JP6329468B2 - 線維芽細胞のガラス化凍結保存方法 - Google Patents
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Description
ウシ血清を10容量%添加したL−Glutamineを含有するDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)中で培養されたマウス胚性線維芽細胞(初代培養後、2〜3回継代操作を行った継代培養細胞)をプラスチックシャーレ上からトリプシン処理によって回収した。回収された細胞の生存率をトリパンブルー染色によって測定したところ、95%以上であった。なお、回収された細胞は、シングルセルとコロニーが混在する状態であった。
(実施例1)
回収した上記マウス胚性線維芽細胞5×105個を下記前処理液中に1×105個/mlの細胞濃度で分散させた。この分散状態を室温環境下で3分間維持した。
エチレングリコール 10容量%
グリセリン 0.5容量%
DMEMを加えて総量が100容量%となるように調整した。
エチレングリコール 30容量%
グリセリン 0.5容量%
スクロース 500mM
DMEMを加えて総量が100容量%となるように調整した。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、前処理液のエチレングリコール濃度を7容量%とした以外は、実施例1と同様にして、実施例2の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、前処理液のエチレングリコール濃度を4容量%とした以外は、実施例1と同様にして、実施例3の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、前処理時の前処理液中で細胞の分散状態を維持する時間を30分とした以外は、実施例1と同様にして実施例4の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、ガラス化液のエチレングリコール濃度を20容量%とした以外は、実施例1と同様にして、実施例5の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、ガラス化液の組成のうちエチレングリコール30容量%にかえて、ジメチルスルホキシド30容量%とした以外は、実施例1と同様にして、実施例6の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、前処理液のエチレングリコール濃度を0容量%とした以外は、実施例1と同様にして、比較例1の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、前処理液のエチレングリコール濃度を14容量%とした以外は、実施例1と同様にして、比較例2の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、前処理液の組成について、エチレングリコールにかえて、プロピレングリコールを用いた以外は、実施例1と同様にして、比較例3の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、前処理液の組成について、エチレングリコールにかえて、トリプロピレングリコールを用いた以外は、実施例1と同様にして、比較例4の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、前処理工程を行った後に、ガラス化液として、前処理液をそのままガラス化液として用いて凍結保存することで比較例5の凍結操作を行った。
実施例1のガラス化凍結保存方法において、前処理工程を行わずにガラス化処理工程のみによって凍結保存した以外は、実施例1と同様にして、比較例6の凍結操作を行った。
リプロセル社のES/iPS細胞用凍結保存液をガラス化液として用いて、比較例6と同様に、前処理工程を行わずにガラス化処理工程のみによって凍結保存することで、比較例7の凍結操作を行った。
実施例1〜6と比較例1〜7のガラス化凍結保存方法によって凍結操作を行った細胞を液体窒素中で数日間保存した後に、以下の操作によりそれぞれ融解操作を行った。液体窒素中から凍結したマウス胚性線維芽細胞を含む凍結バイアルをとりだし、37℃に温調した培養液(ウシ血清を10%添加したL−Glutamineを含有するDMEM)1mlを凍結バイアル中に直接添加し、マイクロピペットでピペッティングした。ガラス化液が完全に融解した後に、凍結バイアル中の細胞分散液を37℃に温調した上記培養液9ml中に添加した。次いで、320×gで5分間遠心分離し、該線維芽細胞を沈降させ、上清の培養液を除いた。さらに、新たな上記培養液を添加し、該線維芽細胞を分散させた。
上記操作により得たマウス胚性線維芽細胞分散液の一部をとり、トリパンブルー染色により、血球計算盤上で該線維芽細胞の生存率を測定した。生存率は、全細胞数(上記操作により得た細胞分散液の細胞総数)に対する生細胞数の割合である。生存率の評価は、生存率80%以上を○、70%以上80%未満を△、70%未満を×とした。さらに、血球計算盤上で該線維芽細胞の細胞数をカウントすることで、上記操作により得た該線維芽細胞分散液中の細胞数を算出し、凍結操作に用いた該線維芽細胞数(5×105個)に対する回収率を算出した。回収率の評価は、回収率80%以上を○、60%以上80%未満を△、60%未満を×とした。これらの結果を表1に示す。
実施例1の凍結保存方法における凍結操作の際に、凍結バイアル中の温度降下の様子をチノー社製シース型熱電対(先端外径0.3mm)を用いて測定した。0℃から−150℃までの冷却速度は、500℃/minであった。
実施例1〜6と比較例1〜7のガラス化凍結保存方法によって凍結操作を行ったマウス胚性線維芽細胞を融解操作の後に、10mlの上記培養液を含むプラスチックシャーレ(100mmディッシュ)上で24時間培養後に細胞の形態を確認した。実施例1〜6のガラス化凍結保存方法によって凍結された細胞は、浮遊細胞が少なく、シャーレ上に細胞が接着する様子が観察された。一方で、比較例1〜7のガラス化凍結保存方法によって凍結された細胞は、浮遊細胞が多く、シャーレ上に接着した細胞が少なかった。
Claims (1)
- ガラス化液中で1×103個以上の単離した線維芽細胞を1〜1×106個/μlの細胞濃度で凍結保存するガラス化凍結保存方法であって、該線維芽細胞のコロニー又はシングルセルを、エチレングリコールを2〜12容量%含有する前処理液中に浸漬させて該細胞を分散し、その後前処理剤を除去し、次いで前処理液の耐凍剤濃度を超える濃度の耐凍剤を含有するガラス化液に浸漬させ、該細胞を分散した後に、ガラス化凍結することを特徴とする、線維芽細胞のガラス化凍結保存方法。
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