KR102045931B1 - 오가노이드의 동결방법 - Google Patents

오가노이드의 동결방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102045931B1
KR102045931B1 KR1020180039845A KR20180039845A KR102045931B1 KR 102045931 B1 KR102045931 B1 KR 102045931B1 KR 1020180039845 A KR1020180039845 A KR 1020180039845A KR 20180039845 A KR20180039845 A KR 20180039845A KR 102045931 B1 KR102045931 B1 KR 102045931B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
organoids
organoid
freezing
dimethyl sulfoxide
medium
Prior art date
Application number
KR1020180039845A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190116803A (ko
Inventor
유종만
최정규
한수정
Original Assignee
오가노이드사이언스 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 오가노이드사이언스 주식회사 filed Critical 오가노이드사이언스 주식회사
Priority to KR1020180039845A priority Critical patent/KR102045931B1/ko
Publication of KR20190116803A publication Critical patent/KR20190116803A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102045931B1 publication Critical patent/KR102045931B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C12N2500/62—DMSO
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은(a) 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 20분 이상 4 ∼ 10 ℃에서 정치하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 혼합물을 동결시키는 단계를 포함하는, 오가노이드(organoids)의 장기 보존을 위한 개선된 동결방법을 제공한다.

Description

오가노이드의 동결방법{Freezing method of organoids}
본 발명은 오가노이드(organoids)의 장기 보존을 위한 동결방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 오가노이드의 장기 보존을 위한 동결방법에 있어서, 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 소정의 시간 및 온도에서 정치한 다음, 동결(freezing)을 수행하는 것을 포함하는 오가노이드의 개선된 동결방법에 관한 것이다.
오가노이드는 대장, 소장, 위, 췌장, 간 등을 포함한 다양한 체내 기관에서 유래하며, 이들 내부에는 줄기세포가 포함되어 있어 세포체로 분화할 수 있는 집합체를 형성하므로, 통상 소형 유사 장기로 지칭된다. 체내 각 기관에서 유래한 오가노이드는 해당 기관과 매우 유사한 구조를 가지므로, 세포 및 동물실험을 대체할 수 있는 모델로 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 오가노이드로 세포 및 동물실험을 대체하거나 또는 오가노이드를 세포치료제와 재생의학에 적용하기 위해서는, 필요할 때마다 오가노이드를 효과적으로 동결보존(freezing 혹은 cryobanking)할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
재생의학이나 세포치료제 개발을 위한 오가노이드 연구는 대부분 배양 시스템의 개발에 집중되어 있으며, 시간적인 제약 없이 대량의 오가노이드를 사용할 수 있는 동결 보존시스템은 아직 확립되어 있지 않다. 오가노이드의 동결보존을 위한 방법으로서, 오가노이드를 우태혈청(fetal bovine serum) 및 10%의 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에 현탁시킨 후, 이를 동결시키는 방법이 알려져 있다(예를 들어, Chee Wai Chua et al., Culture of mouse prostate organoids, Protocol Exchange (2014), doi: 101038/protex2014037; Xiang Xue et al., In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors, Vis Exp (2013), No75, pp50210). 그러나, 종래에 알려진 동결방법에 따라 얻어진 오가노이드를 해동(thawing)하여 오가노이드를 재구성할 경우, 오가노이드의 세포 생존율(cell viability)가 약 30%에 불과한 문제점이 있다. 또한, 종래의 동결방법은 동결보호제로서 디메틸설폭시드를 10%의 농도로 사용하고 있으나, 소량의 디메틸설폭시드 농도일지라도 이를 세포에 처리하였을 때 독성이 야기될 수 있어 디메틸설폭시드의 농도를 낮출 수 있는 오가노이드의 동결방법 개발이 요구된다.
본 발명자들은 오가노이드를 높은 세포 생존율로 동결보존할 수 있는 방법으로서 디메틸설폭시드의 농도를 낮출 수 있는 개선된 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 오가노이드의 동결을 수행하기 전에 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 소정의 온도 및 시간 동안 정치한 다음 동결을 수행할 경우, 해동시 얻어지는 오가노이드의 세포 생존율을 75% 이상으로 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명에 따라 동결을 수행할 경우, 디메틸설폭시드의 농도를 종래의 농도에 비하여 절반으로 낮출 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 소정의 온도 및 시간 동안 정치한 다음 동결을 수행하는 것을 포함하는 오가노이드의 개선된 동결방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 20분 이상 4 ∼ 10 ℃에서 정치하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 혼합물을 동결시키는 단계를 포함하는, 오가노이드의 동결방법이 제공된다.
일 구현예에서, 단계(a)는 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 20분 ∼ 1시간 동안 4 ∼ 10 ℃에서 인큐베이션함으로써 바람직하게 수행될 수 있다.
본 발명의 동결방법에 있어서, 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중의 상기 우태혈청의 농도는 5 ∼ 20 v/v%의 범위일 수 있다. 또한, 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중의 상기 디메틸설폭시드의 농도는 3 ∼ 10 v/v%의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 약 5 v/v%일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 오가노이드는 마우스 장 상피 오가노이드 또는 인간 위 오가노이드일 수 있다.
오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 소정의 온도 및 시간 동안 정치한 다음 동결을 수행할 경우, 해동시 얻어지는 오가노이드의 세포 생존율을 75% 이상으로 현저하게 증가시킬 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 또한, 본 발명에 따라 동결을 수행할 경우, 디메틸설폭시드의 농도를 종래의 농도(10 v/v%)에 비하여 절반으로(약 5 v/v%) 낮출 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 동결방법은 오가노이드를 높은 세포 생존율로 동결보존할 수 있을 뿐만 아니라, 낮은 농도의 디메틸설폭시드의 사용을 가능하게 한다.
도 1은 상이한 디메틸설폭시드(DMSO) 농도 조건에서 동결시킨 마우스 소장 오가노이드의 특성을 분석한 결과를 나타낸다. 도 1a는 마우스 소장 오가노이드를 각각 5v/v%, 7,5v/v%, 및 10v/v% DMSO의 조건에서 동결시킨 후, 해동시킨 오가노이드의 현미경 사진이다. 도 1b는 해동 후 6일 동안 배양하였을 때 정상 오가노이드(budded-organoids)의 백분율을 나타낸다. 도 1c는 칼세인 AM 및 PI로 30분간 37℃에서 처리하여 얻어진 형광 이미지이다.
도 2는 본 발명에 따라 동결시킨 마우스 소장 오가노이드를 해동하여 배양한 후, 각각 실시간 qRT-PCR(도 2a) 및 면역세포화학 염색(도 2b: 콘트롤 오가노이드 및 도 2c: 해동된 오가노이드)에 의해 구성세포의 마커(lineage markers) 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 동결시킨 마우스 소장 오가노이드를 해동하여 배양한 후, CFTR 효능제 포스콜린 분석(CFTR agonist Forskolin assay)을 수행한 결과를 나타낸다. 도 3a는 해동된 마우스 소장 오가노이드에 포스콜린을 처리한 후, 40분까지 10분마다 현미경으로 측정한 결과이다. 도 3b는 포스콜린 처리 20분 후에 각각의 오가노이드 크기를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 5v/v% DMSO를 사용하여 동결시킨 마우스 소장 오가노이드를 해동하여 계대배양하면서, 각 계대에서 유전자 발현 분석 및 현미경 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
본 발명은 (a) 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 20분 이상 4 ∼ 10 ℃에서 정치하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 혼합물을 동결시키는 단계를 포함하는, 오가노이드의 동결방법을 제공한다.
본 발명의 동결방법은 대장, 소장, 위, 췌장, 간 등을 포함한 다양한 체내 기관에서 유래한 오가노이드에 적용될 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 소장 오가노이드는 공지의 방법에 따라 인간 또는 동물의 장 크립트(intestinal crypts) 또는 장 줄기세포(intestinal stem cells)로부터 얻어질 수 있고 또한 마트리겔 등에 삽입(embeded)하여 3차원 배양될 수 있다(Ootani, A. et al. Nat Med 15, 701-706, doi:10.1038/nm.1951 (2009), Sato, T. et al. Nature 459, 262-265, doi:10.1038/nature07935 (2009) 등). 상기 체외로 배출된 인간의 소장 또는 대장은 예를 들어, 각종 검사를 위해 위장관 내시경 등을 통하여 소장 또는 대장으로부터 배출된 생검 조직 등을 포함한다.
본 발명에 따른 동결방법의 단계(a)에 사용되는 배지는 각각의 오가노이드의 증식 또는 성장에 사용되는 공지의 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스 소장 오가노이드(Mouse Small Intestinal Organoid)의 배지로는 R-스포딘-1 컨디션드 배지(R-Spondin-1 conditioned medium)(HA-R-Spondin 1-Fc 293T 세포 유래, CultrexTM), mEGF (Peprotech), mNoggin (Peprotech), N2 (GibcoTM), B-27 (GibcoTM), N-아세틸시스테인으로 보충된 어드밴스드 DMEM/F12 (Advanced DMEM/F12)를 사용할 수 있다. 또한, 에서 배양하였다. 또한, 인간 위 오가노이드(Human Gastric Organoid)의 배지로는 R-스포딘-1 컨디션드 배지(HA-R-Spondin 1-Fc 293T 세포 유래, CultrexTM), mEGF (Peprotech), mNoggin (Peprotech), N2 (GibcoTM), B-27 (GibcoTM), FGF10 (ATGEN), [Leu] 15-가스트린 1, 니코틴아미드, Wnt-3A 컨디션드 배지(L Wnt-3A 세포주, ATCC, CRL-2647), A83-01, 및 Y-27632 (STEMCELL)로 보충된 어드밴스드 DMEM/F12 (Advanced DMEM/F12)를 사용할 수 있다.
오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 소정의 온도 및 시간 동안 정치한 다음 동결을 수행할 경우, 해동시 얻어지는 오가노이드의 세포 생존율을 75% 이상으로 현저하게 증가시킬 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 일 구현예에서, 단계(a)는 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 20분 ∼ 1시간 동안, 바람직하게는 약 30분 동안, 4 ∼ 10 ℃에서 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 동결방법에 있어서, 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중의 상기 우태혈청의 농도는 5 ∼ 20 v/v%의 범위, 바람직하게는 5 ∼ 10 v/v%의 범위, 더욱 바람직하게는 약 10 v/v%일 수 있다.
또한, 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중의 상기 디메틸설폭시드의 농도는 3 ∼ 10 v/v%의 범위일 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 동결을 수행할 경우, 디메틸설폭시드의 농도를 종래의 농도(10 v/v%)에 비하여 절반으로(약 5 v/v%) 낮출 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 바람직하게는 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중의 상기 디메틸설폭시드의 농도는 약 5 v/v%일 수 있다.
단계(b)는 단계(a)에서 얻어진 혼합물, 즉 오가노이드, 우태혈청, 디메틸설폭시드, 및 배지의 혼합물을 동결시킴으로써 수행된다. 상기 동결은 본 기술분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 단계(a)에서 얻어진 오가노이드, 우태혈청, 디메틸설폭시드, 및 배지의 혼합물을 동결용기(cryovials)로 옮기고, -80℃에서 1일 동안 저장함으로써 수행될 수 있다. 얻어진 동결된 오가노이드는 액체 질소(LN2) 탱크에 저장될 수 있다.
본 발명의 동결방법에 따라 동결된 오가노이드는 통상의 방법에 따라 해동(thawing)하여 세포 및 동물실험에 사용될 수 있다. 예를 들어, 동결된 오가노이드를 약 37℃ 수조(water bath)에서 해동시킬 수 있다. 해동된 오가노이드는 통상의 방법에 따라 마트리겔에 삽입시켜 증식 또는 성장 배지 중에서 배양될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 물질 및 시험방법
(1) 시험동물
본 연구는 차의과학대학교 동물실험윤리위원회(CHA University Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정 및 지침에 따라 승인 및 수행되었다. 웅성 C57Bl/6 마우스는 오리엔트 바이오(Orient Bio, 성남, 대한민국)로부터 구입하였으며, 12시간 명/암 주기로 사료와 물을 자유롭게 허용하면서 차의과학대학교의 동물시설에서 사육하였다.
(2) 마우스 소장 오가노이드 (Mouse Small Intestinal Organoid ) 성장 배지
마우스 소장 오가노이드는 10% R-스포딘-1 컨디션드 배지(R-Spondin-1 conditioned medium)(HA-R-Spondin 1-Fc 293T 세포 유래, CultrexTM), 50ng/ml mEGF (Peprotech), 100ng/ml mNoggin (Peprotech), 1X N2 (GibcoTM), 1X B-27 (GibcoTM), 1mM N-아세틸시스테인으로 보충된 어드밴스드 DMEM/F12 (Advanced DMEM/F12)에서 배양하였다.
(3) 인간 위 오가노이드 (Human Gastric Organoid ) 성장 배지
인간 위 오가노이드는 10% R-스포딘-1 컨디션드 배지(HA-R-Spondin 1-Fc 293T 세포 유래, CultrexTM), 50ng/ml mEGF (Peprotech), 100ng/ml mNoggin (Peprotech), 1X N2 (GibcoTM), 1X B-27 (GibcoTM), 200 ng/ml FGF10 (ATGEN), 10nM [Leu] 15-가스트린 1, 10mM 니코틴아미드, 50 % Wnt-3A 컨디션드 배지(L Wnt-3A 세포주, ATCC, CRL-2647), 5uM A83-01, 및 10uM Y-27632 (STEMCELL)로 보충된 어드밴스드 DMEM/F12 (Advanced DMEM/F12)에서 배양하였다.
(4) 마우스 소장 오가노이드의 제조
5-7 주령의 C57Bl/6 마우스를 치사시킨 후, 소장을 분리하였다. 소장을 십이지장으로부터 말단 회장(terminal ileum)까지 세로방향으로 자르고, 약 5 mm 길이 조각으로 가로방향으로 잘랐다. 얻어진 소장 조각을 얼음-냉각시킨 둘베코 인산완충식염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, DPBS)로 상층액이 충분히 맑아질 때까지 세척하였다. 이후, 젠틀 세포 분리 시약(Gentle Cell Dissociation Reagent)(StemCell Technologies, Cambridge, MA)으로 15분 동안 상기 조각을 처리하고, 분리 완충액(dissociation buffer)(DPBS 200ml 중 D-솔비톨 2 g 및 수크로오즈 2 g)을 사용하여 24회 피펫팅(vigorous pipetting)하여 크립트(crypts)를 분리한 다음, 70 ㎛ 세포 여과기(cell strainer)로 여과하였다. 분리된 크립트를 마트리겔(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)과 1:1의 비율로 혼합하고, 48-웰 플레이트 및 96-웰 플레이트에 넣었다. 상기 플레이트들을 가습 인큐베이터(5% CO2)에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지는 상기한 성장배지로 2일마다 교체하였다.
(5) 인간 위 오가노이드 (Human Gastric organoids )의 제조
인간 위(Human stomach) 2x2 cm2 수술 표본 샘플(surgical specimen sample)은 분당차병원으로부터 얻었다. 상기 표본은 비-염증 부위로부터 얻었으며, 조직은 1% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 얼음-냉각시킨 DMEM으로 세척하고, 수술용 가위 및 겸자(curved forceps)을 사용하여 작은 조각으로 세절하였다. 이후 세절된 조직은 오토글레이브 슬라이드 글라스(autoclaved slide glass)로 압착하여 위선(gastric glands)을 얻은 다음, DPBS에 용해시킨 5mM EDTA 완충액에 넣고 회전 교반기 상에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 위선(gastric glands)을 70 ㎛ 세포 여과기(cell strainer)로 여과하고, 4℃에서 150g로 10분 동안 원심분리하였다. 얻어진 인간 위선(Human Gastric Glands), 즉 인간 위 오가노이드를 마트리겔(Corning)과 1:1의 비율로 혼합하여 가습 인큐베이터(5% CO2)에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지는 상기한 성장배지로 2일마다 교체하였다.
(6) 오가노이드의 동결(freezing) 및 해동(thawing)
(6-1) 오가노이드의 동결
6일 동안 오가노이드를 배양한 후, 오가노이드가 삽입된(embeded) 마트리겔을 얼음-냉각시킨 DPBS로 파열(disrupt)시킨 후, 얼음 상에서 성장배지, FBS 및 DMSO의 혼합물 중에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 5v/v% DMSO 농도에 대해서는, 오가노이드를 85v/v% : 10v/v% : 5v/v% 비율의 성장배지, FBS 및 DMSO의 혼합물 중에서 인큐베이션하였다. 7.5v/v% DMSO 및 10v/v% DMSO 농도에 대해서는, 각각 82.5v/v% : 10v/v% : 7.5v/v% 및 80v/v% : 10v/v%: 10v/v% 비율의 성장배지, FBS 및 DMSO의 혼합물 중에서 인큐베이션하였다. 상기 30분 동안의 인큐베이션 후, 얻어진 혼합물(즉, 오가노이드, 성장배지, FBS, 및 DMSO의 혼합물)를 동결용기(cryovials)로 옮기고, -80℃에서 1일 동안 저장한 다음, 액체 질소(LN2) 탱크에 저장하였다.
(6-2) 오가노이드의 해동
동결된 오가노이드를 37℃ 수조(water bath)에서 신속하게 해동하였다. 이후 해동된 오가노이드를 30분 동안 배양 배지에서 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 오가노이드를 DPBS로 세척하고, 마트리겔과 1:1의 비율로 혼합하여 가습 인큐베이터(5% CO2)에서 37℃에서 성장 배지에서 배양하였으며, 초기 2일 동안은 Y-27632으로 보충된 성장배지에서 배양하였다.
(7) 시각화된 세포 생존율 분석
요오드화프로피디움(Propidium iodide)(Sigma) 및 칼세인 AM(calcein AM)(Invitrogen, C-1430을 해동된 오가노이드의 세포 생존율을 시각화하기 위하여 사용하였다. 오가노이드가 해동될 때, 요오드화프로피디움(1ug/ml) 및 칼세인 AM(5uM)을 30분 동안 37℃ 인큐베이터에서 처리하였다.
(8) 면역형광분석 ( Immunofluorescence )
배양 배지를 제거하고, 마트리겔 중의 오가노이드 및 콜라겐을 DPBS로 세척하였다. 마트리겔 및 콜라겐이 파괴될 때까지 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. PBS 완충액 중의 0.1% 트윈-20 및 0.2% 트리톤-X100을 사용하여 투과화(permeabilization)를 수행한 다음, DPBS 중의 5% BSA를 사용하여 비특이적 결합을 감소시켰다. 샘플을 4℃에서 1차 항체로 밤새 결합시켰다. 다음날, 샘플을 2차 항체로 실온에서 2시간 동안 결합시켰다. 염색을 위해 사용된 항체는 다음가 같다: Mucin 2(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Ki67 항체(Abcam, Cambridge, MA), Lgr5(Abgent, San Diego, CA), E-카드헤린(E-cadherin)(Santa Cruz Biotechnology), 크로모그라닌 A(Santa Cruz), 라이소자임(Diagnostic Biosystems, Fremont, CA), 및 Alexa Flour 488 컨쥬게이티드 항-토끼 IgG 및 Alexa Flour 594 컨쥬게이티드 항-마우스 IgG(Life Technologies, Gaithersburg, MD).
(9) 실시간 정량적 역전사 - 중합효소연쇄반응 분석(Real-time Quantitative Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction Analysis)
오가노이드가 삽입된 마트리겔을 세포 회복 용액(Cell Recovery Solution)(Corning Incorporated, Corning, NY)으로 처리하여 마트리겔을 제거하고, MagListoTM 5M Cell Total RNA Extraction Kit(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA 추출방법은 제조사 지침에 따라 수행하였다. PrimeScriptTM RT Master Mix (TaKaRa, RR036A)를 사용하여 cDNA를 합성하고, cDNA를 SYBR Premix Ex TaqTM II (TaKaRa, RR820A)와 혼합하여 정량적 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 수행하였다. Thermal Cycler DiceTM Real Time System III (Takara, Shiga, Japan)을 사용하여 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 데이터는 MRQ system (Takara)을 사용하여 분석하였다. 실시간 qRT-PCR을 위해 사용된 프라이머쌍은 다음 표 1과 같다.
qRT-PCR을 위한 마우스 및 인간 프라이머쌍
서열번호 서열
mGAPDH 서열번호 1 정방향 AACTTTGGCATTGTGGAAGG
서열번호 2 역방향 ACACATTGGGGGTAGGAACA
mE-cadherin 서열번호 3 정방향 ACCACTGCCCTCGTAATCGAA
서열번호 4 역방향 CGTCCTGCCAATCCTGATGAA
mLgr5 서열번호 5 정방향 GACGCTGGGTTATTTCAAGTTCAA
서열번호 6 역방향 CAGCCAGCTACCAAATAGGTGCTC
mMucin-2 서열번호 7 정방향 ATGCCCACCTCCTCAAAGAC
서열번호 8 역방향 GTAGTTTCCGTTGGAACAGTGAA
mLysozyme 서열번호 9 정방향 GAGACCGAAGCACCGACTATG
서열번호 10 역방향 CGGTTTTGACATTGTGTTCGC
mVillin-1 서열번호 11 정방향 GACGTTTTCACTGCCAATACCA
서열번호 12 역방향 CCCAAGGCCCTAGTGAAGTCTT
mChromogranin A 서열번호 13 정방향 AAGGTGATGAAGTGCGTCCT
서열번호 14 역방향 GGTGTCGCAGGATAGAGAGG
mKi67 서열번호 15 정방향 CCAGCTGCCTGTAGTGTCAA
서열번호 16 역방향 TCTTGAGGCTCGCCTTGATG
2. 시험결과
(1) 동결 및 해동에 따른 오가노이드의 생존율 분석
도 1은 상이한 DMSO 농도 조건에서 동결시킨 마우스 소장 오가노이드의 특성을 분석한 결과를 나타낸다. 마우스 소장 오가노이드를 각각 5v/v%, 7,5v/v%, 및 10v/v% DMSO의 조건에서 동결시킨 후, 해동시킨 오가노이드의 현미경 사진은 도 1a와 같다. 도 1a에서 "Control"은 동결/해동 과정을 거치지 않은 마우스 소장 오가노이드를 의미하며, 각각의 백분율은 DMSO 사용을 나타내고, DIV는 동결 보관 일수(Days in vitro)를 의미한다. 도 1b는 해동 후 6일 동안 배양하였을 때 정상 오가노이드(budded-organoids)의 백분율을 나타낸다. 도 1c는 칼세인 AM (5 μM, 살아있는 세포) 및 PI (1 ㎍/ml, 죽은 세포)로 30분간 37℃에서 처리하여 얻어진 형광 이미지이다. 도 1a 내지 도 1c의 결과로부터, 본 발명에 따라 우태혈청을 포함하는 성장배지 중에서 오가노이드를 30분 동안 인큐베이션한 후 동결시킬 경우, 이의 해동시 오가노이드의 생존율을 약 75% 이상으로 현저하게 높일 수 있음을 확인할 수 있다. 특히, DMSO를 5v/v%의 낮은 농도로 사용하더라도 10v/v% DMSO 사용과 비교가능한(comparable)한 생존율을 얻을 수 있으므로, DMSO 사용에 따른 오가노이드의 성질 변화를 최소화할 수 있을 것으로 기대된다.
(2) 오가노이드 구성세포의 마커 유전자 발현 분석
도 2는 5v/v% DMSO 농도 조건에서 동결시킨 마우스 소장 오가노이드를 해동하여 배양한 후, 각각 실시간 qRT-PCR (도 2a) 및 면역세포화학 염색(도 2b: 콘트롤 오가노이드 및 도 2c: 해동된 오가노이드)에 의해 구성세포의 마커(lineage markers) 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸다. 도 2a 내지 도 2c에서, 장내분비세포(enteroendocrince cells), 표피 세포(epithelial cells), 고블릿 세포(goblet cells), 파네트 세포(paneth cells), 상피 경계 세포(epithelium border cells), 및 장 줄기세포(intestinal stem cells)에 대한 마커는 각각 Chromogranin A (ChrgA), E-cadherin (Ecad), Mucin 2 (Muc2), Lyz (lysozyme), Vil1 (Villin 1), Lgr5, 및 Ki67이다. 도 2b 및 도 2c는 각각 콘트롤 오가노이드의 면역세포화학 염색 결과(도 2b) 및 5v/v% DMSO 농도 조건에서 동결한 후 해동한 오가노이드의 면역세포화학 염색 결과(도 2c)이다. 도 2a 내지 도 2c의 결과로부터, 본 발명에 따라 동결시킨 오가노이드는 구성 세포와 줄기세포의 특성을 유지하게 하는 유전자의 발현 정도가 유사함을 확인할 수 있다.
(3) 오가노이드의 기능 분석
도 3은 5v/v% DMSO 농도 조건에서 동결시킨 마우스 소장 오가노이드를 해동하여 배양한 후, CFTR 효능제 포스콜린 분석(CFTR agonist Forskolin assay)을 수행한 결과를 나타낸다. 해동된 마우스 소장 오가노이드에 포스콜린을 처리하여 상피세포의 이온 통로를 개방하여 오가노이드 내강으로 수분 유입을 유도한 후, 40분까지 10분마다 현미경으로 측정하였으며(도 3a), 포스콜린 처리 20분 후에 각각의 오가노이드 크기를 측정하였다(도 3b). 도 3a 및 도 3b의 결과로부터 각각의 그룹 사이에 유의성 있는 차이는 없음을 알 수 있으며, 따라서 본 발명에 따라 오가노이드를 동결시킨 후 해동하여 얻어진 오가노이드는 소장 오가노이드의 주요 특성인 상피세포 기능을 유지함을 확인할 수 있다.
(4) 해동된 마우스 소장 오가노이드의 계대배양에 따른 유전자 발현 분석
도 4는 5v/v% DMSO 농도 조건에서 동결시킨 마우스 소장 오가노이드를 해동하여 3계대까지 계대배양하면서, 각 계대에서 유전자 발현 분석 및 현미경 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 도 4에서, 장내분비세포(enteroendocrince cells), 표피 세포(epithelial cells), 고블릿 세포(goblet cells), 파네트 세포(paneth cells), 상피 경계 세포(epithelium border cells), 및 장 줄기세포소(intestinal stem cells)에 대한 마커는 각각 Chromogranin A (ChrgA), E-cadherin (Ecad), Mucin 2 (Muc2), Lyz (lysozyme), Vil1 (Villin 1), 및 Lgr5이다. 도 4의 결과로부터 모든 유전자 발현이 계대가 진행됨에 따라 대조군회복됨을 확인할 수 있다.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Freezing method of organoids <130> PN0848 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 aactttggca ttgtggaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 acacattggg ggtaggaaca 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 accactgccc tcgtaatcga a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cgtcctgcca atcctgatga a 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gacgctgggt tatttcaagt tcaa 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cagccagcta ccaaataggt gctc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 atgcccacct cctcaaagac 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gtagtttccg ttggaacagt gaa 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gagaccgaag caccgactat g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cggttttgac attgtgttcg c 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gacgttttca ctgccaatac ca 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 cccaaggccc tagtgaagtc tt 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 aaggtgatga agtgcgtcct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ggtgtcgcag gatagagagg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 ccagctgcct gtagtgtcaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 tcttgaggct cgccttgatg 20

Claims (6)

  1. (a) 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 20분 이상 4 ∼ 10 ℃에서 정치하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 혼합물을 동결시키는 단계를 포함하는, 오가노이드의 동결방법으로서, 상기 배지 중의 디메틸설폭시드의 농도가 5 v/v%인 것을 특징으로 하는 오가노이드의 동결방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계(a)가 오가노이드를 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중에서 20분 ∼ 1시간 동안 4 ∼ 10 ℃에서 인큐베이션함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 오가노이드의 동결방법.
  3. 제1항에 있어서, 우태혈청 및 디메틸설폭시드를 포함하는 배지 중의 상기 우태혈청의 농도가 5 ∼ 20 v/v%의 범위인 것을 특징으로 하는 오가노이드의 동결방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오가노이드가 마우스 장 상피 오가노이드 또는 인간 위 오가노이드인 것을 특징으로 하는 오가노이드의 동결방법.
KR1020180039845A 2018-04-05 2018-04-05 오가노이드의 동결방법 KR102045931B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180039845A KR102045931B1 (ko) 2018-04-05 2018-04-05 오가노이드의 동결방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180039845A KR102045931B1 (ko) 2018-04-05 2018-04-05 오가노이드의 동결방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190116803A KR20190116803A (ko) 2019-10-15
KR102045931B1 true KR102045931B1 (ko) 2019-11-18

Family

ID=68209224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180039845A KR102045931B1 (ko) 2018-04-05 2018-04-05 오가노이드의 동결방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102045931B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108103004A (zh) * 2017-12-20 2018-06-01 中国农业科学院特产研究所 一种梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法
CA3172280A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Mepsgen Co., Ltd. Cryopreservation method for organ-on-a-chip
CN116286653A (zh) * 2023-02-20 2023-06-23 徐州市中心医院 一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Vis. Exp. (75), e50210, doi:10.3791/50210 (2013)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190116803A (ko) 2019-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10983111B2 (en) Human trophoblast stem cells and uses thereof
KR102045931B1 (ko) 오가노이드의 동결방법
CN112080472B (zh) 一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3d模型的方法
JP6238445B2 (ja) 大腸上皮幹細胞の単離・培養技術と、これを用いた大腸上皮移植技術
Guzel et al. Understanding follicle growth in vitro: Are we getting closer to obtaining mature oocytes from in vitro‐grown follicles in human?
WO2017206837A1 (zh) 将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的小分子化合物组合、重编程方法及应用
US20100062477A1 (en) Methods of isolating and propagating stem cells from benign tumors
EP2716298A1 (en) A nod2-dependant pathway of cytoprotection of stem cells
KR102025474B1 (ko) 에티오나마이드를 이용한 줄기세포 이동성 향상 방법
EP1625213A2 (en) A method for efficient transfer of human blastocyst-derived stem cells (hbs cells) from a feeder-supported to a feeder-free culture system
CN111621465A (zh) 一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用
CN107022004B (zh) 一种靶向肿瘤细胞的多肽及其应用
KR20200056870A (ko) 3차원 오가노이드의 2차원 배양을 위한 배지 조성물 및 이의 용도
KR20180023640A (ko) 장 오가로이드 상태 및 rock 저해제 첨가시기의 복합처리를 통한 장 오가로이드의 효율적인 장기냉동동결보존방법
CN116286655A (zh) 一种适用于多种实体瘤类器官培养的培养基及其培养方法
KR20220162201A (ko) 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도
Hosoi et al. Production of mouse fibroblast growth factor 4 in E. coli and its application for isolation and maintenance of mouse trophoblast stem cells in vitro
CN107034190B (zh) 一种人胎盘部位滋养细胞肿瘤细胞系
CN114317398B (zh) Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用
EP2518141A1 (en) Stem cells derived from the carotid body and uses thereof
KR20190118702A (ko) 환자 유래 종양세포를 이용한 생체외 조직체 구조물 및 이의 제조방법
KR100883581B1 (ko) 안면피하 지방조직 또는 탯줄조직 유래 성체 줄기세포를이용한 간세포 분화방법 및 그에 사용되는 간세포분화배양액
Polstyanoy et al. Isolation of germ-cell precursors from human ovary tissue
Kozlowski Use of recombinant self-associating proteins for altering cellular fate and behavior
KR20170047041A (ko) Igfbp3 항체를 포함하는 표지물질을 이용한 돼지 정원줄기세포의 확인 및 동정 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
N231 Notification of change of applicant
GRNT Written decision to grant