柱，3-导流三角，4-细胞捕获栏，5-基板，6-覆盖玻璃，7-单个细胞。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
在附图中，结构相同的部件以相同数字标号表示，各处结构或功能相似的组件以相似数字标号表示。附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的，本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰，附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。
如图1所示，是本发明的一个较佳实施例的微结构示意图，基于单缝微阱单细胞捕获结构，芯片主体为开放式结构，上方可以覆盖一层透明玻璃，形成闭合微流控通道。微流控芯片包括：边梁1、整流柱2、导流三角3、细胞捕获栏4、基板5；芯片的基板5是一片透明玻璃，其上的边梁1、整流柱2、导流三角3、细胞捕获栏4都由4％SDS-PAGE胶制成；细胞捕获栏4的样式如图2所示有三种，分别是单缝栏、U型栏和双缝栏。
微流控芯片的工作流程如下：
步骤1、用注射器或移液枪抽取并滴加足量PBS溶液到芯片表面，使得表面全部浸润在PBS溶液中；
步骤2、将与玻璃基板5相同大小的覆盖玻璃6覆盖在芯片上并排出所有气泡，使用固定架将两片玻璃夹紧，确保覆盖玻璃6紧贴芯片两侧的边梁1；
步骤3、在固定了30度斜坡的培养皿中加入适量的PBS溶液，将芯片放置在30度的斜坡上，且下端连通斜坡下的PBS溶液；
步骤4、将经过预处理的细胞样本通过注射器或移液枪滴加在芯片上端两片玻璃之间，在表面张力的作用下细胞样本会进入芯片，如图3所示；
步骤5、细胞在从芯片上端流向细胞下端的过程中，细胞捕获栏4将捕获单个细胞7，如图4所示，此过程可以使用显微镜进行观察；
步骤6、将PBS溶液通过注射器或移液枪滴加在芯片上端两片玻璃之间，冲洗掉芯片内过量的未被细胞捕获栏4捕获的细胞，如图5所示；
步骤7、将浓度为8％或10％的SDS-PAGE胶通过注射器或移液枪滴加在芯片上端两片玻璃之间，通过表面张力替换掉全部的PBS溶液；
步骤8、待新加入的SDS-PAGE胶凝固后，移除覆盖玻璃6，即可进行常规的单细胞电泳和免疫印迹测量。
常规的单细胞电泳和免疫印迹测量流程是，将芯片朝上放入电泳槽，加入预热至55摄氏度的含有细胞裂解液的电泳液，通过施加40V/cm的电场将蛋白分子在胶中电泳分离，再放入紫外光下照射固定蛋白质，对细胞内的若干种靶向蛋白进行特异性抗体的染色，利用荧光显微镜或者共聚焦显微镜对蛋白质信号的强度进行测量。
本发明通过单缝微阱单细胞捕获结构，配合可分离的滑动芯片结构，既有闭合微流控通道的高细胞捕获率优势，又兼容单细胞western原有的开放式的蛋白质电泳，保留原方法的特异性及分离分辨率，保留原方法的蛋白电泳和检测能力。可同时非选择性捕获细胞，包括不同细胞周期的，不同细胞活性的细胞，避免由于方法本身造成对细胞异质性的误判和漏判。同时实现单细胞免疫印迹的细胞分离、单细胞捕获固定、细胞原位裂解和电离。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种新型单细胞western blot的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括：边梁、整流柱、导流三角、细胞捕获栏、基板；所述微流控芯片基于单缝微阱单细胞捕获结构，所述微流控芯片包括可分离的滑动芯片结构，所述微流控芯片的主体为开放式结构。
2.如权利要求1所述的新型单细胞western blot的微流控芯片，其特征在于，所述基板为透明玻璃。
3.如权利要求1所述的新型单细胞western blot的微流控芯片，其特征在于，所述边梁、所述整流柱、所述导流三角、所述细胞捕获栏由4％SDS-PAGE胶制成。
4.如权利要求1所述的新型单细胞western blot的微流控芯片，其特征在于，所述细胞捕获栏的样式包括：单缝栏、U型栏和双缝栏。
5.如权利要求1所述的新型单细胞western blot的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的上方覆盖一层透明玻璃，形成闭合微流控通道。
6.如权利要求1所述的新型单细胞western blot的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片能够同时非选择性捕获细胞，包括不同细胞周期的细胞和不同细胞活性的细胞。
7.一种如权利要求1至6任一所述的新型单细胞western blot的微流控芯片的工作流程，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将细胞悬液充分震荡后，从芯片上方注入，细胞被单缝微捕获；
步骤2、将电泳胶凝从芯片上方注入，替换掉所有的细胞悬液中液体；
步骤3、通过紫外或加热方式将凝胶固化；
步骤4、移除透明玻璃，放入电泳槽分离蛋白。
8.如权利要求7所述的新型单细胞western blot的微流控芯片的工作流程，其特征在于，所述步骤1还包括：
步骤1.1、用注射器或移液枪抽取并滴加足量PBS溶液到芯片表面，使得芯片表面全部浸润在PBS溶液中；
步骤1.2、将与所述基板相同大小的覆盖玻璃覆盖在芯片上并排出所有气泡，使用固定架将所述基板与所述覆盖玻璃夹紧，确保所述覆盖玻璃紧贴芯片两侧的所述边梁；
步骤1.3、在固定了30度斜坡的培养皿中加入适量的PBS溶液，将芯片放置在30度的斜坡上，且下端连通斜坡下的PBS溶液；
步骤1.4、将经过预处理的细胞样本通过注射器或移液枪滴加在芯片上端所述基板与所述覆盖玻璃之间，在表面张力的作用下细胞样本会进入芯片；
步骤1.5、细胞在从芯片上端流向细胞下端的过程中，所述细胞捕获栏将捕获单个的细胞。
9.如权利要求8所述的新型单细胞western blot的微流控芯片的工作流程，其特征在于，所述步骤2还包括：
步骤2.1、将PBS溶液通过注射器或移液枪滴加在芯片上端所述基板与所述覆盖玻璃之间，冲洗掉芯片内过量的未被捕获栏捕获的细胞；
步骤2.2、将浓度为8％或10％的SDS-PAGE胶通过注射器或移液枪滴加在芯片上端所述基板与所述覆盖玻璃之间，通过表面张力替换掉全部的PBS溶液。
10.如权利要求9所述的新型单细胞western blot的微流控芯片的工作流程，其特征在于，所述步骤4具体为：待所述步骤2.2加入的SDS-PAGE胶凝固后，移除所述覆盖玻璃，即可进行常规的单细胞电泳和免疫印迹测量。
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