CN116286653A - 一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法及应用 - Google Patents
一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法及应用，构建方法包括S1、配制唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基；S2、获取新鲜肿瘤标本，清洗后放入预冷的取材液中浸泡，低温下保存运输至实验室；S3、将标本进行切碎，低温离心后，取组织碎片沉淀进行解离消化，将获得的单细胞悬液进行离心，收集细胞沉淀；S4、将细胞沉淀与基质胶重悬，种板固化后加入培养基中进行培养，每2‑3天更换一次培养基，定期检测类器官污染并记录类器官生长状态，每10‑14天进行传代培养。本发明能够解决AciCC临床前模型较少的问题，解决现有技术中唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基及培养方法等问题，能够培养出高度保留患者来源唾液腺腺泡细胞癌肿瘤异质性的立体类器官。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法及应用。
背景技术
腺泡细胞癌（Acinic cell carcinoma，AciCC）是一种少见的低度恶性唾液腺肿瘤，AciCC占全部唾液腺上皮性肿瘤的2%～9%，占所有恶性唾液腺肿瘤的10%～17%，大多数AciCC为低度恶性，且常发生于腮腺，其次为下颌下腺和小唾液腺。AciCC多见于女性，男女发病率之比约为1:1.36。该肿瘤生长缓慢，实质性，可活动；少数肿瘤生长较快，与皮肤或肌组织粘连而不活动，可出现疼痛、面瘫。肉眼观察，肿瘤呈圆形或卵圆形，偶见结节状，质地较软，剖面多为实性，呈分叶状，褐色或红色，可见囊腔和坏死。AciCC主要治疗措施为手术切除，通常需要广泛切除，包括肿瘤边缘的次全切除，或保留面神经的全腮腺切除，必要时需作颈淋巴结清扫术。有文献利用细针吸取细胞学（FNAC）检查并制作细胞块的方法，提高了AciCC的术前确诊率。
AciCC在个体之间表现出实质性的遗传和表型异质性，这促使对个性化药物的需求。目前用于研究AciCC的临床前模型较少，未见文献报道建立关于AciCC的细胞系、体内动物模型，且体内动物模型建模周期长、成本较高、低度的恶性肿瘤建模成功率较低等不足，对高通量药物筛选和大量的基因分析具有一定限制性，这均严重阻碍了对AciCC发生发展的深入研究和创新型癌症治疗方法的研发。
而患者源性肿瘤类器官（patient-derived tumor organoid，PDTO）作为一种新兴的体外3D细胞培养技术，为临床前环境中的治疗方法的测试和开发开辟了新的途径。PDTO由患者来源的肿瘤组织组成，概括了原发性肿瘤的组织结构，并在体外长期扩张期间保持原始肿瘤的基因组变化。这些临床前模型对于更有效地将基础癌症研究转化为癌症患者的新治疗方案至关重要。目前，已有科研人员开始对PDTO进行高通量药物筛选，以测试对各种药物的体外敏感性，从而为临床应用的治疗方案提供依据。迄今获得的结果表明，在大多数情况下，PDTO体外反应可预测患者对治疗的反应，类器官技术具有预测患者反应的潜力，从而为个性化医疗带来了巨大的前景。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法及应用，唾液腺腺泡细胞癌类器官可稳定传代、长期冻存，同时保持遗传稳定性，能够解决AciCC临床前模型较少的问题，解决现有技术中唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基及培养方法等问题，实现培养出能够高度保留患者来源唾液腺腺泡细胞癌肿瘤异质性的立体类器官的目的。
技术方案：第一方面，本发明提供一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法，包括以下步骤：
S1、配制唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A，所述培养基A包括Advance DMEM/F12培养基和相关功能组分；
S2、获取新鲜肿瘤标本，清洗后将肿瘤标本放入预冷的取材液中浸泡，冰上或低温下保存运输至实验室；
S3、将步骤S2中所获得的标本进行切碎，低温离心后，取组织碎片沉淀通过解离酶Ⅰ和解离酶Ⅱ进行组织解离消化，将消化后获得的单细胞悬液进行离心，收集细胞沉淀；
S4、将步骤S3中收集的细胞沉淀与基质胶重悬，种板固化后加入培养基A中进行培养，每2-3天更换一次培养基A，定期检测类器官污染并记录类器官生长状态，每10-14天进行传代培养。
优选的，所述培养基A中相关功能组分在基础培养基DMEM/F12中的终浓度分别为：青霉素-链霉素-两性霉素溶液，0.5-2×；HEPES缓冲液，5-20 mmol/L；GlutaMAXTM，0.5-2×；N2补充剂，0.5-2×；B27补充剂，0.5-2×；Human FGF-10，5-20ng/mL；Human EGF，30-100ng/mL；重组Human R-Spodin-1蛋白，0.05-0.25μg/mL；重组Human Noggin蛋白，0.05-0.2μg/mL；重组Human Wnt-3A蛋白，0.05-0.2 μg/mL；N-乙酰半胱氨酸，0.5-2.5 mmol/L；烟酰胺，5-30 mmol/L；Prostaglandin E2，0.5-1.5 μmol/L；A83-01，0.2-1 μmol/L；Butylated hydroxyanisole，2-8ng/mL；Gastrin I，0 .01μmol/L；y-27632，5-20 μmol/L。
优选的，步骤S2中，所述取材液为含有20×青霉素-链霉素-两性霉素溶液的DMEM培养基。
优选的，步骤S3中，解离酶I由Ⅱ型胶原酶和DNaseⅠ以无血清的DMEM为溶剂配制而成，其中Ⅱ型胶原酶的终浓度为5mg/mL，DNaseⅠ的终浓度为10μg/mL；解离酶Ⅱ由胰蛋白酶-EDTA和DNaseⅠ配制而成，其中胰蛋白酶-EDTA占解离酶Ⅱ总体积的0.25%，DNaseⅠ的终浓度为10μg/mL。
优选的，步骤S3的具体操作为：
S31、取步骤S2中所获得的标本，用含5%青霉素-链霉素-两性霉素溶液的无菌PBS清洗，在无菌培养皿中加入适量取材液，将标本切碎，得到组织碎片；
S32、将组织碎片吸至无菌离心管中，低温离心得到组织碎片沉淀；
S33、在组织碎片沉淀中加入解离酶Ⅰ，上下吹打混匀，37℃恒温震荡消化，低温离心后弃上清；
S34、重复步骤S33，解离酶Ⅰ消化三次后，取离心沉淀，加入解离酶Ⅱ，上下吹打混匀，37℃恒温震荡消化；
S35、加入含10%血清的DMEM培养基混匀，终止消化，将所获得的单细胞悬液用细胞筛网进行过滤，低温离心后弃上清，得到细胞沉淀。
优选的，步骤S3还包括红细胞裂解，具体操作过程为：当细胞沉淀中出现较多红细胞时，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液后吹打混匀，于37℃恒温震荡，加入PBS溶液稀释终止裂解液作用，低温离心弃上清。
优选的，步骤S4中种板和培养的具体操作为：
S41、取步骤S3所获的细胞沉淀，加入步骤S1配制的培养基A，低温离心去上清；
S42、用基质胶重悬细胞沉淀并混匀，正置放在培养箱中培养至基质胶凝固，倒置至基质胶完全固化，使其形成圆顶状结构后，加入培养基A；
S43、每2-3天更换一次培养基A，镜下检测类器官污染及拍照记录类器官生长状态，正常类器官培养10-14天后，得到成熟类器官，进行传代培养、冻存、固定和鉴定。
优选的，所述传代培养的具体操作为：弃掉原培养基，加入预冷D-PBS溶液，机械破坏基质胶，移至离心管中低温离心，弃上清；加入解离酶Ⅱ重悬沉淀并混匀，37℃恒温震荡消化；加入含10%血清的DMEM培养基混匀终止消化，将所获得悬液用细胞筛网进行过滤，低温离心弃上清；后续进行种板和培养。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的构建方法在培养唾液腺腺泡细胞癌类器官中的应用。
有益效果：本发明针对唾液腺腺泡细胞癌的培养生长特点，选用了多种细胞因子成分，按照特定的比例进行复配，使所获得的培养基中含有适宜含量的细胞因子和信号通路调控因子，两者相互直接密切影响，协调配合，结合独特的解离酶和消化方法以及接种培养方法，最大程度保证活细胞的比例，从而加快类器官的扩增，缩短培养的时间，使得唾液腺腺泡细胞癌细胞在培养过程中能够更好地表现出其固有的活性特征，实现高度近似于真实唾液腺腺泡细胞癌细胞的综合特性，从而解决唾液腺腺泡细胞癌原代细胞难以培养、传代的问题；
本发明选用商品化产品，避免了传统肿瘤类器官培养所带来的成分误差，将选用的细胞因子通过倒置显微镜观察、HE染色、免疫组化和免疫荧光等技术验证，培养成熟的唾液腺腺泡细胞癌类器官可以在细胞形态、蛋白表达上高度保留原始唾液腺腺泡细胞癌的肿瘤异质性；
本发明的培养基具有可重复、成本低、可操作性强的特点，类器官培养到第5代、共培养76天，仍可以保持良好的增长扩增活性，经过多次传代培养的类器官依然保持固有的细胞形态，也仍能稳定表达其固有的活性特征，蛋白表达近似于原始肿瘤组织，高度保留了肿瘤异质性；可长期冻存，液氮中冻存3个月以上的原代唾液腺腺泡细胞癌类器官细胞复苏后仍可保持细胞活性并扩增形成类器官，并继续进行传代培养；
以本发明提供的唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基培养出能够高度保留患者来源唾液腺腺泡细胞癌肿瘤异质性的立体类器官，以此为基础进行药敏、放射学及免疫相关体外实验，一定程度上预测临床治疗方案的效果，选择最佳治疗方式，为实现个体化精准治疗提供有力的数据支持。
附图说明
图1为不同代次唾液腺腺泡细胞癌类器官培养至第7天的镜下影像，其中a为唾液腺腺泡细胞癌类器官原代培养至第7天的镜下影像，b为唾液腺腺泡细胞癌类器官传代后P2代培养至第7天的镜下影像，c为唾液腺腺泡细胞癌类器官传代后P3代唾液腺腺泡细胞癌类器官培养至第7天的镜下图像；
图2为不同代次唾液腺腺泡细胞癌类器官切片HE染色图像，其中a为原代唾液腺腺泡细胞癌类器官切片HE染色图像，b为P4代唾液腺腺泡细胞癌类器官切片HE染色图像，c为患者肿瘤样本切片HE染色图像；
图3为原代唾液腺腺泡细胞癌类器官切片进行蛋白表达CD117、claponin、CK7、P40、S100和细胞增殖指数Ki67表达的免疫组化图像；
图4为P4代唾液腺腺泡细胞癌类器官切片进行蛋白表达CD117、claponin、CK7、P40、S100和细胞增殖指数Ki67表达的免疫组化图像；
图5为患者肿瘤样本切片进行蛋白表达（CD117、claponin、CK7、P40、S100）和细胞增殖指数Ki67表达的免疫组化图像；
图6为包埋操作示意图，其中a为用封口膜包埋尖端示意图，b为用封口膜固定的包埋尖端。
实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明：
实施例
本实施例所用标本来源于临床患者，经过本医院医学伦理道德委员会批准立项。标本取自徐州市中心医院口腔科，一例71岁男性的腮腺腺泡细胞癌患者，术前结合临床表现、影像学检查及细针穿刺活检等辅助检查初步诊断，初步诊断为唾液腺腺泡细胞癌，术前经患者本人及家属充分知情同意后，签订知情同意书。术中快速病理及术后常规病理诊断为：腮腺腺泡细胞癌。
具体构建方法如下：
一、标本获取与处理
1.1患者肿物术中切除活检，切取约0.5cm*0.5cm*0.5cm大小，应取病变处或病变与正常组织交界处，避免肿瘤中心组织坏死区域；
1.2生理盐水冲洗三次后，浸泡于取材液中，浸泡1小时，冰上或低温运输至实验室，其中，取材液为含有20×青霉素-链霉素-两性霉素溶液的DMEM培养基（南京凯基生物科技）；
1.3病理示：低分化癌，倾向腺泡细胞癌；
1.4在生物安全柜中取出标本，用含5%青霉素-链霉素-两性霉素溶液的无菌PBS冲洗三次，在无菌培养皿（60mm*15mm）中加入适量取材液，使用无菌手术刀和组织剪将标本切碎至0.1*0.1*0.1cm大小，得到组织碎片，吸至无菌离心管中；
1.5低温离心：2000rpm，4℃，5min；弃上清，取组织碎片沉淀进行解离；
其中，唾液腺腺泡细胞癌处于口腔带菌环境，类器官培养过程中出现细菌、支原体乃至真菌污染的风险较高，在新鲜肿瘤标本切取后在预冷的含有20×青霉素-链霉素-两性霉素溶液的DMEM培养基中浸泡1小时并在其中切剪组织有利于降低后续培养中出现污染的风险。
二、组织碎片沉淀的解离消化
2.1解离酶配制：
解离酶I：由Ⅱ型胶原酶和DNaseⅠ以无血清的DMEM南京凯基生物科技）为溶剂配制而成，其中Ⅱ型胶原酶的终浓度为5mg/mL，DNaseⅠ的终浓度为10μg/mL；
解离酶Ⅱ：由胰蛋白酶-EDTA（1×）（ThermoFisher）和DNaseⅠ配制而成，其中胰蛋白酶-EDTA占解离酶Ⅱ总体积的0.25%，DNaseⅠ的终浓度为10μg/mL；
2.2取上述获得的组织碎片沉淀，加入5mL解离酶I，上下吹打几次使其混匀，置于37℃恒温水浴摇床中15min，其中摇床转速为300-400rpm，每5分钟吹打混匀一次；
2.3低温离心：2000rpm，4℃，5min；弃上清，再加入5mL解离酶I，条件同步骤2.2，共重复二次；
2.4解离酶I消化三次后，取离心沉淀，加入5mL解离酶Ⅱ，上下吹打几次使其混匀，置于37℃恒温水浴摇床中10min，其中摇床转速为300-400rpm，每5分钟吹打混匀一次；
2.5加5mL含10%血清的DMEM培养基混匀，终止消化；
2.6将获得的悬液依次使用100μm、70μm的细胞筛网（BD）进行过滤；
2.7低温离心：2000rpm，4℃，5min，弃上清；
2.8所获细胞沉淀中见较多红色沉淀（红细胞）时，在此环节选择加入3mL红细胞裂解液（Beyotime）吹打混匀，置于37℃恒温水浴摇床中5min，其中摇床转速为300-400rpm；
2.9加入12mL PBS溶液稀释终止裂解液作用，低温离心：2000rpm，4℃，5min，弃上清；
2.10加2mL唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A，轻轻吹打混匀。各相关功能组分在基础培养基DMEM/F12中的终浓度分别为：青霉素-链霉素-两性霉素溶液，1×；HEPES缓冲液，10mmol/L；GlutaMAXTM，1×；N2补充剂，1×；B27补充剂，1×；Human FGF-10，10ng/mL；Human EGF，50ng/mL；重组Human R-Spodin-1蛋白，0.15μg/mL；重组Human Noggin蛋白，0.1μg/mL；重组Human Wnt-3A蛋白，0.1 μg/mL；N-乙酰半胱氨酸，1.25mmol/L；烟酰胺，10mmol/L；Prostaglandin E2，1μmol/L；A83-01，0.5μmol/L；Butylated hydroxyanisole，5ng/mL；Gastrin I，0 .01μmol/L；y-27632（Rock抑制剂），10 μmol/L；
本实施例所采用的试剂：Human FGF-10，重组Human R-Spodin-1蛋白，重组HumanNoggin蛋白，重组Human Wnt-3A蛋白，N 乙酰半胱氨酸(N Acetylcysteine ，NAC)，A83 01和Gastrin I均购自MCE公司；Advance DMEM/F12基础培养基，HEPES缓冲液，GlutaMAXTM，B27补充剂和N2补充剂均购自ThermoFisher公司；烟酰胺(Nicotinamide)，ProstaglandinE2和Butylated hydroxyanisole均购自Sigma公司；y-27632（Rock抑制剂）购自Selleck公司；Human EGF购自Peprotech公司；青霉素-链霉素-两性霉素溶液购自Beyotime公司。
其中，由于唾液腺腺泡细胞癌位于口腔带菌环境，在其进行类器官培养过程中存在相对较高的污染风险，尤其是组织解离种板后的原代细胞，因此在解离消化后的原代肿瘤细胞种板后前三天所加的培养基中可以将青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的终浓度调整为2×，换液后若细胞状态正常，则恢复至1×继续培养。
本发明的培养基A针对于唾液腺腺泡细胞癌的培养生长特点选用了多种细胞因子成分，由于本实施例所使用的腺泡细胞癌肿瘤组织来源于人，因此所选用的细胞因子均为人源，同时均选用商品化产品，避免了传统肿瘤类器官培养过程中使用自行培育R Spondin1条件培养基及Wnt 3A条件培养基提供细胞因子所带来的成分误差。
三、类器官种板、培养
3.1取分装好300μL基质胶Matrigel（Corning）冰上解冻2h；
3.2在37℃培养箱中预热24孔板（NEST，非TC）；
3.3取所获细胞沉淀，加2mL唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A，轻轻吹打混匀；
3.4显微镜下细胞计数，取1.8*105个细胞的悬液；
3.5低温离心：2000rpm，4℃，5min，弃上清；
3.6使用预冷、去尖枪头取300μL解冻基质胶Matrigel重悬细胞沉淀并轻轻混匀，避免产生气泡，全程冰上操作；
3.7在37℃预热后的24孔板中每孔加入50μL悬浮细胞的基质胶，正置培养2min，至基质胶稍凝固后，倒置在培养箱中培养30min，使其形成圆顶状结构；
3.8基质胶完全固化后，每孔加入500μL唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A；
3.9每2-3天更换一次培养基A，镜下检测类器官污染及拍照记录类器官生长状态；
每日显微镜下检测类器官污染及拍照记录类器官生长状态，正常类器官培养至10-14天，镜下测量大多数球体直径达100μm左右标志着类器官成熟，可进行传代、冻存、固定及鉴定；如果镜下观察类器官形成球形结构，但生长缓慢，则培养期可再延长7-14天；
3.10换液：使用1000μL移液器小心弃掉原有培养基，每孔加入1000μL预冷D-PBS溶液轻柔荡洗后，移除并加入500μL新鲜培养基A，该过程动作需轻柔小心，切勿破坏基质凝胶。
四、传代
4.1使用1000μL移液器小心弃掉原有培养基，每孔加入1000μL预冷D-PBS溶液，并使用1000μL去尖枪头吹打数次，机械破坏基质胶，移至15mL离心管中；
4.2低温离心：2000rpm，4℃，5min，弃上清；
4.3加入5mL解离酶Ⅱ重悬沉淀并混匀，置于37℃恒温水浴摇床中5min，其中摇床转速为300-400rpm，每2-3分钟吹打混匀一次；
4.4加入5mL含10%血清的DMEM培养基混匀终止消化，将所获悬液依次通过100μm、70μm的细胞筛网进行过滤；
4.5低温离心：2000rpm，4℃，5min，弃上清；
4.6加入2mL唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A，轻轻吹打混匀，镜下计数，取所需细胞数的悬液进行种板传代；
4.7种板：步骤同唾液腺腺泡细胞癌类器官原代种板步骤；常用传代比例为24孔板中1：4-6，即一个孔中的原代唾液腺腺泡细胞癌类器官传代至新的24孔板中的4-6个孔中，具体传代比例根据实际细胞计数量设定；
4.8计算剩余悬液中细胞数量进行冻存，细胞冻存液配制：90% FBS胎牛血清+10%DMSO；
4.9低温离心：2000rpm，4℃，5min，弃上清；
4.10加入细胞冻存液重悬混匀移至冻存管中，1*105个细胞/mL/管，梯度冻存（4℃冰箱 5min→-20℃冰箱 30min→-80℃冰箱 过夜→液氮桶 长期冻存）。
本发明提出的唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A中各种细胞因子及调控因子相互影响，协调配合，结合独特的消化酶和消化方法以及接种培养方法，能够解决唾液腺腺泡细胞癌原代细胞难以培养、传代的问题，并通过倒置显微镜观察、HE染色、免疫组化、免疫荧光等技术验证，所培养成熟的唾液腺腺泡细胞癌类器官可以在细胞形态、蛋白表达上高度保留原始唾液腺腺泡细胞癌的肿瘤异质性；
本发明在解离消化肿瘤组织过程中，所使用的恒温消化、低温离心、轻柔吹打等操作均可在充分解离、获得单细胞悬液的同时，提高种板时活细胞的比例，从而加快类器官的扩增，缩短培养的时间；
本发明在种板后倒置培养板可以避免原代细胞在基质胶凝固前细胞沉底贴壁，并有利于基质胶与培养板的贴附；选用非TC培养板也可减少底层细胞优先贴壁生长，较TC培养板更有利于细胞3D生长成球。
五、复苏
5.1将冻存管在37℃水浴中解冻30-45 s；
5.2将细胞悬浮液转移到15mL离心管中；
5.3加入5mL含10%血清的DMEM培养基，混匀；
5.4低温离心：2000rpm，4℃，5min，弃上清；
5.5加入2mL唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A，混匀；
5.6低温离心：2000rpm，4℃，5min，弃上清；
5.7加入1mL唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A，混匀；
5.8取10μL细胞悬浮液，并与10μL 0.4%台盼蓝（染色死细胞）混合，进行细胞计数；
5.9用CountessTMII自动细胞计数器测定细胞密度和细胞活力（通过台盼蓝排斥试验），取所需细胞数的悬液进行种板；
5.10种板：步骤同唾液腺腺泡细胞癌类器官原代种板步骤。
六、镜下观察唾液腺腺泡细胞癌形态并拍照记录：
每日在倒置显微镜镜下检测不同代数唾液腺腺泡细胞癌类器官的污染及观察其生长形态，并摄图记录：
图1中a为唾液腺腺泡细胞癌类器官原代培养至第7天镜下影像：多数唾液腺腺泡细胞癌肿瘤干细胞呈球形生长；图1中b为唾液腺腺泡细胞癌类器官传代后P2代培养至第7天镜下影像；图1中c为传代后P3代唾液腺腺泡细胞癌类器官培养至第7天镜下图像；通过图1中a、b和c比对证明：传代后唾液腺腺泡细胞癌类器官生长速度及形态与原代类器官相似，无明显差异。
七、固定、包埋
7.1使用1000μL移液器小心弃掉原有培养基，每孔加入500μL预冷D-PBS溶液，并使用1000μL去尖枪头吹打数次，机械破坏基质胶，移至1.7mL离心管中；
7.2室温下500×g（在Eppendorf 5424R上为2300 rpm）离心3min，以使基质凝胶碎片形成沉淀，弃上清；
7.3加入1mL 4%多聚甲醛溶液，室温固定30min；
7.4室温下500×g（在Eppendorf 5424R上为2300 rpm）离心3min，弃上清；
7.5继续包埋，步骤7.4的细胞在4%多聚甲醛溶液中形成悬浮液，包埋前在4℃下最多储存1周；
7.6准备包埋的尖端，用封口膜裹住其底部（如图6中a所示）；
7.7将100mg琼脂糖加入含有10mL去离子水的烧杯中，微波加热1分钟，直至沸腾；
7.8确认琼脂糖已液化，放置1-2min；
7.9用50μL琼脂糖溶液重悬类器官球体，立即转移到由封口膜固定的包埋尖端中（如图6中b所示）；
7.10移至4℃，放置30min，待其凝胶固化；
7.11用一个新的包埋头轻轻地将含有包埋类器官的固化凝胶推出，放置组织盒中；
7.12将组织盒放入4%多聚甲醛溶液中，并在4℃下保存，直到通过常规组织学处理嵌入石蜡中，以制备石蜡块。
八、唾液腺腺泡细胞癌类器官的组织学鉴定
8.1将原代、P4代唾液腺腺泡细胞癌类器官培养至第7天后进行固定、包埋、切片，并取患者肿瘤组织切片（患者肿瘤样本切片取自徐州市中心医院病理科档案库），将所获得切片进行HE染色比对细胞形态，结果如图2所示：
图2中a为原代唾液腺腺泡细胞癌类器官切片HE染色图像；图2中b为P4代唾液腺腺泡细胞癌类器官切片HE染色图像；图2中c为患者肿瘤样本切片HE染色图像；比对结果显示：原代唾液腺腺泡细胞癌类器官细胞形态与来源肿瘤样本相似，且传代后仍可保留其形态。
8.2将上述获得的切片进行蛋白表达（CD117、claponin、CK7、P40、S100）和细胞增殖指数Ki67表达的免疫组织化学染色，结果如图3-图5所示：
图3为原代唾液腺腺泡细胞癌类器官切片免疫组化图像；图4为P4代唾液腺腺泡细胞癌类器官切片免疫组化图像；图5为患者肿瘤样本切片免疫组化图像。比对图3-图5结果显示：原代类器官蛋白表达和增殖指数表达水平与来源肿瘤样本相近，多次传代后仍可稳定表达。
目前培养到第5代，共培养76天，细胞仍可以保持良好的增长扩增活性，仍可以继续培养传代；本发明已证明，液氮中冻存3个月以上的原代唾液腺腺泡细胞癌类器官细胞复苏后仍可保持细胞活性并扩增形成类器官，并继续进行传代培养。本发明提供的唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A可以此为基础，进行药敏、放射学及免疫相关体外实验，一定程度上预测临床治疗方案的效果，选择最佳治疗方式，为实现个体化精准治疗提供有力的数据支持。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制唾液腺腺泡细胞癌类器官培养基A，所述培养基A包括Advance DMEM/F12培养基和相关功能组分；
S2、获取新鲜肿瘤标本，清洗后将肿瘤标本放入预冷的取材液中浸泡，冰上或低温下保存运输至实验室；
S3、将步骤S2中所获得的标本进行切碎，低温离心后，取组织碎片沉淀通过解离酶Ⅰ和解离酶Ⅱ进行组织解离消化，将消化后获得的单细胞悬液进行离心，收集细胞沉淀；
S4、将步骤S3中收集的细胞沉淀与基质胶重悬，种板固化后加入培养基A中进行培养，每2-3天更换一次培养基A，定期检测类器官污染并记录类器官生长状态，每10-14天进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法，其特征在于，所述培养基A中相关功能组分在基础培养基DMEM/F12中的终浓度分别为：青霉素-链霉素-两性霉素溶液，0.5-2×；HEPES缓冲液，5-20mmol/L；GlutaMAXTM，0.5-2×；N2补充剂，0.5-2×；B27补充剂，0.5-2×；Human FGF-10，5-20ng/mL；Human EGF，30-100ng/mL；重组Human R-Spodin-1蛋白，0.05-0.25μg/mL；重组Human Noggin蛋白，0.05-0.2μg/mL；重组Human Wnt-3A蛋白，0.05-0.2 μg/mL；N-乙酰半胱氨酸，0.5-2.5 mmol/L；烟酰胺，5-30mmol/L；Prostaglandin E2，0.5-1.5 μmol/L；A83-01，0.2-1 μmol/L；Butylatedhydroxyanisole，2-8ng/mL；Gastrin I，0 .01μmol/L；y-27632，5-20 μmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法，其特征在于：步骤S2中，所述取材液为含有20×青霉素-链霉素-两性霉素溶液的DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法，其特征在于：步骤S3中，解离酶I由Ⅱ型胶原酶和DNaseⅠ以无血清的DMEM为溶剂配制而成，其中Ⅱ型胶原酶的终浓度为5mg/mL，DNaseⅠ的终浓度为10μg/mL；解离酶Ⅱ由胰蛋白酶-EDTA和DNaseⅠ配制而成，其中胰蛋白酶-EDTA占解离酶Ⅱ总体积的0.25%，DNaseⅠ的终浓度为10μg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S3的具体操作为：
S31、取步骤S2中所获得的标本，用含5%青霉素-链霉素-两性霉素溶液的无菌PBS清洗，在无菌培养皿中加入适量取材液，将标本切碎，得到组织碎片；
S32、将组织碎片吸至无菌离心管中，低温离心得到组织碎片沉淀；
S33、在组织碎片沉淀中加入解离酶Ⅰ，上下吹打混匀，37℃恒温震荡消化，低温离心后弃上清；
S34、重复步骤S33，解离酶Ⅰ消化三次后，取离心沉淀，加入解离酶Ⅱ，上下吹打混匀，37℃恒温震荡消化；
S35、加入含10%血清的DMEM培养基混匀，终止消化，将所获得的单细胞悬液用细胞筛网进行过滤，低温离心后弃上清，得到细胞沉淀。
6.根据权利要求1所述的一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S3还包括红细胞裂解，具体操作过程为：当细胞沉淀中出现较多红细胞时，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液后吹打混匀，于37℃恒温震荡，加入PBS溶液稀释终止裂解液作用，低温离心弃上清。
7.根据权利要求1所述的一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S4中种板和培养的具体操作为：
S41、取步骤S3所获的细胞沉淀，加入步骤S1配制的培养基A，低温离心去上清；
S42、用基质胶重悬细胞沉淀并混匀，正置放在培养箱中培养至基质胶凝固，倒置至基质胶完全固化，使其形成圆顶状结构后，加入培养基A；
S43、每2-3天更换一次培养基A，镜下检测类器官污染及拍照记录类器官生长状态，正常类器官培养10-14天后，得到成熟类器官，进行传代培养、冻存、固定和鉴定。
8.根据权利要求1所述的一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法，其特征在于，所述传代培养的具体操作为：弃掉原培养基，加入预冷D-PBS溶液，机械破坏基质胶，移至离心管中低温离心，弃上清；加入解离酶Ⅱ重悬沉淀并混匀，37℃恒温震荡消化；加入含10%血清的DMEM培养基混匀终止消化，将所获得悬液用细胞筛网进行过滤，低温离心弃上清；后续进行种板和培养。
9.权利要求1-8任一项所述的构建方法在培养唾液腺腺泡细胞癌类器官中的应用。
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