JP2023525357A - 臓器チップの凍結保存方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、３次元組織構造及び機能を有する臓器チップ（Ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）の凍結保存及び解凍方法に関する。さらに詳しくは、細胞及びハイドロゲルを含む微細チャンネル構造を有する臓器チップを凍結保存及び解凍するための方法に関し、凍結保存及び解凍の前後に３次元組織の構造及び機能を保持できるといった優れた効果を奏する。【選択図】図１
Description
本発明は、３次元組織構造及び機能を有する臓器チップ（Ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）の凍結保存及び解凍方法に関する。さらに詳しくは、細胞及びハイドロゲルを含む微細（ｍｉｃｒｏ）チャンネル構造を有する臓器チップを凍結保存及び解凍するための方法に関し、凍結保存及び解凍の前後に３次元組織の構造及び機能を保持することができるので、凍結された臓器チップを購入した最終使用者（ｅｎｄ ｕｓｅｒ）が解凍後に容易に用いることができる。
臓器チップ（Ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）は、小さいチップに特定の臓器を構成する細胞組織を培養することで、該当臓器の形態及び生理的特性を模写して所望の機能を実現する技術である。これを利用して特定の臓器の細胞組織の挙動及び微細環境における物理化学的反応のメカニズムを詳細に研究することができ、新薬開発の薬物毒性及び効能評価などのためのモデルとして利用できる。
単純な細胞または２次元構造の臓器チップの凍結保存及び解凍は、現在知られている方法を利用することができる。一般に、従来の細胞凍結は、細胞を酵素処理して凍結保存液中に細胞を分散させて浮遊状態にした後に行われ、浮遊細胞組織体であるオルガノイドまたはスフェロイドなどの凍結もまた同様の方法で行われる。凍結保存液中に浮遊状態で分散される場合、細胞の量に比べて十分に多い量の凍結保存液が含まれているので、熱伝達の側面で均一な伝達が可能になり、また比較的に技術的な考慮事項が少ないため、従来の細胞凍結方法を用いることができる（Ｈａｎ、Ｓｕｎｇ－Ｈｏｏｎ、ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２３．６（２０１７）：９６４；Ｈｅ、Ａｎｄｙ、ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｂａｎｋｉｎｇ １８．３（２０２０）：２２２－２２７；及びＣｌｉｎｔｏｎ、Ｊａｍｅｓ、ａｎｄ Ｐｅｎｎｅｙ ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓ－Ｋｏｅｐｐｅｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ８２．１（２０１９）：ｅ６６）。
しかしながら、前記浮遊細胞組織体とは異なり、３次元臓器組織の構造と機能を実現した臓器チップ（以下、「３次元臓器チップ」と称する）は、微細流体ベースで設計された細胞組織体によって臓器内に存在する細胞組織の構造と機能が模写されるため、技術的な考慮事項が多く、従来の一般的な凍結保存方法を適用することは困難である。
すなわち、熱伝達及び凍結保護剤の拡散伝達の側面において、前記浮遊細胞組織体は、熱及び保護剤の伝達が放射状の１次元現象で起こるのに対し、３次元臓器チップにおいては、複雑なチャンネル形状に沿って３次元で起こることになる。また、体内と類似した形態の３次元細胞培養が行われる３次元臓器チップの場合には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を利用するため、前記ＥＣＭが凍結及び解凍を経る過程で起こる膨張と収縮により、組織の内部に形成された細胞のネットワーク連結が切断され、細胞組織体の機能及び構造をそのまま維持することができない。よって、従来の細胞及び浮遊細胞組織体の凍結とは異なり、３次元臓器チップの凍結保存方法においては様々な技術的課題が考慮されなければならない。
前記浮遊細胞組織体において、組織の機能保存は組織体の大きさ、構成細胞の生存率、構成細胞のタンパク質の発現などによって評価されるのに対し、３次元臓器チップに形成される組織の機能は、細胞－細胞間接触及び結合力、組織の物質透過率、特定細胞の分極化（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）などが追加で評価される。そのような３次元臓器チップのみの組織機能は、人体内の薬物透過率、薬物効能及び毒性評価及び予測において極めて重要な指標であり、３次元臓器チップの凍結及び解凍の過程において、前記組織の構造及び機能を保持することは何より重要である。しかしながら、前記構造及び機能を保持できる臓器チップの凍結保存及び解凍方法は、未だ知られていない。
よって、本発明者らは、３次元臓器組織の凍結保存及び解凍以後にも凍結前に有していた臓器組織の構造及び機能を保持する方法を開発し、本発明を完成させるに至った。
Ｈａｎ、Ｓｕｎｇ－Ｈｏｏｎ、ｅｔ ａｌ．「Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｉｎｇ ｏｆ Ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．」Ｗｏｒｌｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２３．６（２０１７）：９６４
Ｈｅ、Ａｎｄｙ、ｅｔ ａｌ．「Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ：Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｖｉａｂｌｅ ｔｉｓｓｕｅ、ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ、ａｎｄ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｂａｎｋｉｎｇ １８．３（２０２０）：２２２－２２７
Ｃｌｉｎｔｏｎ、Ｊａｍｅｓ、ａｎｄ Ｐｅｎｎｅｙ ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓ－Ｋｏｅｐｐｅｎ．「Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ、ｅｘｐａｎｓｉｏｎ、ａｎｄ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｉｎ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．」Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ８２．１（２０１９）：ｅ６６
本発明は、特定の臓器または組織の構造と機能を実現した臓器チップを凍結保存する過程を経てから、それを凍結及び解凍させた後にも凍結前に有していた特定の臓器または組織の構造と機能をそのまま保全することで、実験室、研究所、製薬会社などで最終使用者（ｅｎｄ ｕｓｅｒ）が解凍後の臓器チップ（Ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）を容易に使用可能にすることを目的とする。
また、３次元臓器チップの組織機能において細胞－細胞間結合力、組織の物質透過率などを評価する代表的な指標であるＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値を凍結及び解凍後にも保存することを目的とする。
本発明は、細胞及びハイドロゲルを含む微細チャンネル構造の第２のチャンネルを有する臓器チップの組織部、及び細胞を含む微細チャンネル構造の第１のチャンネルを有する臓器チップの障壁部を含む臓器チップを製造するステップと、前記臓器チップの障壁部の有する微細チャンネルに凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｔｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む保存液を灌流させるステップと、前記臓器チップを冷蔵保存するステップと、前記臓器チップを冷却して凍結するステップとを含む臓器チップの凍結保存方法を提供する。
前記保存液を灌流させるステップは、微細チャンネル内に保存液を均一に分布させるために、前記第１のチャンネルに保存液を静水圧差を利用して一定時間にかけて流すステップと、側面チャンネルに保存液をピペットを利用して交換するステップとを含む。
前記臓器チップを冷蔵保存するステップは、微細チャンネル内に注入した保存液を３次元ハイドロゲルチャンネルである第２のチャンネルに均一に拡散させるために、一定時間にかけて冷蔵状態で保存するステップを含む。
本発明はまた、前記方法により凍結された臓器チップを解凍するステップを含む臓器チップの解凍方法を提供する。
本発明の凍結保存及び解凍方法は、凍結保存された３次元組織または臓器が解凍後にも凍結前の構造と機能を保持するようにして、実験室、研究所、製薬会社などで臓器チップを容易に使用可能にする。
特に、本発明の凍結保存及び解凍方法によって、２次元－３次元組織が結合されて作る組織障壁あるいは３次元組織障壁の構造及び機能が維持され、細胞及び組織障壁細胞の細胞生存率及び細胞機能が９０％以上維持され、組織の機能及び構造を維持するのに必要な受容体タンパク質などのタンパク質の発現が維持される。
また、本発明の凍結保存及び解凍方法は、凍結保存前の組織障壁の構造及び機能を保持させ、ＴＥＥＲ値及び透過性などを保全させて新薬の効能及び毒性などを評価するのに有用に活用できる。
以下、添付図面を参照して、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本願の実施形態及び実施例について詳しく説明する。しかしながら、本願は、様々な形態で実施され得るので、以下に説明する実施形態及び実施例に限定されるものではない。
本願明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」という場合、これは特に断らない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。
本発明は、細胞及びハイドロゲルを含む微細チャンネル構造の第２のチャンネルを有する臓器チップの組織部、及び細胞を含む微細チャンネル構造の第１のチャンネルを有する臓器チップの障壁部を含む臓器チップを製造するステップと、前記臓器チップの障壁部の有する微細チャンネルに凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む保存液を灌流させるステップと、前記臓器チップを冷蔵保存するステップと、前記臓器チップを冷却して凍結するステップとを含む臓器チップの凍結保存方法を提供する。
本願に用いられた「臓器チップ（Ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）」なる用語は、小さいチップに特定の臓器及び組織を構成する少なくとも１つの細胞を培養することで、該当臓器及び組織の形態及び生理的特性を模写して所望の構造または機能を実現できるように製作されたチップを意味する。
本願に用いられた「細胞」なる用語は、植物細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、バクテリア細胞及びかび細胞などを含む生物学的細胞を意味する。
本願に用いられた「ハイドロゲル」なる用語は、共有結合、水素結合、ｖａｎ ｄｅｒ ｗａａｌｓ結合または物理的な結合のような凝集力によって架橋された親水性高分子であって、水溶液上で多量の水を内部に含有して膨潤できる３次元高分子ネットワーク構造を有する物質を意味する。
本願に用いられた「微細チャンネル」または「微細チャンネル構造」なる用語は、流体が流れることができる微細な大きさのチャンネルであって、ミリメートル（ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒ）、マイクロメータ（ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ）またはナノメートル（ｎａｎｏｍｅｔｅｒ）の次元を有するチャンネルを含む構造を意味する。
本願に用いられた「保存液」または「凍結保存液」なる用語は、凍結保存剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）、及び凍結保存剤を組織と細胞へ伝達する運搬溶液（ｖｅｈｉｃｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを含む液体を意味するものであって、冷凍及び解凍過程で伴われる組織及び細胞の損傷を最小化するためのものを意味する。
本願に用いられた「凍結保護剤」なる用語は、凍結の際、水の結晶化現象による細胞の損傷を最小化するための添加剤を意味し、本願においては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、エチレングリコール（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）などを含み、これに制限されるものではない。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）が好ましく、ＤＭＳＯが最も好ましい。
前記保存液における凍結保護剤の濃度は、好ましくは３ｖ／ｖ％以上であってもよく、さらに好ましくは５ｖ／ｖ％以上であってもよく、最も好ましくは１０ｖ／ｖ％であってもよい。
一実施態様において、前記保存液は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をさらに含んでもよい。
一実施態様において、前記「臓器チップの障壁部」は、「第１のチャンネル」及び第２のチャンネルの側面に位置する微細チャンネル構造の「側面チャンネル」をさらに含んでもよい。
一実施態様において、前記「第１のチャンネル」は、組織障壁細胞を含んでもよい。前記組織障壁細胞は、血管内皮細胞；皮膚細胞；癌細胞；分泌腺細胞；筋肉細胞；及び気管支、大腸、小腸、膵臓または腎臓の上皮細胞を含んでもよい。
本願に用いられた「組織障壁細胞」なる用語は、組織の特定の構造を維持する役割をし、組織を外部刺激から保護する役割をする細胞を意味する。それだけでなく、組織障壁細胞間あるいは細胞外基質との強い結合力を利用して、選択的に物質を透過させ組織内の物質濃度が恒常性を維持する役割をする細胞を意味する。組織障壁細胞は上皮組織細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌ）及び血管内皮細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）を含む。
他の一実施態様において、前記臓器チップは、第１のチャンネルと第２のチャンネルとの間にスキャフォールド（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）をさらに含んでもよい。前記スキャフォールドと第２のチャンネルは互いに接触した形態または１０μｍ以下の間隔を有してもよい。
本願に用いられた「スキャフォールド」なる用語は、組織の構築及び細胞機能の制御のために人工的に作った細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）を意味する。好ましくは、前記スキャフォールドは、多孔性膜（ｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の構造を基盤とした細胞外マトリックスの主なタンパク質が含まれてもよいが、これに限定されるものではない。
一実施態様において、前記微細チャンネル構造の高さは１０μｍ～３ｍｍであってもよい。好ましくは、前記微細チャンネル構造の高さは１００～５００μｍであってもよい。さらに好ましくは、前記微細チャンネル構造の高さは２００～３００μｍであってもよい。
一実施態様において、前記微細チャンネル構造は、液剤の灌流を誘導及び調節できる入口及び出口を含んでもよい。前記灌流を誘導及び調節できる方法は、前記入口と出口の静水圧差（Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を利用する方法、外部ポンプを前記入口及び出口に連結する方法を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
前記保存液を灌流させるステップは、微細チャンネル内に保存液を均一に分布させるために、前記第１のチャンネルに保存液を静水圧差を利用して数分（例えば、１～５分）の間数回（例えば、２～３回）流すステップと、前記側面チャンネルに保存液をピペットを利用して数回（例えば、２～３回）交換するステップとを含む。
前記臓器チップを冷蔵保存するステップは、微細チャンネル内に注入した保存液が３次元ハイドロゲルチャンネルである第２のチャンネルに均一に拡散させるために、一定時間にかけて冷蔵状態で保存するステップを含む。前記冷蔵保存時間は、３０分未満であってもよく、好ましくは１０～２０分であってもよく、さらに好ましくは４℃で１５分であってもよい。
一実施態様において、前記ハイドロゲルは、７０％以上の水分を有してもよい。好ましくは、前記ハイドロゲルは、８０％以上の水分を有してもよい。
他の一実施態様において、前記ハイドロゲルは、コラーゲン、ラミニン、ヒアルロン酸、ミネラル、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチン、ペプチド、ポリエチレングリコール及びアルギネートで構成された群より選ばれる少なくとも１つのを含んでもよい。好ましくは、前記ハイドロゲルは、コラーゲンゲル、フィブリンゲル、ラミニンゲル、マトリゲル、動物由来腫瘍基底膜抽出物ゲル、組織脱細胞化細胞外マトリックスゲル、ペプチドゲル、ポリエチレングリコールゲルまたはアルギネートゲルであってもよいが、これらに限定されるものではない。
また他の一実施態様において、凍結の前後における前記ハイドロゲルの膨張及び収縮が２０％を超えなくてもよい。好ましくは、凍結の前後における前記ハイドロゲルの膨張及び収縮が１０％を超えなくてもよい。
一実施態様において、前記第２のチャンネルは内部組織細胞を含んでもよい。前記内部組織細胞は、星状細胞、周皮細胞、神経細胞、神経幹細胞、グリア細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、腸上皮細胞、角化細胞、皮膚線維芽細胞、足細胞及び糸球体内皮細胞で構成された群より選ばれる少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
本願に用いられた「内部組織細胞」なる用語は、人体の臓器及び組織を構成している細胞を意味し、上皮組織（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ）、筋肉組織（Ｍｕｓｃｌｅ ｔｉｓｓｕｅ）、神経組織（Ｎｅｒｖｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ）または結合組織（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ）を意味するが、これらに限定されることなく、人体組職をなしているすべての細胞が含まれる。
一実施態様において、前記第２のチャンネルは、細胞培養液または細胞懸濁液をさらに含んでもよい。ハイドロゲルに対して細胞培養液または細胞懸濁液は０．１～１の重量比で含まれてもよい。
一実施態様において、前記第２のチャンネルに含まれた細胞の濃度は１０5～１０7細胞／ｍＬであってもよく、前記第２のチャンネルに含まれた細胞の数は１０3～１０5個であってもよい。
一実施態様において、前記保存液を１～２００μＬ／ｍｉｎの流速で３０秒以上灌流させることができ、他の一実施態様において、前記保存液を室温で灌流させることができる。好ましくは、前記保存液を４～１０℃の温度で灌流させることができる。
他の一実施態様において、前記保存液は、成長因子、薬物、タンパク質及び核酸を含む可溶性因子、不溶性因子、及びナノ素材で構成された群より選ばれる少なくとも１つのを含んでもよい。
本願に用いられた「成長因子」なる用語は、細胞が分泌するサイトカイン、ホルモン、核酸などを含む細胞の成長、分裂、回復及び分化などの細胞活動を促進させる物質のことをいう。成長因子は、可溶性因子の一種類であって、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、インシュリン、成長ホルモンなどのように細胞分泌によって液状で広がることを意味する。
本願に用いられた「可溶性因子」なる用語は、細胞内部へ受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって吸収できる因子を意味する。
本願に用いられた「不溶性因子」なる用語は、細胞外マトリックス、細胞外マトリックス由来のペプチド、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）のように細胞に吸収されることなく、細胞を外部で刺激する因子を意味する。
本願に用いられた「ナノ素材」なる用語は、人工合成によって作られた約１００ｎｍの大きさ以下のナノパーティクル、リポソーム、グラフェンなどの物質を意味する。
一実施態様において、前記臓器チップの冷却は－８０℃に到達するまで０．５～５℃／ｍｉｎの速度で行われてもよい。好ましくは、前記臓器チップの冷却は－８０℃に到達するまで１～２℃／ｍｉｎの速度で行われてもよい。
他の一実施態様において、前記臓器チップを－８０℃まで冷却させた後、－８０℃に到達した前記臓器チップを液体窒素を用いて－１９６℃まで冷却させるステップをさらに含んでもよい。
本発明は、細胞及びハイドロゲルを含む微細チャンネル構造の第２のチャンネルを有する臓器チップの組織部、及び細胞を含む微細チャンネル構造の第１のチャンネルを有する臓器チップの障壁部を含む臓器チップを製造するステップと、前記臓器チップの障壁部の有する微細チャンネルに凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｔｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む保存液を灌流させるステップと、前記臓器チップを冷蔵保存するステップと、前記臓器チップを冷却して凍結するステップと、前記凍結された臓器チップを解凍するステップとを含む臓器チップの凍結及び解凍方法を提供する。
本願に用いられた「解凍液」なる用語は、解凍過程で添加されるものであって、解凍の際に伴われる細胞または組織の損傷を最小化するための溶液を意味する。
一実施態様において、前記臓器チップの解凍は３５～４０℃で行われてもよい。好ましくは、前記臓器チップの解凍は３７℃で行われてもよい。
一実施態様において、前記解凍液を３５～４０℃で８～３２μＬ／ｍｉｎの流速または２～８ｄｙｎｅ／ｃｍ2のせん断応力で３０秒以上灌流させてもよい。他の実施態様において、前記解凍液は、動物細胞培地；及び成長因子、薬物、タンパク質及び核酸を含む可溶性因子、不溶性因子及びナノ素材で構成された群より選ばれる少なくとも１つのを含んでもよい。
本発明は、凍結及び解凍の前後における臓器チップの透過率差が２０％以下であることを特徴とする臓器チップの凍結及び解凍方法を提供する。
本発明は、凍結及び解凍の前後における臓器チップのＴＥＥＲ値が８０％以上、好ましくは９０％以上維持されることを特徴とする臓器チップの凍結及び解凍方法を提供する。
本発明は、凍結及び解凍の前後における臓器チップの受容体タンパク質（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び細胞密着結合（Ｃｅｌｌ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）タンパク質の発現が維持されることを特徴とする臓器チップの凍結及び解凍方法を提供する。
本願に用いられた「微細流体素子（ｍｉｌｌｉｆｌｕｉｄｉｃ、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｏｒ ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）」なる用語は、有機高分子物質を含むプラスチック、ガラス、金属またはシリコンを含む多様な素材で製造された基板の上に流体が流れることができるように備えられた微細チャンネルなどを含んでいるチップを意味する。
本願に用いられた「培養液」または「細胞培養液」なる用語は、細胞の生育可能な溶液成分と環境を有する溶液を意味する。成分及び濃度は、細胞の性質に応じて設計され、一般的に市販されている各種細胞培養液をそのまま用いるか、または目的細胞の性質に応じて追加成分を添加して利用することができる。
以下、図面を参照して本発明の臓器チップについて詳しく説明する。本発明は、図１～８の形態で具体化された臓器チップを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の臓器チップは、臓器チップの障壁部１００と臓器チップの組織部２００を含む。
臓器チップの障壁部１００は、組織障壁細胞１１１を含む微細チャンネル構造の第１のチャンネル１１０を含む。また、臓器チップの組織部２００は、内部組織細胞２１１及びハイドロゲルを含む微細チャンネル構造の第２のチャンネル２１０を含む。
臓器チップの障壁部１００は、組織障壁細胞１１１を含む微細チャンネル構造の第１のチャンネル１１０及び第２のチャンネル２１０の側面に位置する微細チャンネル構造の側面チャンネル１２０を含んでもよい。
本発明の臓器チップは、第１のチャンネルと第２のチャンネルとの間にスキャフォールド１１２を含んでもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、下記の実施例は説明を目的とするものに過ぎず、本願発明の範囲を限定しようとする意図ではない。
［実施例１］
臓器チップの製造
本発明の臓器チップの第１のチャンネル及び第２のチャンネルにフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）をそれぞれ１０μＬ注入し、インキュベーターで１時間にかけて培養した。第１のチャンネル及び第２のチャンネルの細胞接着プロモータ（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を除去し、血管周囲細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）溶液１０7細胞／ｍＬを第２のチャンネルに注入した。チップをひっくり返したままインキュベーターで３時間にかけて培養し、次に、第２のチャンネルの培養液を除去した。星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）とハイドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）が１：９の体積比で混合された混合物１０7細胞／ｍＬを第２のチャンネルに注入し、次に、インキュベーターで３０分にかけて培養した。側面チャンネル及び第１のチャンネルに培養液を注入し、ウェルリザーバ（ｗｅｌｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）に培養液を充填して１日にかけて培養し、次に、第１のチャンネルに１０7細胞／ｍＬのヒト脳微小血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ；ｈＢＭＥＣ）溶液を注入した。インキュベーターで１時間培養し、次に、第１のチャンネルの培養液を交換して１日にかけて培養した。第１のチャンネル及び側面チャンネルの培養液を交換し、側面チャンネルにプラグを差し込んでから、第１のチャンネル注入口の一方はシリンジポンプ（ｓｙｒｉｎｇｅ ｐｕｍｐ）、他の一方は培養液タンクに連結して４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2で２４時間にかけて灌流培養した。
臓器チップの製造
本発明の臓器チップの第１のチャンネル及び第２のチャンネルにフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）をそれぞれ１０μＬ注入し、インキュベーターで１時間にかけて培養した。第１のチャンネル及び第２のチャンネルの細胞接着プロモータ（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を除去し、血管周囲細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）溶液１０7細胞／ｍＬを第２のチャンネルに注入した。チップをひっくり返したままインキュベーターで３時間にかけて培養し、次に、第２のチャンネルの培養液を除去した。星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）とハイドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）が１：９の体積比で混合された混合物１０7細胞／ｍＬを第２のチャンネルに注入し、次に、インキュベーターで３０分にかけて培養した。側面チャンネル及び第１のチャンネルに培養液を注入し、ウェルリザーバ（ｗｅｌｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）に培養液を充填して１日にかけて培養し、次に、第１のチャンネルに１０7細胞／ｍＬのヒト脳微小血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ；ｈＢＭＥＣ）溶液を注入した。インキュベーターで１時間培養し、次に、第１のチャンネルの培養液を交換して１日にかけて培養した。第１のチャンネル及び側面チャンネルの培養液を交換し、側面チャンネルにプラグを差し込んでから、第１のチャンネル注入口の一方はシリンジポンプ（ｓｙｒｉｎｇｅ ｐｕｍｐ）、他の一方は培養液タンクに連結して４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2で２４時間にかけて灌流培養した。
［実施例２］
臓器チップの凍結保存
実施例２の臓器チップからウェルリザーバの培養液を全て除去し、第１のチャンネル及び側面チャンネルを培養液で洗浄した。４～１０℃の凍結保存液（５０％の培養液、４０％のＦＢＳ、１０％のＤＭＳＯ）で側面チャンネルを２回洗浄した。第１のチャンネル両側注入口の培養液を除去し、凍結保存液３０μＬを注入口に投入して静水圧差で凍結保存液を流した（１分所要）。反対側注入口の保存液を除去し、凍結保存液３０μＬをさらに注入口に投入して静水圧差で凍結保存液を流した（１分所要）。チップをイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）が充填された凍結コンテナに入れて１５分にかけて４℃冷蔵保存し、次に、ディープフリーザー（－８０℃）に保存した。
臓器チップの凍結保存
実施例２の臓器チップからウェルリザーバの培養液を全て除去し、第１のチャンネル及び側面チャンネルを培養液で洗浄した。４～１０℃の凍結保存液（５０％の培養液、４０％のＦＢＳ、１０％のＤＭＳＯ）で側面チャンネルを２回洗浄した。第１のチャンネル両側注入口の培養液を除去し、凍結保存液３０μＬを注入口に投入して静水圧差で凍結保存液を流した（１分所要）。反対側注入口の保存液を除去し、凍結保存液３０μＬをさらに注入口に投入して静水圧差で凍結保存液を流した（１分所要）。チップをイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）が充填された凍結コンテナに入れて１５分にかけて４℃冷蔵保存し、次に、ディープフリーザー（－８０℃）に保存した。
［実施例３］
臓器チップの解凍
実施例３の臓器チップをディープフリーザーから取り出して恒温水槽（３７℃）に底が接触するように浸して１０分にかけて解凍し、次に、３７℃の培養液で側面チャンネルの培養液を２回交換した。第１のチャンネル両側注入口の保存液を除去し、３７℃の培養液３０μＬを注入口に投入して静水圧差で培養液を流した（１分所要）。反対側注入口の培養液を除去し、３７℃の培養液３０μＬをさらに注入口に投入して静水圧差で培養液を流した（１分所要）。ウェルリザーバに３７℃の培養液を充填して２４時間以上培養した。
臓器チップの解凍
実施例３の臓器チップをディープフリーザーから取り出して恒温水槽（３７℃）に底が接触するように浸して１０分にかけて解凍し、次に、３７℃の培養液で側面チャンネルの培養液を２回交換した。第１のチャンネル両側注入口の保存液を除去し、３７℃の培養液３０μＬを注入口に投入して静水圧差で培養液を流した（１分所要）。反対側注入口の培養液を除去し、３７℃の培養液３０μＬをさらに注入口に投入して静水圧差で培養液を流した（１分所要）。ウェルリザーバに３７℃の培養液を充填して２４時間以上培養した。
［実施例４］
凍結保護剤による組織機能の維持の確認
凍結保護剤の種類による組織機能の維持効果を確認するために、実施例２の凍結保存方法に応じて、凍結保護剤としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）及びエチレングリコール（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ＥＧ）をそれぞれ用いて実験を行い、ＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値を測定した。ＴＥＥＲ値は、３次元臓器チップの組織機能において細胞－細胞間結合力及び組織の物質透過率などを評価するための代表的な指標であり、凍結保存及び解凍後にも細胞が成長し続けることができるため、解凍後に２４時間培養した場合、ＴＥＥＲ値が維持されるか、あるいは増加する場合、優れた凍結保護剤として評価され得る。
凍結保護剤による組織機能の維持の確認
凍結保護剤の種類による組織機能の維持効果を確認するために、実施例２の凍結保存方法に応じて、凍結保護剤としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）及びエチレングリコール（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ＥＧ）をそれぞれ用いて実験を行い、ＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値を測定した。ＴＥＥＲ値は、３次元臓器チップの組織機能において細胞－細胞間結合力及び組織の物質透過率などを評価するための代表的な指標であり、凍結保存及び解凍後にも細胞が成長し続けることができるため、解凍後に２４時間培養した場合、ＴＥＥＲ値が維持されるか、あるいは増加する場合、優れた凍結保護剤として評価され得る。
ＴＥＥＲ値（ｏｈｍ／ｃｍ2）は、以下のように計算し、凍結前のＴＥＥＲ値を１にして凍結後のＴＥＥＲ値と比較評価した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）。
［細胞培養されたチップ－チップ（ｎｏ ｃｅｌｌ）］
［細胞培養されたチップ－チップ（ｎｏ ｃｅｌｌ）］
その実験結果を図９に示す。
図９に示すように、凍結保護剤としてＥＧを用いた場合、ＴＥＥＲ値が凍結前と比較してさらに低いことを確認し、本発明の凍結保護剤として適切でないことが分かる。
また、グリセロールは、ＴＥＥＲ値が凍結前と比較して同様に維持され、ＤＭＳＯはＴＥＥＲ値が上昇することを確認し、グリセロールとＤＭＳＯは、本発明の凍結保護剤として使用可能であり、ＤＭＳＯが最も優れた凍結保護剤であることが分かる。
［実施例５］
凍結保護剤（ＤＭＳＯ）及び冷蔵保存による組織機能の維持の確認
実施例２の凍結保存方法を用いて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の含量を異ならせて３次元組織機能維持効果を確認する実験を行った。また、４℃の冷蔵保存による３次元組織機能維持効果をさらに確認した。実施例４と同様の方法でＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値を測定し、その結果を図１０及び１１に示す。
凍結保護剤（ＤＭＳＯ）及び冷蔵保存による組織機能の維持の確認
実施例２の凍結保存方法を用いて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の含量を異ならせて３次元組織機能維持効果を確認する実験を行った。また、４℃の冷蔵保存による３次元組織機能維持効果をさらに確認した。実施例４と同様の方法でＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値を測定し、その結果を図１０及び１１に示す。
図１０に示すように、ＤＭＳＯの含量が３％の場合、ＴＥＥＲ値が凍結前と比較して同様に維持され、ＤＭＳＯの含量が５％及び１０％に増加することによってＴＥＥＲ値が上昇することを確認した。よって、ＤＭＳＯの含量が３％以上であると好ましく、５％以上であるとより好ましく、１０％であると最も好ましいことが分かる。
また、図１１に示すように、凍結保存前に１５分間冷蔵保存を行う場合、冷蔵保存を行わない場合よりＴＥＥＲ値が上昇することを確認した。しかしながら、凍結保存前に３０分間冷蔵保存を行う場合、むしろＴＥＥＲ値が減少することを確認した。よって、凍結保存前に冷蔵保存を３０分未満に行うことが好ましく、１５分間行うことがさらに好ましいことが分かる。
［実施例６］
臓器チップの凍結保存及び解凍によるハイドロゲルの膨張及び収縮の確認
実施例１～３による本発明の臓器チップの凍結保存及び解凍方法により、凍結保存及び解凍された臓器チップのハイドロゲルの膨張及び収縮を確認した。その結果を図１２に示す。
臓器チップの凍結保存及び解凍によるハイドロゲルの膨張及び収縮の確認
実施例１～３による本発明の臓器チップの凍結保存及び解凍方法により、凍結保存及び解凍された臓器チップのハイドロゲルの膨張及び収縮を確認した。その結果を図１２に示す。
図１２に示すように、本発明の臓器チップの凍結保存及び解凍方法による臓器チップの凍結前及び解凍後のハイドロゲルの膨張及び収縮の程度を比較したところ、凍結前と比較して解凍後のハイドロゲルが約１．４％水準で膨張したことを確認した。よって、本発明の凍結保存及び解凍方法による臓器チップは、凍結保存及び解凍後にも組織の構造が変形されることなく維持されることが分かる。
［実施例７］
臓器チップの凍結保存及び解凍によるタンパク質の発現の確認
実施例１～３による本発明の臓器チップの凍結保存及び解凍方法により、凍結保存及び解凍された臓器チップのタンパク質の発現及び細胞数を確認した。その結果を図１３～１５に示す。
臓器チップの凍結保存及び解凍によるタンパク質の発現の確認
実施例１～３による本発明の臓器チップの凍結保存及び解凍方法により、凍結保存及び解凍された臓器チップのタンパク質の発現及び細胞数を確認した。その結果を図１３～１５に示す。
図１３及び１４に示すように、本発明の臓器チップの凍結保存及び解凍方法による凍結前及び解凍後のタンパク質の発現を比較したところ、解凍後にもＺＯ－１、ＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＣＬＤＮ５を含む細胞連接タンパク質の発現、及び原子核（ｎｕｃｌｅｕｓ）の発現が凍結前と類似した水準で維持されることを確認した。
また、図１５に示すように、本発明の臓器チップの凍結保存及び解凍方法による凍結前及び解凍後のタンパク質の発現を比較したところ、解凍後にも３次元星状細胞のＧＦＡＰ及びＡＱＰ４の発現、及びｎｕｃｌｅｕｓの発現が凍結前と類似した水準で維持されることを確認した。
よって、本発明の凍結保存及び解凍方法による臓器チップは、凍結保存及び解凍後にも細胞数、組織の構造及び機能が維持されることが分かる。
１００ 臓器チップの障壁部
１１０ 第１のチャンネル
１１１ 組織障壁細胞
１１２ スキャフォールド
１２０ 側面チャンネル
２００ 臓器チップの組織部
２１０ 第２のチャンネル
２１１ 内部組織細胞
１１０ 第１のチャンネル
１１１ 組織障壁細胞
１１２ スキャフォールド
１２０ 側面チャンネル
２００ 臓器チップの組織部
２１０ 第２のチャンネル
２１１ 内部組織細胞
Claims (25)
- 細胞及びハイドロゲルを含む微細チャンネル構造の第２のチャンネルを有する臓器チップの組織部、及び細胞を含む微細チャンネル構造の第１のチャンネルを有する臓器チップの障壁部を含む臓器チップを製造するステップと、
前記臓器チップの障壁部の有する微細チャンネルに凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｔｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む保存液を灌流させるステップと、
前記臓器チップを冷蔵保存するステップと、
前記臓器チップを冷却して凍結するステップとを含む、臓器チップの凍結保存方法。 - 前記凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）であることを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）であることを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記保存液におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の濃度が３ｖ／ｖ％以上であることを特徴とする、請求項３に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記保存液におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の濃度が５ｖ／ｖ％以上であることを特徴とする、請求項３に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記保存液におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の濃度が１０ｖ／ｖ％であることを特徴とする、請求項３に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記臓器チップを３０分未満に冷蔵保存することを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記臓器チップを１０～２０分にかけて冷蔵保存することを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記臓器チップを４℃で１５分にかけて冷蔵保存することを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記保存液が、ウシ胎児血清をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記臓器チップの障壁部が、第２のチャンネルの側面に位置する微細チャンネル構造の側面チャンネルをさらに有することを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記第１のチャンネルが、組織障壁細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記組織障壁細胞が、血管内皮細胞；皮膚細胞；癌細胞；分泌腺細胞；筋肉細胞；及び気管支、大腸、小腸、膵臓または腎臓の上皮細胞を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記臓器チップが、第１のチャンネルと第２のチャンネルとの間にスキャフォールド（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記スキャフォールドと第２のチャンネルが互いに接触した形態または１０μｍ以下の間隔を有することを特徴とする、請求項１４に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記スキャフォールドが、多孔性膜（ｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の構造を有することを特徴とする、請求項１４に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記ハイドロゲルが、コラーゲンゲル、フィブリンゲル、ラミニンゲル、動物由来腫瘍基底膜抽出物ゲル、組織脱細胞化細胞外マトリックスゲル、ペプチドゲル、ポリエチレングリコールゲルまたはアルギネートゲルで構成された群より選ばれる少なくとも１つのを含むことを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 凍結の前後における前記ハイドロゲルの膨張及び収縮が２０％を超えないことを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 凍結の前後における前記ハイドロゲルの膨張及び収縮が１０％を超えないことを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記第２のチャンネルが、内部組織細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 前記内部組織細胞が、星状細胞、周皮細胞、神経細胞、神経幹細胞、グリア細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、腸上皮細胞、角化細胞、皮膚線維芽細胞、足細胞及び糸球体内皮細胞で構成された群より選ばれる少なくとも１つのであることを特徴とする、請求項２０に記載の臓器チップの凍結保存方法。
- 細胞及びハイドロゲルを含む微細チャンネル構造の第２のチャンネルを有する臓器チップの組織部、及び細胞を含む微細チャンネル構造の第１のチャンネルを有する臓器チップの障壁部を含む臓器チップを製造するステップと、
前記臓器チップの障壁部の有する微細チャンネルに凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｔｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む保存液を灌流させるステップと、
前記臓器チップを冷蔵保存するステップと、
前記臓器チップを冷却して凍結するステップと、
前記凍結された臓器チップを解凍するステップとを含む、臓器チップの凍結及び解凍方法。 - 凍結及び解凍の前後における臓器チップの透過率差が２０％以下であることを特徴とする、請求項２２に記載の臓器チップの凍結及び解凍方法。
- 凍結及び解凍の前後における臓器チップのＴＥＥＲ値が８０％以上に維持されることを特徴とする、請求項２２に記載の臓器チップの凍結及び解凍方法。
- 凍結及び解凍の前後における臓器チップの受容体タンパク質（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び細胞密着結合（ｃｅｌｌ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）タンパク質の発現が維持されることを特徴とする、請求項２２に記載の臓器チップの凍結及び解凍方法。
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