ES2856733T3 - Procedimiento de manipulación de microgotas que incluye muestras - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de manipulación en un sistema microfluídico de microgotas (14) que incluye unas muestras (16), que comprende las etapas que consisten en: i) formar en un aceite unas microgotas (14) de una disolución acuosa que contiene una muestra (16), conteniendo la disolución acuosa una muestra (16) que comprende un agente gelificante, ii) atrapar las microgotas (14) mediante trampas de tensión superficial (12) predispuestas en una zona de captura (10), y iii) gelificar al menos una parte de las microgotas (14) atrapadas, realizándose las etapas del procedimiento en un único sistema microfluídico.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de manipulación de microgotas que incluye muestras
La presente invención se refiere a un procedimiento microfluídico de manipulación de muestras, especialmente biológicas, en microgotas de hidrogel. La invención se refiere también a un dispositivo para implementar tal procedimiento y a un producto de muestras obtenido aplicando tal procedimiento.
Se sabe por Guo, Rotem, Heyman, & Weitz, “Droplet microfluidics for high-throughput biological assays”, Lab. Chip.
12 (2012), que las gotas en sistemas microfluídicos (o “microgotas”) pueden utilizarse para contener reacciones químicas o biológicas. En estos sistemas, el contenido de estas gotas puede probarse observando la fluorescencia de la gota cuando pasa delante de un láser focalizado. Sin embargo, estos sistemas no permiten observar la evolución en función del tiempo del contenido de estas gotas sin extraerlas del dispositivo microfluídico.
Se sabe también, por ejemplo por Joensson, H. N. & Andersson Svahn, H., “Droplet microfluidics - a tool for singlecell analysis”, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 12176-12192 (2012), estudiar unas células individualizadas en microgotas. Estas microgotas forman, en efecto, unos compartimentos bien definidos que permiten aislar muestras biológicas como, por ejemplo, células. Este documento enseña especialmente que la localización de las poblaciones de células encapsuladas se puede controlar gracias a la acumulación de las gotas en cámaras de cultivo, en canales alargados, o también en trampas estáticas. Este documento enseña también que las células pueden encapsularse en hidrogeles funcionalizados rodeados de una fase oleosa.
Sin embargo, el aporte de nutrimentos o, de manera más general, de moléculas de interés biológico para las células en tales dispositivos resulta ser limitado, y los métodos implementados (por ejemplo por electrofusión o pico-inyección) complejos. En consecuencia, estos dispositivos presentan numerosos límites para el estudio del comportamiento celular, en particular a nivel temporal.
Por otro lado, se conoce por L. Yu, M. C.W. Chen y K. C. Cheung, “Droplet-based microfluidic system for multicellular tumor spheroid formation and anticancer drug testing”, Lab Chip (2010) un procedimiento para manipular microgotas de hidrogel que contienen esferoides multicelulares. Según este procedimiento, se producen en un primer sistema microfluídico unas microperlas de hidrogeles que incluyen células. Se recuperan después y se lavan en un baño antes de inyectarlas en un segundo sistema microfluídico que comprende unas trampas que permiten fijar las microgotas.
Tal procedimiento es, sin embargo, complejo, y necesita dos sistemas microfluídicos distintos y tres dispositivos en total. Además, no permite observar las muestras de forma continua. En particular, no permite observar los momentos iniciales entre la formación de las gotas y su captura.
Se conoce también por la solicitud de patente US 2008/241841 un método de amplificación del ARN mensajero molécula por molécula que comprende las etapas de formación de gotas que contienen uno o varios ácidos nucleicos, y un agente gelificante disperso en forma de emulsión en una disolución de aceite, de amplificación por PCR mediante un dispositivo de control de la temperatura y de detección por fluorescencia. Tal método de amplificación del ARN mensajero necesita el uso de dos sistemas microfluídicos.
Se conoce también por la solicitud de patente US 2003/0049320 un procedimiento de encapsulación de una emulsión para proponer un nuevo formato de portador de agente activo, especialmente útil en el caso de medicamentos. Esta solicitud describe una dispersión gelificada que contiene una o varias gotas de un disolvente acuoso que contiene un polímero biocompatible.
Además, se conoce por la solicitud de patente US 2017/0015614 un dispositivo de clasificación, amplificación, detección e identificación de ácidos nucleicos, que comprende un generador de gotitas, un sustrato dividido en células, estando cada una destinado a contener una gotita, así como un medio de inyección de un reactivo en dichas células.
Existe por lo tanto la necesidad de un procedimiento de manipulación de microgotas que contienen muestras más simples y que permita, sin embargo, una amplia gama de pruebas sobre las muestras. Existe también la necesidad de un procedimiento de manipulación de microgotas que permita una clasificación más eficaz de las microgotas.
Con este fin, la invención propone un procedimiento de manipulación en un sistema microfluídico de microgotas que incluye unas muestras según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
Así, según la invención, para clasificar las microgotas de interés -es decir las microgotas que contienen unas muestras de interés- estas microgotas son atrapadas en primer lugar en trampas de tensión superficial (o trampa capilar), y después algunas de las microgotas o una parte del aceite que las rodea se gelifican. La gelificación de las microgotas o del aceite que las rodea facilita la clasificación, acentuando la fuerza de captura de las microgotas en las trampas. En otras palabras, la etapa de gelificación permite evitar que se pierdan las microgotas de interés.
Además, esta gelificación permite evitar que las microgotas puedan fusionarse, lo que provocaría una mezcla de las muestras de estas microgotas.
Por trampa de tensión superficial se entiende una trampa de una zona del sistema microfluídico cuya geometría, con la tensión interfacial de la microgota, permite que la microgota se mantenga en posición.
Todas las etapas del procedimiento se realizan en un sistema microfluídico único. Por sistema microfluídico, se entiende un sistema cuyas piezas se fabrican según procedimientos de microfabricación. Tal sistema presenta unos conductos, al menos una dimensión de los cuales es típicamente inferior al milímetro.
La forma de la microgota se puede controlar. Este control de la forma de la microgota puede combinarse con el control del instante de gelificación de la microgota o de una parte del aceite que la rodea, para dar acceso a diferentes aplicaciones, especialmente en la manipulación de células.
Por células se entiende las células eucariotas (por ejemplo, células vegetales, hongos, levaduras, células de mamíferos), y las células procariotas (por ejemplo, bacterias). Para las células de mamíferos, se distinguen las células independientes del anclaje (por ejemplo, algunas células de la línea sanguínea y las células tumorales altamente transformadas), y las células dependientes del anclaje (la mayoría de los otros tipos celulares), de las cuales algunos subtipos pueden organizarse en forma de esferoides. Se entiende por esferoides unas estructuras multicelulares organizadas en forma de micro-tejidos cuyas funcionalidades son similares a las de los tejidos derivados de órganos. Según unos modos de realización preferidos, el procedimiento según la invención comprende una o varias de las características siguientes, tomadas solas o en combinación:
- la etapa iii) consiste en gelificar al menos una parte del aceite de la zona de captura, con la exclusión de las microgotas;
- la etapa iii) consiste en gelificar al menos una parte de las microgotas, con la exclusión del aceite que rodea las microgotas en la zona de captura;
- la muestra es una de entre una o más células, especialmente un esferoide de células, una o varias perlas que atrapan moléculas, siendo las perlas especialmente de material plástico, y una o más moléculas;
- la etapa iii) se realiza después de la sedimentación de las muestras, especialmente de las células, en las microgotas atrapadas, en particular después de la formación de esferoides;
- la etapa iii) se realiza antes de la sedimentación de las muestras en las microgotas atrapadas;
- el procedimiento comprende además la etapa que consiste en:
iv) sustituir el aceite que rodea las microgotas gelificadas por una disolución acuosa;
- la disolución acuosa que sustituye el aceite contiene una disolución bioquímica, comprendiendo la disolución bioquímica preferentemente al menos uno de entre uno o más tampones de pH o de salinidad, uno o más nutrimentos, uno o más factores de crecimiento, unas citoquinas, uno o más anticuerpos, uno o más antígenos, una o más moléculas, en particular de medicamento, una o unas células, unos lípidos, unos glúcidos, especialmente en forma monomérica o de polisacáridos, unos aminoácidos y/o unas proteínas;
- la zona de captura está formada por un chip microfluídico que comprende las trampas de tensión superficial; - la etapa i) consiste en:
a) inyectar en una zona, aguas arriba de la zona de captura, una disolución acuosa que contenga muestras y un agente gelificante, llegado el caso,
b) inyectar aceite, que contiene un agente gelificante, llegado el caso, en la zona aguas arriba de la zona de captura para empujar la disolución acuosa que contiene muestras hacia una salida de la zona de captura, realizándose la inyección de aceite para formar unas microgotas que contengan unas muestras, después c) desplazar las microgotas hasta el nivel de la zona de captura y atrapar las microgotas en la zona de captura; -las etapas i) y ii) se realizan simultáneamente en la zona de captura, realizando las acciones que consisten en: - llenar la zona de captura de disolución acuosa que contiene unas muestras y un agente gelificante, llegado el caso, después
- inyectar aceite, que contiene un agente gelificante, llegado el caso, en la zona de captura para empujar la disolución acuosa que contiene unas muestras hacia una salida de la zona de captura, estando configuradas las trampas de tensión superficial para permitir la ruptura de las microgotas que contienen unas muestras a nivel de las trampas de tensión superficial;
- la etapa iii) consiste en al menos uno de entre:
- enfriar o calentar unas microgotas y/o el aceite,
- inyectar una disolución que contiene un agente químico de gelificación,
- someter las microgotas y/o el aceite a una luz que provoque la gelificación, especialmente una luz UV. - el aceite contiene un agente surfactante, comprendiendo el procedimiento preferentemente una etapa de lavado del agente surfactante antes de la etapa iv);
- el procedimiento comprende una etapa, previa a la etapa i), de elección de la forma de las trampas de tensión superficial en función de la forma deseada de las microgotas;
- la zona de captura y las trampas se seleccionan para:
- formar unas microgotas atrapadas con un fondo plano, o
- formar unas microgotas atrapadas con un fondo no plano, especialmente curvo, preferentemente convexo; - el procedimiento comprende una etapa v) posterior a la etapa iii), y preferentemente posterior a la etapa iv), que consiste en desgelificar al menos algunas de las microgotas gelificadas en la etapa iii);
- el procedimiento comprende una etapa vi), posterior a la etapa v), que consiste en evacuar las microgotas desgelificadas y/o las muestras contenidas en estas microgotas desgelificadas fuera de la zona de captura; - el procedimiento comprende una etapa de aplicación de un estímulo a las muestras contenidas en al menos una parte de las microgotas atrapadas, gelificadas o no; y
- el procedimiento comprende una etapa posterior a la etapa iii) que consiste en empujar fuera de la zona de captura las microgotas alrededor de las cuales el aceite no se ha gelificado, para mantener solamente en la zona de captura las microgotas alrededor de las cuales se ha gelificado el aceite.
Según otro aspecto, la invención se refiere a un dispositivo según la reivindicación 15 o la reivindicación 16.
El dispositivo comprende:
- medios para formar unas microgotas que contienen unas muestras,
- una zona de captura, especialmente un chip microfluídico, para atrapar las microgotas en sitios predeterminados, y
- medios de gelificación de al menos una parte de las microgotas atrapadas o del aceite.
Los medios de gelificación pueden comprender un dispositivo de inyección de un agente químico en la zona de captura. El dispositivo puede además comprender unos medios para desgelificar al menos algunas de las microgotas de hidrogel gelificadas o una parte del aceite gelificado, llegado el caso.
La invención tiene como objetivo también un producto de microgotas gelificadas según la reivindicación 17.
Este producto comprende
una zona de captura de microgotas, en particular un chip microfluídico, y unas microgotas gelificadas que incluyen cada una una muestra, atrapadas en la zona de captura, estando las microgotas gelificadas crioconservadas.
Para ello, y con vistas al almacenamiento y/o a la distribución de este producto en microgotas, la disolución bioquímica puede contener agentes de crioprotección (DMSO, glicerol, trehalosa, etc.) para permitir la crioconservación de las muestras.
Las microgotas gelificadas pueden también bañarse en un fluido, preferentemente en una disolución acuosa o en un aceite, estando el fluido y las microgotas preferentemente crioconservados.
La invención se refiere también a un producto de microgotas según la reivindicación 18.
Este producto comprende una zona de captura, especialmente un chip microfluídico, y unas microgotas que incluyen cada una una muestra, atrapadas en la zona de captura, bañándose las microgotas en un aceite gelificado, estando las microgotas y el aceite gelificado preferentemente crio-conservados.
Las muestras pueden ser unas células de mamíferos, preferentemente unas células de mamíferos con la exclusión de células humanas, de bacterias, de levaduras o de otras células utilizadas en bioprocesos, moléculas, perlas que atrapan moléculas en la superficie.
La invención se entenderá mejor a partir de la lectura de la descripción siguiente de ejemplos de realización de la invención, con respecto a los dibujos anexos, en los que:
- la Figura 1 representa, esquemáticamente, un chip microfluídico,
- la Figura 2 representa, esquemáticamente, el chip microfluídico de la Figura 1, en el que unas trampas están ocupadas por una microgota de hidrogel que contiene unas muestras,
- la Figura 3 representa, esquemáticamente, el chip microfluídico de la Figura 1 que contiene una mezcla de hidrogel y de muestras a ensayar,
- las Figuras 4 a 6 ilustran, esquemáticamente, un medio para evacuar una parte de las muestras contenidas en las microgotas de hidrogel atrapadas en un chip microfluídico fuera de este chip microfluídico,
- las Figuras 7 a 12 ilustran, esquemáticamente, unos ejemplos de geometrías de trampas de tensión superficial y las formas de microgotas que permiten obtener, y
- las Figuras 13 a 15 ilustran, esquemáticamente, unos ejemplos de sedimentación de muestras en microgotas de hidrogel.
La invención se refiere a un procedimiento de manipulación de microgotas de hidrogel que incluyen unas muestras a ensayar.
A continuación, se hace referencia más particularmente a muestras en forma de células, pero se pueden implementar, por supuesto, otros tipos de muestras.
El procedimiento comprende esencialmente tres etapas, todas realizadas en un único sistema microfluídico, constituyendo las tres etapas en:
- formar un aceite, unas microgotas de disolución acuosa, líquida, que contiene una o más células, comprendiendo la disolución acuosa un agente gelificante,
- atrapar las microgotas, líquidas, mediante trampas de tensión superficial predispuestas en una zona de captura, y
- gelificar el aceite o al menos una parte de las microgotas atrapadas, llegado el caso.
A continuación, se hace referencia más particularmente al caso en el que la disolución acuosa es una disolución de hidrogel, no comprendiendo el aceite ningún agente gelificante y en el que la última etapa anterior consiste en gelificar al menos una parte de las microgotas atrapadas, sin que el aceite esté gelificado. En este caso, tras las tres etapas mencionadas anteriormente, el procedimiento puede continuar implementando diferentes etapas, en función de la prueba que se desea realizar, especialmente.
El procedimiento puede continuar, especialmente, con una etapa que consiste en reemplazar el aceite alrededor de las microgotas gelificadas por una disolución acuosa, sin desplazar las microgotas de las trampas de tensión superficial. La disolución acuosa puede contener una disolución bioquímica con al menos uno de entre nutrimentos, factores de crecimiento, anticuerpos, moléculas de medicamento y tampones de pH y/o de salinidad.
Según otro aspecto, el procedimiento permite el control de la forma tridimensional de perlas de hidrogel en un canal microfluídico y/o en trampas de tensión superficial con, para la primera aplicación, la encapsulación de células en estas microgotas. Así, según la forma de las microgotas y la concentración de células por microgota, la encapsulación de las células en el hidrogel permite su cultivo o su análisis, perfusionándolas al mismo tiempo con unas disoluciones bioquímicas, o aplicándolas unos estímulos físicos tales como calor o luz, por ejemplo.
Por gel se entiende un medio compuesto de una mayoría de líquido y que contiene unas moléculas o partículas que pueden organizarse para conferirle un aspecto sólido, como por ejemplo la ausencia de fluidez en su estado estable. Esta disolución se puede manipular en estado líquido y después se puede “gelificar” mediante medios químicos o físicos. La gelificación puede ser reversible en algunos casos. Cuando el líquido es agua, se habla de hidrogel.
Como se ha indicado anteriormente, el procedimiento microfluídico propuesto comprende una primera etapa de formación de microgotas de hidrogel que contiene células biológicas en un aceite.
Aquí, las microgotas (o microperlas) presentan un diámetro del orden del micrómetro, especialmente un diámetro comprendido entre 10 y 1000 micrómetros.
El hidrogel es, por ejemplo, una disolución acuosa que comprende un agente gelificante. El agente gelificante lo selecciona el usuario en función de la aplicación. Un ejemplo de agente gelificante que puede gelificarse de manera física es la agarosa, líquida a temperatura ambiente y que gelifica a baja temperatura. Un agente gelificante que puede gelificarse de manera química es, por ejemplo, el alginato, líquido en disolución y que gelifica en caso de aportación de iones calcio Ca2+.
A nivel biológico, las propiedades bioquímicas y biomecánicas del hidrogel pueden permitir a las células sensibles al anclaje establecer unas interacciones específicas con la matriz así formada. Estas interacciones son esenciales para la supervivencia de las células de mamíferos dependientes del anclaje y que participan en la regulación de su fenotipo. La naturaleza de la matriz puede, por ejemplo, permitir la observación de la migración celular o proteólisis (digestión de la matriz por las células). Se han llevado a cabo unos experimentos particularmente concluyentes con la agarosa, el alginato, el PED-DA (diacrilato de polietilenglicol), pero también gelatina, colágeno de tipo I, o Matrigel®. Por ejemplo, los hidrogeles que contienen diversas proteínas, glicoaminoglicanos y otros componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, el colágeno de tipo I, la gelatina o el Matrigel®) han demostrado su capacidad para mantener la viabilidad, sostener la proliferación y la capacidad de migración, así como mantener el fenotipo de ciertas poblaciones de células dependientes del anclaje. Cabe señalar aquí que los geles pueden combinarse, por ejemplo, por aporte de microgotas sucesivas. A cada uno de los hidrogeles mencionados corresponde un procedimiento de gelificación específico. Algunos hidrogeles, tal como el PEG-DA, pueden además funcionalizarse para permitir la supervivencia y/o el desarrollo de las células, incorporando unos peptidomiméticos (por ejemplo, los hidrogeles se pueden funcionalizar con unas secuencias de consenso de tipo RGD sobre las cuales algunos tipos de células de mamíferos pueden establecer unas interacciones específicas o también unas secuencias de consenso PRCG[V/N]PD o HEXGHXXGXXH específicas a las metaloproteasas) o el sensor de moléculas específicas mediante la incorporación de anticuerpos o de aptámeros, por ejemplo la captura in situ de citoquinas secretadas por linfocitos encapsulados. Las propiedades mecánicas de estos hidrogeles pueden también modularse para diferentes aplicaciones, variando por ejemplo su grado de reticulación y/o su concentración. El conjunto de estas propiedades fisicoquímicas puede ser diferente de una trampa a otra dentro de la zona de captura. La instauración de un gradiente de rigidez dentro de las microgotas de hidrogeles atrapadas permite, por ejemplo, la diferenciación controlada de células madre en diferentes tipos celulares. Finalmente, pueden coexistir varios hidrogeles en una misma microgota tras una mezcla o la formación sucesiva de varias capas alrededor del núcleo gelificado en la trampa.
Las células se mezclan con el hidrogel, a priori antes de la formación de las microgotas. Sin embargo, la mezcla del hidrogel y de las células se puede realizar directamente en el dispositivo microfluídico, antes de la formación de las microgotas.
Ya se han propuesto numerosos procedimientos para formar tales microgotas en una fase móvil, tal como aceite. Se pueden citar, por ejemplo, los ejemplos de procedimiento:
- procedimiento denominado de “flow-focusing” descrito por ejemplo en S.L. Anna, N. Bontoux y H.A. Stone, “Formation of dispersions using 'Flow-Focusing' in microchannels”, Appl. Phys. Lett. 82, 364 (2003),
- procedimiento denominado de “unión en T” descrito por ejemplo en “Dynamic pattern formation in a vesiclegenerating microfluidic device” por T. Thorsen, R. W. Roberts, F. H. Arnold y S. R. Quake, Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4166 (2001),
- procedimiento denominado “de gradiente de confinamiento” descrito por ejemplo en la solicitud FR-A-2958 186.
Estos procedimientos permiten formar microgotas de dimensiones sustancialmente iguales.
Después de la formación de estas microgotas, las microgotas se transportan desde la zona en la que se han formado hasta la zona de captura por microcanales, arrastradas por un flujo de aceite y/o por pendientes o raíles. Se ha constatado que este transporte ayuda a la formación de esferoides en las microgotas. Las microgotas se atrapan después por unas trampas de tensión superficial dispuestas en la zona de captura, especialmente en un chip microfluídico. La zona de captura (o chip microfluídico 10) se trata mediante un tratamiento superficial hidrófobo, y se llena de un aceite que contiene un surfactante. El uso de surfactante permite la estabilización de las microgotas y la
reproducibilidad de su formación. Los surfactantes permiten además impedir la coalescencia de las microgotas en caso de contacto durante su transporte desde el dispositivo de producción a las trampas de la zona de captura.
El chip microfluídico 10, tal como se ilustra en la Figura 1, está compuesto de una cámara de cultivo, posiblemente de varios centímetros cuadrados, que contiene numerosas trampas de tensión superficial organizadas en tabla o matriz. Las trampas de tensión superficial 12 pueden tener formas variadas. Por ejemplo, en el caso de trampas cilíndricas, su diámetro puede extenderse desde algunas decenas de micrómetros hasta varios centenares en función de la aplicación deseada. Para la encapsulación de células únicas o individualizadas en las microgotas, el diámetro de las trampas puede ser, por ejemplo, de 50 micrómetros, lo que corresponde a una densidad de alrededor de 5000 trampas por centímetro cuadrado. Para el estudio de amplios agregados celulares o de esferoides, este diámetro puede pasar a 250 micrómetros, lo que corresponde entonces a una densidad de trampas del orden de 250 trampas por centímetro cuadrado.
Como se ilustra en la Figura 1, las microgotas 14 que incluyen las células biológicas 16, formadas en el exterior de chip microfluídico 10, son arrastradas en este último, por ejemplo, con la ayuda de un flujo de aceite ilustrado por la flecha 18, de tal manera que algunas de estas microgotas son atrapadas en las trampas de tensión superficial 12.
No obstante, en una variante, se propone aquí formar unas microgotas de hidrogeles que contienen unas células biológicas, en un aceite, sin control preciso del flujo de hidrogel que contiene las células biológicas en el aceite. En efecto, sólo las microgotas que presentan unas dimensiones adecuadas son después atrapadas en la zona de captura, de manera que esta última está ocupada por microgotas que presentan finalmente una gran homogeneidad de dimensión, de forma y de concentración de células biológicas.
Según otra variante, ilustrada en la Figura 3, la zona de captura, especialmente un chipo microfluídico 10, contiene una disolución de hidrogel 20 que contiene células biológicas 16. Se inyecta entonces en la zona de captura un aceite (la inyección se esquematiza mediante la flecha 18), que empuja la disolución de hidrogel 20 que contiene las células biológicas 16 hacia una salida de la zona de captura. Las microgotas se forman entonces directamente a nivel de las trampas de tensión superficial 12, atrapando el hidrogel en estas trampas del chip microfluídico, esto hasta obtener una configuración sustancialmente idéntica a la ilustrada en la Figura 2. Las microgotas se forman así por división espontánea (o ruptura) de la disolución de hidrogel que contiene las células biológicas en las trampas de tensión de superficial. Aquí tampoco es necesario un control preciso de los flujos, y es incluso posible empujar las jeringas con la mano, sin tener que recurrir a instrumentos sofisticados. En este caso, se prefieren unas trampas de tensión superficial profundas para permitir la ruptura de las microgotas (es decir, su formación) a nivel de las trampas de tensión superficial. Tales trampas se describirán posteriormente.
Cabe señalar aquí que las trampas pueden ser de formas muy diferentes, especialmente en función de la aplicación buscada, es decir, en particular, en función de la forma de las microgotas atrapadas buscada. La cavidad que forma la trampa puede también encontrarse indiferentemente en la pared superior, inferior o una de las paredes laterales de la zona de captura, especialmente del chip microfluídico.
Las Figura 7 a 12 ilustran formas posibles de las trampas de tensión superficial 12 del chip microfluídico 10 y la forma de las microgotas 14 que puede obtenerse con la ayuda de estas trampas de tensión superficial 12.
En particular, la forma de la trampa 12 permite controlar la forma de las microgotas atrapadas, según los parámetros geométricos del canal microfluídico en el que se forma la trampa 12, y el volumen de las microgotas atrapadas. La Figura 7 ilustra esquemáticamente los parámetros a tener en cuenta para determinar el perfil de la microgota, es decir, el radio R de la microgota confinada en un canal que contiene una trampa 12, la altura h de este canal, inferior al radio R de la microgota en el canal, y el diámetro d y la profundidad p de la trampa 12.
Cuando la trampa 12 es cilíndrica y tiene un diámetro d superior a dos veces la altura h del canal, como se ilustra en las Figuras 8 a 10, entonces la microgota 14 entra tanto como sea posible en la trampa 12. Según los volúmenes relativos de la trampa 12 y de la microgota 14, la microgota 14 puede presentar o no un casquete semiesférico, y tener o no una parte plana, confinada por las paredes del canal. Así, en la Figura 8, el volumen de la microgota 14 es superior al volumen de la trampa 12. En este caso, la microgota 14 llena casi totalmente la trampa 12 y presenta una forma aplanada contra las paredes del canal y de la trampa. En la Figura 9, la microgota 14 presenta un volumen ligeramente menor que el de la trampa 12, entonces la microgota 14 presenta dos casquetes semiesféricos y apenas roza las paredes de canal. Finalmente, si la microgota 14 presenta un volumen claramente menor que el volumen de la trampa 12, como se ilustra en la Figura 10, entonces la microgota 14 (incluso varias microgotas 14) se reciben completamente en la trampa 12.
En el caso de la Figura 11, por el contrario, la trampa tiene un diámetro d inferior a dos veces la altura h del canal. Como resultado, la microgota 14 permanece esencialmente confinada en el canal y presenta sólo un pequeño casquete semiesférico en la trampa 12.
Finalmente, en el caso de la Figura 12, la trampa 12 es cónica y tiene un diámetro d superior a dos veces la altura h del canal. La microgota 14 se adapta entonces a la forma de la pared de la trampa 12 para formar un casquete semiesférico en la trampa 12.
Por otro lado, como se ilustra en la Figura 13, si la microgota 14 atrapada en una trampa 12 tiene un fondo plano, las células 16 sedimentan y se depositan de manera estadísticamente uniforme en el fondo de la microgota 14. Las células pueden entonces observarse individualmente, y no se agregan. Por el contrario, si la microgota 14 atrapada en una trampa 12 tiene un fondo no plano, especialmente convexo, tal como se ilustra en las Figuras 14 y 15, entonces las células 16 encuentran la interfaz de la microgota 12 durante su sedimentación, y se ven entonces obligadas a deslizarse a lo largo de esta interfaz. Las células 16 se concentran así en el fondo de la microgota 14, y pueden eventualmente agregarse y formar esferoides en el caso de ciertas células dependientes del anclaje.
El procedimiento microfluídico propuesto aquí comprende, después de la captura de las microgotas, una etapa de gelificación de estas microgotas.
Esta etapa se puede realizar de maneras variadas, en función especialmente del agente gelificante del hidrogel utilizado. Así, según un primer ejemplo, el hidrogel contiene, preferentemente, agarosa. La gelificación de las microgotas se realiza entonces enfriando el chip microfluídico. Cuando el hidrogel contiene o, preferentemente, es el alginato, es posible llevar unos iones calcio Ca2+ en el aceite en el que bañan las microgotas, o bien premezclar partículas cálcicas con el alginato y saturar con CO2 el aceite en el que bañan las microgotas. Se acidifica así el alginato y se liberan unos iones calcio. Por supuesto, al poderse utilizar otros agentes gelificantes, se pueden implementar otros medios de gelificación.
Por otro lado, en función de la aplicación buscada, esta etapa de gelificación se puede realizar en instantes diferentes del procedimiento de manipulación. En particular, la gelificación puede llevarse a cabo inmediatamente después de la captura a fin de fijar las células in situ, en la microgota, y no permitir su sedimentación. Se puede entonces observar las células independientemente las unas de las otras. Alternativamente, la gelificación se realiza después de la sedimentación de las células para formar unos esferoides. Esto permite observar el comportamiento de las células que han formado un esferoide. Según otra alternativa, la gelificación de las microgotas se realiza sólo después de las manipulaciones de las células en medio líquido, por ejemplo, para extraer algunas células -aquellas en microgotas no gelificadas- de manera selectiva. Esto puede ser útil para células como bacterias o eritrocitos y leucocitos, que son independientes del anclaje.
Después de la gelificación, es posible sustituir el aceite en el que se bañan las microgotas con una disolución acuosa que contiene especialmente una disolución bioquímica que comprende unos componentes bioquímicos tales como nutrimentos, factores de crecimiento, anticuerpos, profármacos o moléculas de medicamento, por ejemplo. Estos componentes bioquímicos se difunden en el gel y alcanzan las células. Es así posible estudiar la reacción de las células, independientes o en forma de esferoides, a estos estímulos. El hidrogel permite así mantener las células en un sitio preciso, permitiendo al mismo tiempo su perfusión por una fase acuosa y que ha compartimentado previamente la muestra biológica durante la encapsulación de las células en unas microgotas.
Para realizar esta operación con éxito, es preferible expulsar el surfactante de las interfaces de las microgotas. La envoltura que forman los surfactantes a nivel de la interfaz de las microgotas puede, en efecto, ser tan eficaz que impide la fase acuosa, que se inyecta para sustituir el aceite, llenar el chip microfluídico, conservando al mismo tiempo las microgotas gelificadas en sus trampas respectivas. Como la coalescencia se combate por la presencia de surfactante, la llegada de la interfaz de la fase acuosa a nivel de una trampa da como resultado una fuerza aplicada sobre la microgota gelificada que puede expulsarse de la trampa si el hidrogel que la compone es suficientemente compresible. Es por ello que es preferible favorecer la coalescencia disminuyendo la concentración de surfactante a nivel de la interfaz. Para ello, el chip microfluídico se perfusiona antes de la inyección de la fase acuosa por aceite que, a diferencia del aceite utilizado anteriormente, no contiene surfactante. La concentración de surfactante en el aceite del chip microfluídico disminuye, lo que permite desplazar el equilibrio de adsorción de surfactante en la interfaz hacia la desorción. Para concentraciones elevadas de surfactante, por ejemplo, del orden de algunos porcentajes en masa, es preferible perfusionar el chip microfluídico con una cantidad de aceite equivalente a 50 veces el volumen del chip microfluídico. Esta relación depende de la naturaleza del o de los surfactantes y de su/sus afinidades para las dos fases.
La forma de las trampas también se puede optimizar para asegurar el mantenimiento en posición de las microgotas gelificadas en las trampas. Así, en el caso de una trampa cilíndrica suficientemente profunda, si la altura del canal es mayor que el radio de la trampa, la entrada de la microgota en la trampa será mínima, lo que da como resultado una baja eficacia de captura. En consecuencia, existe una velocidad límite del flujo exterior más allá del cual las microgotas se expulsan de las trampas. Por el contrario, cuando la altura del canal es más pequeña que el radio de la trampa, la microgota, con la condición de que sea suficientemente grande, penetra fuertemente en la cavidad de la trampa, lo que da como resultado una alta eficacia de captura. Las microgotas permanecen en su sitio independientemente de la velocidad del flujo exterior. En el primer caso, la forma de la microgota es muy similar a su forma en el canal, mientras que en el segundo caso, adopta localmente la forma de la trampa.
Cuando el agente gelificante del hidrogel seleccionado es reversible, es posible desgelificar las microgotas y después evacuar su contenido fuera del chip microfluídico, como se ilustra en las Figuras 4 a 6. En el caso de estas Figuras 4 a 6, las microgotas 14 son unas microgotas de agarosa gelificadas, por ejemplo. Estas microgotas 14 de agarosa se desgelifican una por una calentándolas localmente (estando ilustrado el calentamiento por los flashes 21), especialmente con la ayuda de un láser infrarrojo o con electrodos. El calor licúa la agarosa. Cuando la fase que rodea las microgotas 14 es acuosa, el contenido 16 de la agarosa desgelificada se mezcla con la fase acuosa. Es entonces posible arrastrar este contenido por el flujo 22 de la fase acuosa, eventualmente para recuperarlo. Es también posible eliminar así las células consideradas como no interesantes del chip microfluídico 10. De nuevo, la forma y el tamaño de la trampa se seleccionan preferentemente para permitir la extracción de las células. Por ejemplo, en el caso en el que las células deben permanecer viables, la trampa tiene una dimensión suficientemente grande para que el calentamiento del hidrogel no induzca los mecanismos de muerte celular.
Alternativamente, cuando la fase que rodea las microgotas es oleosa, puede imponerse un flujo de aceite para desalojar la microgota líquida de la trampa. En este caso, la forma y la fuerza de la trampa se dimensionan preferentemente para permitir la extracción de la microgota seleccionada únicamente, y no de las otras. Este dimensionamiento depende especialmente del valor de la tensión superficial entre la fase acuosa y el aceite, así como de la rigidez de las microgotas de gel y su forma en el interior de la trampa.
Otra alternativa es mantener en suspensión las microgotas líquidas para la manipulación de células, por ejemplo, bacterias. La gelificación se realiza entonces únicamente para la extracción selectiva de las microgotas. En este caso, se pueden o bien gelificar todas las microgotas antes de la extracción y aplicar el protocolo descrito anteriormente, o bien, por el contrario, gelificar únicamente las microgotas que se desea conservar en las trampas.
El procedimiento presentado permite, gracias a ligeras modificaciones, interesarse por aplicaciones biológicas muy variadas. En cada caso, el dispositivo puede modificarse también, por supuesto, ajustando la altura del canal en el chip microfluídico y la geometría de las trampas.
Así, por ejemplo, una gelificación rápida con una baja concentración de células permite individualizar algunas células únicas en cada microgota intentando limitar sus interacciones directas. Estas células pueden ser, por ejemplo, bacterias, levaduras o células de mamíferos.
Alternativamente, una alta concentración de células todavía con una gelificación rápida permite obtener un gran número de células todavía individualizadas pero próximas las unas de las otras. Se puede entonces interesar, por ejemplo, en las interacciones entre células, posiblemente en cocultivo, a través de secreciones paracrinas.
No obstante, las células pueden mantenerse encapsuladas durante mucho tiempo en fase líquida antes de la gelificación. Una baja concentración de células permite entonces, por ejemplo, estudiar unas células en suspensión, independientes del anclaje, como los linfocitos. Como una alta concentración de células y una forma de las microgotas atrapadas permite la sedimentación de las células, permite poner en contacto las células que podrán reorganizarse en esferoides.
El procedimiento puede también permitir la formación de esferoides directamente en el chip de manera controlada. El volumen de microgotas creadas puede controlarse por el dispositivo de formación de microgotas aguas arriba del chip microfluídico. Este volumen se ajusta preferentemente de manera que las microgotas, una vez atrapadas, tengan un diámetro igual al de la trampa y una forma esférica. Para hacer esto, la profundidad de la trampa es preferentemente al menos igual a su diámetro. El hecho de que el diámetro de la microgota atrapada coincida con el de la trampa, permite asegurar una alta eficacia de captura. La forma esférica favorece la formación de esferoides. Para esta aplicación particular, las microgotas contienen preferentemente unas células en suspensión en una fase acuosa que comprende o que está constituida de medio de cultivo y de hidrogel. Una vez llenas las trampas con tal microgota, el flujo de aceite exterior se detiene, lo que para las recirculaciones dentro de las microgotas y favorece la sedimentación de las células. La forma esférica de las microgotas en las trampas induce entonces a una concentración de las células en sus puntos más bajos, hasta que entran en contacto. Mantener entonces el chip en reposo, en condiciones favorables para la supervivencia y el buen funcionamiento metabólico de las células, especialmente en temperatura, durante un tiempo que va desde varias horas hasta varios días, permite la reorganización de las células concentradas en el fondo de la microgota atrapada, en un esferoide.
La duración necesaria para la formación de esferoides puede depender especialmente del tipo celular utilizado y de la composición del hidrogel. Para células hepáticas de rata H4IIEC3 en una disolución de agarosa al 1% en masa diluida en un medio de cultivo, se ha constatado que esta duración es inferior a 24 horas. Por supuesto, el hidrogel se mantiene líquido durante el tiempo de formación de los esferoides.
Este procedimiento permite formar rápidamente un gran número de esferoides de tamaños muy homogéneos. En efecto, el tamaño de los esferoides se da por el número de células encapsuladas en cada microgota y por lo tanto por la concentración de la disolución de células inyectada en el chip microfluídico. La distribución del número de células por microgota, y por lo tanto la del tamaño de los esferoides formados, es muy homogénea, con la condición de que las células estén suficientemente individualizadas en el momento de la inyección. En promedio, en los experimentos
llevados a cabo por los inventores, el 98% de las trampas se llenaron con una microgota de agarosa líquida que después de 24 horas de incubación contenía un esferoide bien reorganizado.
Los esferoides obtenidos en el chip microfluídico se pueden mantener en cultivo durante varios días. Por ejemplo, los esferoides de células H4IIEC3 encapsulados en agarosa pueden cultivarse en el chip durante una semana sin alteración significativa de su viabilidad, conservando al mismo tiempo una funcionalidad fuerte (en este ejemplo una secreción de albúmina fuerte y continua).
El procedimiento presentado aquí y el chip microfluídico obtenido llevándolo a cabo, constituyen una excelente herramienta de cribado de medicamentos. Se puede crear, por ejemplo, unos esferoides de células cancerosas y observar si su viabilidad disminuye a lo largo del tiempo en función de la exposición a una molécula probada. Añadiendo al chip un dispositivo que permite instaurar un gradiente de concentración dentro de la cámara, o bien disponiendo unos chips paralelos, se puede probar toda una gama de concentraciones en un mismo sistema. La alta eficacia del procedimiento de formación de estos esferoides permite también crear un gran número de ellos a partir de muestras muy limitadas. Se pueden formar así 500 esferoides de aproximadamente 70 pm de diámetro con solamente 100 000 células.
Las células que componen los esferoides pueden también ser de diferentes tipos para abordar temáticas de cocultivo. Estos tipos celulares pueden mezclarse de manera homogénea en disolución antes de la inyección en el chip o disponerse según una cierta organización estructural en varias capas de hidrogeles sucesivas o simplemente por adhesión al hidrogel después de perfusionarse en la fase acuosa externa. Se puede, por ejemplo, asociar unos fibroblastos y unas células epiteliales para formar un modelo de piel y probar la toxicidad de productos cosméticos, de neuronas y de astrocitos para modelizar el cerebro, o también células endoteliales y células musculares lisas como en la pared de vasos sanguíneos.
Como el procedimiento presentado aquí permite alcanzar un control muy avanzado del microentorno de las células en cultivo, es también una excelente herramienta para el estudio de la diferenciación de células madre. Las células encapsuladas pueden, en efecto, someterse a cualquier gama de concentración de factores de diferenciación y, potencialmente al mismo tiempo, a cualquier gama de rigidez de la matriz jugando, por ejemplo, sobre la concentración del hidrogel. De la misma manera, el procedimiento se puede utilizar para observar el desarrollo embrionario a lo largo del tiempo en interacción con los factores fisicoquímicos del medio exterior.
En el caso de células primarias, procedentes de un paciente, este procedimiento permite realizar un diagnóstico médico basado en la respuesta de las células a ciertos marcadores. En este caso, las células se capturan con una tasa muy baja de pérdidas. Se puede entonces someter las células a pruebas de diagnóstico conocidas para ciertas enfermedades, tal como una caracterización de una biopsia cancerosa. Por ejemplo, se puede probar la presencia de una mutación en el genoma de las células encapsuladas, por ejemplo, por reacciones en cadena por polimerasa (PCR, por “Polymerase Chain Reaction” en inglés) in situ, o por el método FISH. Se puede también detectar la expresión de proteínas específicas mediante métodos de marcación, por ejemplo, aportando unos anticuerpos para el inmunomarcado o para un método inmuno-enzimático ELISA (del inglés “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay”) in situ.
El procedimiento descrito antes ofrece la posibilidad de efectuar todas las etapas de análisis y de cultivo de células en un chip microfluídico, gracias a la gelificación de las microgotas tras su captura en el chip. Esto permite utilizar unos volúmenes de reactivos mucho menos importantes que para pruebas realizadas en placas de múltiples pocillos o en cajas de cultivos. Esto permite también seguir las respuestas de células a lo largo del tiempo, tras diferentes estímulos.
El procedimiento descrito antes se puede realizar fácilmente en un dispositivo que comprende:
- unos medios para formar unas microgotas de hidrogel que contiene unas células,
- una zona de captura, en particular un chip microfluídico, para atrapar las microgotas de hidrogel en sitios predeterminados, y
- medios de gelificación de una parte al menos de las microgotas atrapadas.
Los medios de gelificación comprenden, por ejemplo, un dispositivo de inyección de un agente químico en la zona de captura y/o medios de regulación de la temperatura, por ejemplo, para enfriar el chip microfluídico.
El dispositivo puede también comprender unos medios para desgelificar al menos algunas de las microgotas de hidrogel gelificadas, por ejemplo, un láser.
El procedimiento descrito anteriormente permite también realizar un producto de microgotas gelificadas, que comprende una zona de captura de microgotas, en particular un chip microfluídico, y unas microgotas gelificadas que incluyen cada una una o más células, atrapadas en la zona de captura, siendo las microgotas gelificadas crioconservadas. Las células pueden agregarse en forma de cúmulo o de esferoides. Las microgotas gelificadas pueden bañar en un fluido, preferentemente en una disolución acuosa o en un aceite, siendo el fluido y las microgotas
preferentemente crioconservados. Esta crioconservación permite especialmente el mantenimiento de las células en condiciones estables durante un largo periodo, para transportarlas o almacenarlas para un análisis posterior.
Las células biológicas encapsuladas en las microgotas pueden ser bacterias, levaduras, células eucariotas, células de mamíferos, preferentemente células de mamíferos con la exclusión de las células humanas, más preferentemente unas células de rata o de otros mamíferos, o células humanas aisladas de su entorno natural.
Por supuesto, la invención no se limita a los únicos ejemplos descritos anteriormente, sino que, por el contrario, es susceptible de numerosas variantes accesibles para el experto en la técnica, en el ámbito del conjunto de las reivindicaciones adjuntas.
En particular, las muestras utilizadas, además de las células, pueden ser también, especialmente, unas moléculas, unas perlas de plástico funcionalizadas acoplándolas a moléculas.
Por otro lado, las microgotas atrapadas pueden fusionarse con otras microgotas aportadas por el flujo de disolución acuosa.
Asimismo, la disolución acuosa de la cual están constituidas las microgotas puede contener una disolución bioquímica, comprendiendo la disolución bioquímica preferentemente al menos uno de entre lípidos (ácidos grasos, etc.), glúcidos (en forma monomérica o de polisacáridos, etc.), aminoácidos, y proteínas (factores de crecimiento, citoquinas, anticuerpos, antígenos, etc.), así como tampones de salinidad y/o de pH.
Finalmente, según una variante, el aceite (o fase oleosa) que rodea las microgotas puede contener unos aceites fluorados (de tipo FV40) o también unas disoluciones foto-reticulables no miscibles en agua (de tipo Norland Optical Adhesive) que, una vez polimerizadas, permiten gelificar el aceite y así aislar física y selectivamente las microgotas. Se puede así compartimentar, aislar de manera más estable, las microgotas las unas con respecto a las otras. Esto permite evitar que dos microgotas se fusionen, provocando una mezcla de muestras que contienen. Esto permite también almacenar de manera duradera las muestras, los riesgos de evaporación, especialmente, reduciéndose fuertemente las microgotas debido al aislamiento de las microgotas por el aceite gelificado, que forma un compartimento sólido alrededor de las microgotas.
Una vez que una parte del aceite se ha gelificado, se pueden empujar fuera de la zona de captura las microgotas alrededor de las cuales no se ha gelificado el aceite. Para ello, se puede utilizar un flujo de aceite o de otro fluido en la zona de captura, siendo el flujo lo suficientemente fuerte para arrastrar las microgotas. Se puede así mantener en la zona de captura solo las microgotas alrededor de las cuales se ha gelificado el aceite.
Cabe señalar aquí que las microgotas pueden gelificarse incluso en el caso en el que el aceite esté gelificado. Además, el procedimiento puede, por supuesto, comprender, en este caso en el que una parte del aceite está gelificado, una etapa posterior de desgelificación del aceite gelificado.
Claims (18)
1. Procedimiento de manipulación en un sistema microfluídico de microgotas (14) que incluye unas muestras (16), que comprende las etapas que consisten en:
i) formar en un aceite unas microgotas (14) de una disolución acuosa que contiene una muestra (16), conteniendo la disolución acuosa una muestra (16) que comprende un agente gelificante,
ii) atrapar las microgotas (14) mediante trampas de tensión superficial (12) predispuestas en una zona de captura (10), y
iii) gelificar al menos una parte de las microgotas (14) atrapadas,
realizándose las etapas del procedimiento en un único sistema microfluídico.
2. Procedimiento de manipulación en un sistema microfluídico de microgotas (14) que incluye unas muestras (16), que comprende las etapas que consisten en:
i) formar en un aceite unas microgotas (14) de una disolución acuosa que contiene una muestra (16), comprendiendo el aceite un agente gelificante,
ii) atrapar las microgotas (14) mediante trampas de tensión superficial (12) predispuestas en una zona de captura (10), y
iii) gelificar al menos una parte del aceite en la zona de captura (10).
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa iii) consiste en gelificar al menos una parte de las microgotas, comprendiendo además el procedimiento la etapa que consiste en:
iv) sustituir el aceite que rodea las microgotas (14) gelificadas por una disolución acuosa,
conteniendo preferentemente la disolución acuosa que sustituye el aceite una disolución bioquímica, comprendiendo la disolución bioquímica preferentemente al menos uno de entre uno o más tampones de pH o de salinidad, uno o más nutrimentos, uno o más factores de crecimiento, unas citoquinas, uno o más anticuerpos, uno o más antígenos, una o más moléculas, especialmente de medicamento, una o más células, unos lípidos, unos glúcidos, en particular en forma monomérica o de polisacáridos, unos aminoácidos y/o unas proteínas.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 o 3, que comprende una etapa v) posterior a la etapa iii), y preferentemente posterior a la etapa iv), que consiste en desgilificar al menos algunas de las microgotas (14) gelificadas en la etapa iii), comprendiendo el procedimiento preferentemente una etapa vi), posterior a la etapa v), que consiste en evacuar las microgotas (14) desgelificadas y/o las muestras (16) contenidas en estas microgotas (14) desgelificadas fuera de la zona de captura (10).
5. Procedimiento según la reivindicación 2, que comprende una etapa posterior a la etapa iii) que consiste en empujar fuera de la zona de captura las microgotas alrededor de las cuales no se ha gelificado el aceite.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra (16) es una de entre una o más células, especialmente un esferoide de células, una o más perlas que atrapan moléculas, siendo las perlas en particular de material plástico, y una o más moléculas.
7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa iii) se realiza después de la sedimentación de las muestras (16), especialmente de las células, en las microgotas (14) atrapadas, en particular después de la formación de esferoides o en el que la etapa iii) se realiza antes de la sedimentación de las muestras (16) en las microgotas (14) atrapadas.
8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la zona de captura está formada por un chip microfluídico (10) que comprende las trampas de tensión superficial (12).
9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa i) consiste en:
a) inyectar en una zona, aguas arriba de la zona de captura (10), una disolución acuosa que contiene unas muestras (16) y un agente gelificante, llegado el caso,
b) inyectar aceite, que contiene un agente gelificante, llegado el caso, en la zona aguas arriba de la zona de captura para empujar la disolución acuosa que contiene unas muestras (16) hacia una salida de la zona de
captura (10), realizándose la inyección de aceite a fin de formar unas microgotas (14) que contienen unas muestras (16), después
c) desplazar las microgotas (14) hasta el nivel de la zona de captura (10).
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las etapas i) y ii) se realizan simultáneamente en la zona de captura (10), realizando las acciones que consisten en:
- llenar la zona de captura (10) de disolución acuosa que contiene unas muestras (16) y un agente gelificante, llegado el caso, después en
- inyectar aceite, que contiene un agente gelificante, llegado el caso, en la zona de captura (10) para empujar la disolución acuosa que contiene unas muestras (16) hacia una salida de la zona de captura (10), estando configuradas las trampas de tensión superficial (12) para permitir la ruptura de las microgotas (14) que contienen unas muestras (16) a nivel de las trampas de tensión superficial (12).
11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa iii) consiste en al menos uno de entre:
- enfriar o calentar unas microgotas (14) y/o el aceite,
- inyectar una disolución que contiene un agente químico de gelificación en la zona de captura,
- someter las microgotas (14) y/o el aceite a una luz que provoca la gelificación, en particular una luz UV.
12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aceite contiene un agente surfactante, comprendiendo el procedimiento preferentemente una etapa de lavado del agente surfactante antes de la etapa iv).
13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una etapa, previa a la etapa i), de selección de la forma de las trampas de tensión superficial (12) en función de la forma deseada de las microgotas (14), preferentemente la zona de captura, y seleccionándose las trampas para:
- formar unas microgotas (14) atrapadas con un fondo plano, o
- formar unas microgotas (14) atrapadas con un fondo no plano, en particular curvo, preferentemente convexo.
14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una etapa de aplicación de un estímulo a las muestras (16) contenidas en al menos una parte de las microgotas (14) atrapadas, gelificadas o no.
15. Dispositivo para realizar un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1,3 y 4, o una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en combinación con al menos la reivindicación 1, que comprende:
- una disolución de hidrogel que contiene unas muestras (16),
- unos medios para formar unas microgotas (14) de disolución de hidrogel que contiene unas muestras (16), - una zona de captura, especialmente un chip microfluídico, para atrapar las microgotas (14) en sitios predeterminados, - unos medios de gelificación de una parte al menos de las microgotas (14) atrapadas, comprendiendo los medios de gelificación preferentemente un dispositivo de inyección de un agente químico en la zona de captura (10), y - opcionalmente, unos medios para desgelificar al menos algunas de las microgotas (14) de hidrogel gelificadas.
16. Dispositivo para realizar un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5, o una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en combinación con al menos la reivindicación 2, que comprende:
- medios para formar unas microgotas (14) que contienen unas muestras (16),
- una zona de captura, especialmente un chip microfluídico, para atrapar las microgotas (14) en sitios predeterminados, conteniendo la zona de captura un aceite que comprende un agente gelificante,
- medios de gelificación del aceite, comprendiendo los medos de gelificación preferentemente un dispositivo de inyección de un agente químico en la zona de captura (10), y
- opcionalmente unos medios para desgelificar al menos una parte del aceite gelificado.
17. Producto de microgotas gelificadas, que comprende una zona de captura de microgotas, en particular un chip microfluídico (10), y unas microgotas (14) gelificadas que incluyen cada una una muestra (16), atrapadas en la zona de captura (10),
siendo las microgotas (14) gelificadas crioconservadas, siendo las muestras (16) preferentemente unas células de mamíferos, por ejemplo unas células de mamíferos con la exclusión de células humanas, bacterias, levaduras u otras células utilizadas en bioprocesos, moléculas, perlas que atrapan unas moléculas en la superficie.
18. Producto de microgotas que comprende una zona de captura de microgotas que presenta una pluralidad de trampas de tensión superficial (12), en particular un chip microfluídico (10), y unas microgotas (14) que incluyen cada una una muestra (16), atrapadas en las trampas de tensión superficial (10),
bañando las microgotas (14) en un aceite gelificado, siendo las microgotas (14) y el aceite gelificado preferentemente crio-conservados,
siendo las muestras (16) preferentemente unas células de mamíferos, por ejemplo unas células de mamíferos con la exclusión de células humanas, bacterias, levaduras u otras células utilizadas en bioprocesos, moléculas, perlas que atrapan unas moléculas en la superficie.
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| PCT/FR2014/052655 WO2016059302A1 (fr) | 2014-10-17 | 2014-10-17 | Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons |
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