CN105641743A - 一种微流控装置及利用该装置制备微凝胶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微流控装置及利用该装置制备载细胞微凝胶的方法。该方法包括：(1)以含有活细胞或生物活性分子、光固化剂和水凝胶预聚体的溶液作为内相；以含有油和表面活性剂的混合溶液作为中间相；以聚乙烯醇水溶液作为外相；(2)将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别输送至微流控装置的相应微通道中，形成单分散的水包油包水双乳液；(3)步骤(2)的所述单分散的水包油包水双乳液流经微流控装置的输出通道，收集在装有水性溶液的收集容器中，得固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶。实现了一步法固载细胞微凝胶的制备，对所得微凝胶尺寸可控，且尺寸分布窄，同时保持了细胞的存活率。

Description

一种微流控装置及利用该装置制备微凝胶的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及微流控装置以及利用该微流控装置制备载有活细胞或生物活性因子的微凝胶的制备方法。
背景技术
针对损伤或病变的人体组织或器官的修复，临床上的传统仍依赖于器官捐献。然而，移植人体组织短缺，有引发传染疾病等风险使得器官移植面临诸多问题。仅以美国为例，目前等待器官移植的患者每年超过74000例，而每年只有21000人能够得到移植手术。近年来，以组织工程和细胞治疗为手段的再生医学技术的诞生和发展，给器官修复重建带来了新的希望，并有望缓解器官捐献者短缺的实际问题。其中组织工程是应用工程学和生命科学的原理和方法，利用天然的和合成的成分构建提议恢复、维持或改善组织功能的医疗制品。目前组织工程技术已经相对成功的实现了包括皮肤、软骨等组织的修复并进入临床应用。然而，实现复杂结构的、三维(3D)空间工程化组织尚未生成。其中一个只要技术难题就是在大尺寸支架材料中的活体细胞，由于细胞间信号交换和营养物质交换受到限制，因此难以正常繁殖并组织化，因而导致组织缺损修复失败。
生物相容性的、可降解亲水性高分子材料构成的水凝胶可以模拟活体细胞的细胞外微环境，因此被大量用于细胞固载和组织工程方面的应用。然而被包埋在大尺寸水凝胶材料中的活体细胞的细胞间信号交换和营养物质交换都会受到限制。这是因为在微凝胶的交联高分子网络中，信号因子和营养物质的渗透速率和距离都受到限制。相对而言，微米尺度的微凝胶更使用于细胞的固载包埋和三维培养，因为微凝胶有利于物质交换并可对细胞外微环境形成更精确控制。因此，实现载细胞微凝胶的高通量制备将有利于推进组织工程和细胞治疗技术的发展和临床应用。
固载有活体细胞的微凝胶可作为基本单元用于构建细胞化的类组织结构，也可以作为药物控释载体用于细胞治疗技术。然而，如何精确控制微凝胶的尺寸和尺寸分布仍然是现有制备工艺技术难点，而这一参数不但会影响物质交换，更会直接影响被载细胞的行为。这需要我们开发新技术来实现对微凝胶性能参数的精确调控，同时保持被固载细胞存活率。
现有的可用于载细胞微凝胶的微加工技术包括光刻蚀技术[1]、微模板技术[2,3]等。这些技术都有各自的优势，例如可实现规模化生产、对微凝胶尺寸形貌精确控制等。然而，这些传统技术都是基于批量化的生产工艺，无法实现高通量的连续制备，且批次间产品性能存在差异。
微流控液滴技术的发展使精确控制不互溶多相流体成为可能，这一技术可实现连续进样，快速生产单分散性、可精确控制尺寸的微凝胶或微胶囊材料[4]。油包水(W/O)单乳液液滴技术可通过具有T型流道[5]或流体聚焦结构[6]的微流控装置制备，并且可作为模板、通过不同聚合方式制备单分散的微凝胶。然而，该方法不能实现连续的载细胞凝胶生成，而需要不间断的收集产物并破除乳液将细胞转移到生物相容性的水相溶液中，加工过程费时费力。并且，细胞长时间的暴露在油和表面活性剂中会影响细胞的活性[7]。因此，如何实现细胞在被固载入微凝胶并快速从油相中分离将大大有利于细胞活性的保存，并可实现连续制备，提高生产效率。
另外，水包水(W/W)乳液技术也可以实现微凝胶的制备[8,9]。该方法使用含水的两相流体，利用两相间不易共混可形成液滴，并以液滴作为模板，实现在水溶液中生产微凝胶微粒。该方法避免了额外的破除乳液的步骤，可实现一步法细胞包埋。然而，这一体系限于特定组合两种不混溶含水溶质，如葡聚糖和聚乙二醇，这限制了这一方法的广泛应用。
综上所述，尽管载细胞微凝胶技术在生物医学领域具有重要的应用价值，然而如何实现的细胞固载包埋与微凝胶，并同时维持细胞的存活率，仍然是这一领域重要的技术难题，必须开发出更简单、效率更高、可实现产业化生产的新技术。
已有技术存在的缺陷或问题：
1)光刻蚀技术、微模板技术、基于离心力的液滴：这些传统技术都是基于批量化的生产工艺，无法实现高通量的连续制备，且批次间产品性能存在差异。
2)水包油(W/O)单乳液液滴技术：该方法不能实现连续的载细胞凝胶生成，而需要不间断的收集产物并破除乳液将细胞转移到生物相容性的水相溶液中，加工过程费时费力。并且，细胞长时间的暴露在油和表面活性剂中会影响细胞的活性。
3)水包水(W/W)乳液技术：这一体系限于特定组合两种不混溶含水溶质，如葡聚糖和聚乙二醇，这限制了这一方法的广泛应用。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的一步法连续制备方法，同时提供用于制备所述微凝胶的微流控装置。
本发明是采用如下技术方案来实现的。
一种固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的一步法连续制备方法，包括如下步骤：
(1)以含有活细胞或生物活性分子、光固化剂和水凝胶预聚体的溶液作为内相；以含有油和表面活性剂的混合溶液作为中间相；以聚乙烯醇水溶液作为外相；
(2)将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别注入至微流控装置的相应微通道中，形成单分散的水包油包水双乳液；
(3)步骤(2)的所述单分散的水包油包水双乳液流经微流控装置的输出通道，收集在装有水性溶液的收集容器中，得固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶；
其中，在所述输出通道的出口端设置有激发水凝胶预聚体交联的装置；所述注入中间相的微通道内壁表面进行疏水处理；所述输出通道的内壁表面进行亲水处理；所述注入内相的微通道内壁表面进行亲水处理。
进一步地，在上述技术方案中，所述水凝胶预聚体在内相中的浓度为0.2-50w/v％，优选为w/v5-10％，更优选为8％w/v；光固化剂在内相中的浓度为0.25-2w/v％，优选为0.5-1w/v％，更优选为0.5w/v％。
进一步地，所述表面活性剂在中间相中的浓度为0.1-5v/v％，优选为0.5-1v/v％，更优选为0.5v/v％。
进一步地，在上述所有技术方案中，所述聚乙烯醇在聚乙烯醇水溶液中的浓度为1-20w/v％，优选为5-10w/v％，更优选为5w/v％。
进一步地，在上述所有技术方案中，所述的激发水凝胶预聚体交联的装置是紫外光源、设置在输出通道输出端外壁上的加热或制冷装置或输出通道内注入离子的离子注入装置中的一种。在上述技术方案中，所述步骤(2)的所述单分散的水包油包水双乳液，最内层为内相，所述单分散的水包油包水双乳液经过设置在输出通道出口端上的所述装置时，内相中的水凝胶预聚体可以快速交联，形成微凝胶。所述紫外光源可诱发光固化聚合物单体的交联，所述设置在输出通道输出端外壁上的加热或制冷装置可诱发温敏性聚合物单体的交联，所述输出通道内注入离子的离子注入装置诱发离子交联聚合物单体的交联。
进一步地，在上述所有技术方案中，在步骤(2)中，将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别以100-2000μLhr-1、100-2000μLhr-1和1000-20000μLhr-1的流速输送至微流控装置的相应微通道中，在出口处形成单分散的水包油包水双乳液。优选地，所述内相的流速与中间相的流速比为0.5:1～4:1，内相和中间相流速总和与外相的流速比为1:5～1:50。
进一步地，在上述所有技术方案中，所述的水凝胶预聚体为可光固化聚合物单体、可离子交联的聚合物单体、温敏性的聚合物单体或其他可实现快速交联固化的水凝胶预聚体中的一种。优选地，所述的可光固化聚合物单体为聚乙二醇双丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或二丙烯酸酯接枝的水溶性高分子中的一种；所述的可离子交联的聚合物单体为多糖类亲水性高分子海藻酸钠或壳聚糖中的一种；温敏性的聚合物单体为明胶、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或琼脂糖中的一种。
进一步地，在上述所有技术方案中，所述的细胞选自原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体；所述生物活性分子选自具有生物活性的药物、蛋白质和信号因子中的一种。其中，所述信号因子不仅限于蛋白，分子量大于1000Da的中分子或大分子药物都适用。分子比凝胶网络的孔隙率大会被限制在微凝胶内部即适用。
进一步地，在上述所有技术方案中，所述的光固化剂为1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮(Irgacure2959)、1-羟基己基苯基酮(Irgacure184)或安息香双甲醚(Irgacure651)中的一种。
进一步地，在上述所有技术方案中，所述的油为矿物油、植物油、橄榄油或氟化油中的一种。
进一步地，在上述所有技术方案中，所述的表面活性剂为Span20(山梨醇酐月桂酸酯)、Span40(山梨醇单棕榈酸酯)、Span80(失水山梨醇油酸酯)、Span83(倍半油酸山梨坦)、Span85(三油酸山梨坦)、Span120(失水山梨醇异硬脂酯)、Tween85(聚氧乙烯山梨醇三油酸酯)、G1086(聚氧乙烯山梨醇六油酸酯)、HB239(A块共聚物表面活性剂)、Monotane70(脱水山梨醇单异硬脂酸酯)、Brij96(聚氧乙烯(10)油基醚)、Brij92(聚氧乙烯(2)油基醚)等用于稳定水/碳化油界面的表面活性剂的一种，或是用于稳定水/氟化油界面的Krytox-PEG-Krytox表面活性剂。
进一步地，在上述所有技术方案中，所述的内相中活细胞浓度为1-107个/mL。
进一步地，在上述所有技术方案中，在步骤(3)中所述的水性溶液为去离子水、盐溶液或细胞培养基中的一种。
本发明的上述方法制备得到的微凝胶的直径为10-1000μm。所述微凝胶的粒径分布的离散系数在3％～10％。
本发明的上述方法制备得到的微凝胶可进一步组装得到具有宏观结构的载细胞支架，或作为可注射材料用于细胞的移植。
本发明通过上述技术方案，实现了一步法连续制备固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶，区别于现有技术。现有的固载活体细胞或生物分子药物的技术都是基于油包水单乳液技术，需要在油相中收集之后清除油相并转换到水相中，需要两步法操作，不能实现连续生产加工。同时，活体细胞在油相中受到油相、表面活性剂、光固化剂等成分的细胞毒性的影响而成活率逐渐降低，因此不适用于产业化批量生产。本发明通过微流芯片不共混的内相、中间相和外相依次混合：通过将水相为内相注入中间油相形成第一重乳液(单乳液)，再将该单乳液注入外相水溶液中形成水包油包水双乳液。通过调整内相和中间相流速比例控制第一重乳液的稳定形成，通过控制内相和中间相流速总和与外相流速比例，保证单分散的水包油包水双乳液稳定形成。双乳液液滴在毛细管微通道产生的毛细管力和同轴流体产生的拉力作用下最终形成超薄的油相壳层。油层越厚，稳定性更强，难以实现油水分离。本发明形成的双乳液液滴具有超薄油层，在内相固化形成微凝胶并在大量水性溶液中收集导致超薄油层在界面润滑系数改变和表面活性剂被水相稀释作用下，而难以维持稳定的界面并发生去湿化(Dewetting)，导致油相在凝胶表面团聚并由于密度差异在浮力作用下自动分离脱落，可直接将微凝胶收集在水性溶液中，使细胞在乳液中停留时间只有几分钟，并且通过收集相水溶液可直接稀释掉有细胞毒性的成分。实现一步法、连续的生产载细胞微凝胶，适于产业化大批量生产。
一种用于制备固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的微流控装置，包括第一微通道、第二微通道、第三微通道、输出通道、紫外光源和收集容器，所述第一微通道、第二微通道和第三微通道分别具有送样端和插入端，所述第二微通道的插入端从第一微通道的送样端非密封地插入于第一微通道中；第三微通道的插入端从第二微通道的送样端非密封地插入于第二微通道中，形成套管；输出通道的一端从第一微通道的插入端非密封地插入于第一微通道中，与第一微通道内的套管端口非端到端连接，输出通道的另一端与收集容器相连，在第一微通道的插入端与收集容器之间的输出通道上设置有紫外光源。
进一步地，所述的微流控装置中，所述的第二微通道的插入端的端口为锥形端口，所述的第三微通道的插入端的端口为锥形端口，所述的输出通道的插入于第一微通道的一端的端口为锥形端口。第二微通道以及第三微通道的插入端设计成锥形端口，增加流体的阻力和剪切力，从而使液滴更容易形成。
进一步地，所述的第二微通道的插入端端口的直径为5-1000μm，所述的第三微通道的插入端端口的直径为5-1000μm，所述的输出通道的插入于第一微通道的一端的端口的直径为10-2000μm。
进一步地，所述的微流控装置中，在所述套管中，第三微通道插入端的端口不超出且第二微通道的插入端端口，两端口之间距离大于1mm。这样的配置，保证在内相水凝胶预聚体水溶液注入中间油相溶液时首先形成油包水的单乳液。
进一步地，所述的微流控装置中，所述的第一微通道、第二微通道和第三微通道的送样端分别与微蠕动泵或微注射器相连，以实现自动进样。
进一步地，所述的微流控装置中，在所述第一微通道内，所述套管的端口与输出通道的端口的距离为50～500μm。这样的配置，保证在套管中形成的单乳液在注入外相水溶液时，输出端口的流体阻力保持稳定且各相同性，从而使外相流体对单乳液流体产生的剪切力保持稳定，有利于双乳液液滴形成过程的稳定性，且保证形成液滴具有良好的单分散性。
进一步地，所述的微流控装置中，所述第一微通道插入端连接有排气口。
进一步地，所述的微流控装置中，第一微通道内壁表面进行亲水处理，所述第二微通道内壁表面进行疏水处理，所述第三微通道内壁表面进行亲水处理，所述输出微通道内壁表面进行亲水处理。
本发明的上述微流控装置，在实际应用中，所述的紫外光源可由设置在输出通道输出端外壁上的加热或制冷装置，或输出通道内注入离子的离子注入装置来代替。
本发明的微流控装置中，微通道通过套管结构的设计保证内相水溶液与中间油相共混时形成稳定的单乳液，再进一步与外相水溶液共混时形成稳定的双乳液；同时各相流体注入微通道的流速保持稳定，因此液滴在形成时所受到的毛细管作用力和流体拉力始终保持稳定，故液滴形成过程始终保持稳定、液滴尺寸具有良好的单分散性。
采用本发明的微流控装置制备本发明所述的微凝胶时，所述的外相通过第一微通道注入，所述的中间相通过第二微通道注入，所述的内相通过第三微通道注入。所述的微流控装置具有三个微通道，其中第三微通道插入于第二微通道形成套管，套管再插入于第一微通道，这样，当内相、中间相和外相的液体输送至各自的微通道时，形成内外层同心轴流体，这样的设置可以保证内相水溶液从第三通道注入中间相第二通道时所受到的流体阻力保持稳定且各向同性，从而使外相流体对单乳液流体产生的剪切力保持稳定，有利于双乳液液滴形成过程的稳定性，且保证形成液滴具有良好的单分散性。
如上所述，本发明提供一个简单而有效的方法制备载有细胞或生物活性分子的微凝胶的技术方案，该技术方案利用微流控装置制备具有超薄壳层的核壳结构双乳液，并以双乳液为模板制备单分散性的载细胞微凝胶。具体为，采用毛细管微流控装置，实现由中间油相包围内相预聚物水溶液的同轴流体，由于两相的不共混而形成第一重油包水乳液，随后将该单乳液注入到连续外相水溶液中，由于乳液与外相不共混而形成水包油包水双乳液。由于在本发明设计的毛细管微流装置中，具有套管结构的微通道设计结合各相流体注入微通道时流速稳定，导致液滴形成时所受的毛细管作用和流体拉力保持稳定，保证双乳液液滴形成过程的稳定性，且形成液滴具有良好的单分散性。在紫外线照射中，最内层预聚物溶液发生交联固化，实现对悬浮细胞的三维包裹。进一步将产物溶液直接收集在由细胞缓冲液或培养基组成的水相中，油相壳层在界面润滑系数改变和表面活性剂被收集水溶液稀释的共同作用下，而难以维持稳定的界面并发生去湿化(Dewetting)，导致油相在凝胶表面团聚并由于密度差异在浮力作用下自动分离脱落，可直接将微凝胶收集在水性溶液中，最终得到分散在水溶液中的固体微凝胶微粒。
本发明的有益效果：
1.本发明提供一种制备固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶，该方法：1)实现了一步法固载细胞细胞微凝胶的制备，2)保持了细胞的存活率，3)对所得微凝胶尺寸可控，切尺寸分布窄、单分散，4)制备过程降低了油相和表面活性剂的用量，5)微凝胶可以作为细胞三维生长的细胞外基质，支持细胞的生长繁殖，6)微凝胶可进一步组装得到具有宏观结构的载细胞支架，或作为可注射材料用于细胞的移植。
2.本发明还提供微流控装置以及利用该微流控装置制备固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的方法，具体有益效果为：利用流体聚焦设计实现内外层同心轴流体的构建，再通过外相剪切得到水包油包水双乳液，通过控制油相和水相的流速可实现超薄壳层的双乳液液滴；在微流芯片上直接外加紫外光辐照，从而实现水凝胶预聚体的在位聚合/交联反应；通过直接将输出样品收集在水相溶液中，实现快速的油水分离从而得到微凝胶直接分散在水相溶液中的产物。
附图说明
图1是本发明的微流控装置结构示意图
图2A为在图1中a-a'线上的剖视图，图2B为收集容器。
图3为本发明所述以超薄壳层双乳液为模板一步法制备微凝胶的工作原理示意图；
图4是本发明所述方法中的微流控装置制备微凝胶显微照片；
图5是本发明所述方法中微流控装置制备的超薄壳层双乳液液滴的荧光显微镜照片；
图6是本发明所述方法中微流控装置制备的超薄壳层双乳液液滴经过交联后油相自动团聚成小油滴附着在微凝胶表面的荧光显微镜照片；
图7是本发明所述方法中微流控装置制备的超薄壳层双乳液液滴经过交联后油相自动团聚成小油滴后从微凝胶表面脱落，形成微凝胶的荧光显微镜照片；
图8是本发明所述方法中微流控装置制备的超薄壳层双乳液液滴经过交联后油相自动团聚成小油滴后从微凝胶表面脱落，形成自动分离的水相和油相两相液体的样品照片和显微照片；
图9是本发明所述方法中微流控装置制备的微凝胶微粒的尺寸和尺寸分布；
图10是本发明所述方法中的微流控装置制备载细胞微凝胶的显微照片；
图11是本发明所述方法中制备的载细胞微凝胶的显微照片，其中荧光标记的为活体细胞；
图12是本发明所述方法中制备的载细胞微凝胶的正交三维成像显微照片，其中荧光标记的为活体细胞；
图13是本发明所述方法中制备的载细胞微凝胶的尺寸和尺寸分布；
图14是本发明所述方法中经过本方法制备过程与传统单乳液方法制备过程后的细胞存活率对比；
图15是本发明所述方法中活体细胞经过本方法制备过程后的细胞存活率；
图16是本发明所述方法中活体MDCK内皮细胞在被固载于微凝胶内部后的增殖情况，并最终形成类组织细胞球；
图17是本发明所述方法中制备的活体MDCK内皮细胞在微凝胶中生长一周后形成类组织细胞球的正交三维成像显微照片，其中荧光标记的为活体细胞；
图18是本发明所述方法中活体MDCK内皮细胞在微凝胶中生长形成细胞团的尺寸随三维培养时间的变化；
图19是本发明所述方法中活体NIH/3T3成纤维细胞在被固载于微凝胶内部后的生长、增殖随时间变化的荧光显微照片，其中荧光标记的为活体细胞；
图20是本发明所述方法中活体NIH/3T3成纤维细胞在被固载于微凝胶内部后的生长、增殖对时间变化的三维重建纤维照片，其中荧光标记的为活体细胞；
图21是本发明所述方法中活体NIH/3T3成纤维细胞在微凝胶中生长、增殖并使微凝胶颗粒缩小的过程；
附图标号：1、第一微通道，2、第二微通道，3、第三微通道，4、输出通道，5、紫外光辐照，6、收集容器，7、基台，11、第一微通道的送样端，12、第一微通道插入端上的排气口，21、第二微通道的送样端，22、第二微通道的插入端，31、第三微通道的送样端，32、第三微通道的插入端，41、输出通道与收集容器的连接口，8、内相溶液，9、中间相溶液，81、分散于内相溶液中的细胞，10、外相溶液，13、载有细胞的微凝胶微粒，14、收集水溶液，15、分离的油相，16、水凝胶预聚体水溶液，17、超薄油层，18、团聚的油滴、19、微凝胶微粒，20、分离的油滴，25、浮于油水界面的油滴，26、水相中单分散性的微凝胶颗粒，a、具有超薄油层的双乳液液滴，b、油相在微凝胶表面聚集，c、油滴与微凝胶分离
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
实施例1
下面结合附图通过实施例对本发明所述以超薄壳层的核壳结构双乳液为模板制备单分散性的载细胞微凝胶的方法做进一步说明。
如图1所述，一种微流控装置，包括第一微通道、第二微通道、第三微通道、输出通道、紫外光源和收集容器，所述第一微通道、第二微通道和第三微通道分别具有送样端和插入端，所述第二微通道的插入端从第一微通道的送样端处向插入端非密封地插入于第一微通道中；第三微通道的插入端从第二微通道的送样端处向插入端非密封地插入于第二微通道中，形成套管；输出通道的一端从第一微通道的插入端处向送样端非密封地插入于第一微通道中，与第一微通道内的套管端口非端到端连接，输出通道的另一端与收集容器相连，在第一微通道插入端与收集容器之间的输出通道上设置有紫外光源；该装置可以固定于基台，便于使用。
其中所述的第二微通道的插入端的端口为锥形端口，所述的第三微通道的插入端的端口为锥形端口，所述的输出通道的插入于第一微通道的一端的端口为锥形端口；
在所述套管中，第三微通道插入端的端口不超出且不对齐于第二微通道的插入端端口，第三微通道插入端的端口与第二微通道的插入端端口之间的距离为10mm；
所述的第一微通道、第二微通道和第三微通道的送样端处分别与微蠕动泵或微注射器相连，以实现自动进样；
在所述第一微通道内，所述套管的端口与输出通道的端口的距离为200μm。
在第一微通道插入端上设置有排气口，用于在流体首次注入芯片时将芯片中气体排出。
该微流控装置中，第一微通道为内经均一(内径为1.05μm)的方形AIT玻璃毛细管，使用聚乙二醇对毛细管内壁进行亲水处理。第二微通道为内径均一(内径为560μm)的AIT玻璃毛细管，其插入端的端口为锥形端口，端口内径为50μm，使用三甲氧基硅烷(Aldrich公司)对毛细管内壁进行疏水处理，并用乙醇洗涤后干燥。第三微通道为内径均一(内径为350μm)的AIT玻璃毛细管，其插入端的端口为锥形端口，端口内径为10μm，使用聚乙二醇对毛细管内壁进行亲水处理。输出通道为内径均一(内径为560μm)的AIT玻璃毛细管，插入于第一微通道的一端的端口为锥形端口，端口内径为100μm，使用2-[甲氧基(聚亚)丙基]三甲氧基硅烷(Gelest公司)对毛细管内壁进行亲水处理。
实施例2
利用实施例1所述的微流控装置，制备微凝胶的方法，包括如下步骤:
(1)配置内相、中间相和外相溶液：
内相溶液的配置：在常温、常压下将聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和光固化剂(1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮)溶解在去离子水中，溶液中PEGDA最终浓度为10w/v％，光固化剂的浓度为1w/v％。
中间相溶液的配制：中间相为油和表面活性剂的混合溶液，将Span80表面活性剂溶液加入矿物油中，使其在矿物油中浓度0.5v/v％。
外相溶液的配置：将聚乙烯醇(PVA)溶于去离子水中，最终质量浓度为5％。
(2)制备水包油包水双乳液：以流速500μLhr-1将内相溶液注入第三微通道、以流速500μLhr-1将中间相溶液注入第二微通道、以流速15000μLhr-1将外相水溶液注入第一微通道，内相与中间相流速比为1：1，内相与中间相流速与外相流速比例为1：15。这样的流速设置确保形成单分散的水包油包水双乳液，形成具有超薄壳层的、核-壳结构的微液滴(图4)。内相(含水预聚物溶液)通过内径最小的第三微通道注入，以形成最内层液滴，而中间相(油相)通过中间的第二微通道注入，由于第二微通道内壁进行了疏水性处理，因此两种不混溶流体的同时注射时可形成同轴流体。根据Reighlay不稳定性原理，不共混两相最终形成油包水的第一重乳液。外相(PVA水溶液)通过最外层的第一微通道注入。从而在将该单乳液注入到连续外相水溶液时，由于乳液与外相不共混而形成水包油包水的双乳液。由于在本发明设计的毛细管微流装置中，微通道的尺寸一致、且流速保持稳定，因此在毛细管作用和流体拉力的作用下形成单分散的双乳液液滴(图5)。形成的双乳液液滴流入输出通道，在输出通道出口处放置紫外光源，诱发双乳液液滴最内层的光交联水凝胶预聚体发生交联、聚合，在液滴内部形成微凝胶的核。通过调节流速液滴尺寸可在10-500μm范围调控。
图5中外侧a层为外相水层，中间b层为中间油层，最内侧的c层为内相水凝胶预聚体水溶液。
(3)收集微凝胶：在没有表面活性剂的去离子水中收集步骤(2)得到的微凝胶，由于油相壳层在界面润滑系数改变，且表面活性剂被收集水溶液稀释的共同作用下，而难以维持稳定的界面并发生去湿化(Dewetting)，导致油相团聚成一个油滴附着在微凝胶表面(如图6)。图6中a表示外相水溶液，b表示原油相壳层发生去湿化而团聚成油滴，c表示光固化的微凝胶。这样微凝胶迅速、直接的分散在收集水溶液中，避免了二次清洗、破除乳液的步骤。由于矿物油的密度小于水，附着在微凝胶微粒表面的油滴在浮力作用下与凝胶微粒分离(如图7)，并浮于水溶液表面，形成清洗的油水界面(如图8)。该方法可实现单分散性的微凝胶颗粒的批量生产(如图8)。
图9是上述方法制备得到的微凝胶微粒的尺寸和尺寸分布，图9的结果可见最终得到的微凝胶平均粒径为87μm，粒径分布窄，离散系数为3％。
实施例3
利用实施例1所述的微流控装置，制备再有活体细胞微凝胶的方法，包括如下步骤:
(1)配置内相、中间相和外相溶液：
内相溶液的配置：在常温、常压下将甲基丙烯酸酯接枝明胶和光固化剂(1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮)，溶解于细胞培养基中，得水凝胶预聚体溶液。其中细胞培养基是Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Sigma-Aldrich公司)，加有10％v/v的胎牛血清(FBS，Gibco公司)。将体外培养、扩增后的活体细胞分散在细胞培养基中，加入上述水凝胶预聚体溶液，使得最终溶液中细胞浓度在1×106个细胞/ml，甲基丙烯酸酯接枝明胶浓度为10w/v％，光固化剂浓度为1w/v％。
中间相溶液的配制：中间相为油和表面活性剂的混合溶液，将Krytox-PEG-Krytox表面活性剂加入氟化油(HFE7500)中，得到表面活性剂最终质量浓度为0.5％的油相溶液。
外相溶液的配置：将聚乙烯醇(PVA)溶于去离子水中，最终质量浓度为5％。
(2)制备水包油包水双乳液：按照实施例1的方法得到微流控装置，装置微流控通道以及其他部件用75％乙醇和100％的乙醇依次清洗，然后使用紫外灯(λ～254纳米，120分钟)杀菌消毒。
以流速1000μLhr-1将内相溶液注入第三微通道、以流速1000μLhr-1将中间相注入第二微通道溶液、以流速15000μLhr-1将外相水溶液注入第一微通道，内相与中间相流速比为1：1，内相与中间相流速和与外相流速比例为2：15。这样的流速设置确保形成单分散的水包油包水双乳液，形成具有超薄壳层的、核-壳结构的微液滴(图2)。内相(含细胞水预聚物溶液)通过内径最小的第三微通道注入，以形成最内层液滴，而中间相(油相)通过中间的第二微通道注入，由于第二微通道内壁进行了疏水性处理，因此两种不混溶流体的同时注射时可形成同轴流体。外相(PVA水溶液)通过最外层的第一微通道注入。向微流控装置同时注入各相流体，得到具有单分散性、超薄油层的水包油包水双乳液液滴(图10)。图10中可见细胞被包裹在凝胶中。形成的双乳液液滴流入输出通道，在输出通道出口处放置紫外光源，诱发双乳液液滴最内层的光交联水凝胶预聚体发生交联、聚合，从而实现细胞的固载(如图11)。图11中，荧光标记的为活体细胞。。
(3)收集微凝胶：使用细胞培养基作为收集微凝胶的水溶液，由于油相中表面活性剂被水相稀释，使超薄油层不再稳定包裹在微凝胶的表面，发生去湿化现象而团聚成一个油滴附着在微凝胶表面。这样微凝胶迅速、直接的分散在收集水溶液中，避免了二次清洗、破除乳液的步骤。
图12是上述方法制备的载细胞微凝胶的正交三维成像显微照片，其中荧光标记的为活体细胞。
图13为上述方法制备的载细胞微凝胶尺寸和尺寸分布，图13中可见，微凝胶的直径大部分分布在240-250μm范围内，得到的载细胞微凝胶具有很好的单分散性。
由于整个制备过程中，细胞在油相中的停留时间只有几分钟，并直接分散在含有细胞生长所需养分的水溶液中，大大提高了细胞的存活率(如图14)。图14中，本发明双乳液制备方法固载于微凝胶中的细胞与传统的单乳液制备方法[5]固载于微凝胶中的细胞的存活率对比。本发明双乳液法固载后的细胞存活率与直接接种在细胞培养板上的细胞存活率相当，这是因为本方法载细胞微凝胶在收集水溶液中直接与油相分离，实现快速的和水相溶液中的细胞生长营养物质形成物质交换，且有潜在细胞毒性的光固化剂和表面活性剂成分被水相快速稀释，降低其对细胞影响。因此本发明所述方法具有优异的生物相容性、细胞毒性小。相反，单乳液法中载细胞微凝胶收集在油相中，并进行二次清洗破除乳液才能将微凝胶从油相中分离；并且为了增加微凝胶产量，需要长时间制备收集，因此细胞在油相中停留时间增加，细胞因为无法与外界进行物质交换，缺乏营养成分，且乳液中表面活性剂和光固化剂含量高具有潜在细胞毒性，因此细胞存活率随着在油相中停留时间的增加而降低。
并且该方法可自由选择细胞种类(如图15)。图15中，在对骨髓性白血病细胞(K562)，狗肾上皮细胞(MDCK)细胞和NIH/3T3成纤维细胞(公司)几种细胞的固载实验中，均证实双乳液法固载后的细胞存活率与直接接种在细胞培养板上的细胞存活率相当，说明该制备过程不会显著降低细胞的存活率。
图3是根据上述步骤(2)～(3)制备载有细胞的微凝胶的原理流程图。其中图3A是将各自配置好的内相、中间相和外相溶液按照规定的流速注入相应的微通道的过程，图3B是通过各自的微通道注入的内相、中间相和外相溶液，形成单分散性、超薄油层的水包油包水双乳液液滴，进一步在收集水溶液中脱外层的油相后形成载有细胞的微凝胶微粒的过程，图3C的步骤(a)～(c)是具有超薄油层的双乳液液滴在紫外光辐照下最内层水凝胶预聚物溶液发生交联固化，实现对悬浮细胞的三维包裹。进一步将其直接收集在收集水溶液中，由于油相壳层在界面润滑系数改变，且表面活性剂被收集水溶液稀释的共同作用下，而难以维持稳定的界面并发生去湿化(Dewetting)，导致油相团聚成一个油滴附着在微凝胶表面。油滴随后在浮力作用下自动分离脱落，最终得到分散在水溶液中的微凝胶微粒。
实施例4
利用实施例3制备得到的微凝胶微粒，进行细胞三维培养：将收集的载细胞微凝胶微粒通过网孔小于颗粒直径的滤网，从而确保油相能彻底被清除干净。将微凝胶放入普通细胞培养板进行三维培养，每三天更新一次培养基。在37℃，95％湿度和含5％二氧化碳气体中培养。
长期体外细胞培养实验证实活体细胞在固载于三维微凝胶中能正常生长、增殖，证明本发明所述技术的生物相容性。MDCK上皮细胞在明胶微凝胶基质中后持续增殖，体外培养4天后形成多个细胞聚集的细胞团(球)(如图16、18)。并随时间延长细胞球的大小逐渐增大，最终在7天后形成具有典型上皮组织构造的类组织微囊结构(如图17)，其中荧光标记的为活体细胞。这样的微囊结构具有由多细胞组成的厚壳和中心空腔，是MDCK细胞三维培养形成的典型形态。也充分证实了本发明所述微加工方法的生物相容性。
固载于微凝胶中的NIH/3T3成纤维细胞在三维培养环境中在包埋后快速附着并持续生长繁殖(图19、20)，其中荧光标记的为活体细胞。图19、图20显示，细胞培养4天后，大多数包封细胞从微凝胶内部长出，并附着在微凝胶的表面。而细胞的粘附生长产生的压缩力使得球形微凝胶发生收缩变形，致使微凝胶的尺寸随着培养时间下降(图21)。另外，成纤维细胞在微凝胶表面的持续生长最终使得微凝胶颗粒间形成的链接，组装成尺寸更大的类组织结构。
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Claims (24)

1.一种固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的一步法连续制备方法，包括如下步骤：
(1)以含有活细胞或生物活性分子、光固化剂和水凝胶预聚体的溶液作为内相；以含有油和表面活性剂的混合溶液作为中间相；以聚乙烯醇水溶液作为外相；
(2)将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别注入至微流控装置的相应微通道中，形成单分散的水包油包水双乳液；
(3)步骤(2)的所述单分散的水包油包水双乳液流经微流控装置的输出通道，收集在装有水性溶液的收集容器中，得固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶；
其中，在所述输出通道的出口端设置有激发水凝胶预聚体交联的装置；所述注入中间相的微通道内壁表面进行疏水处理；所述输出通道的内壁表面进行亲水处理；所述注入内相的微通道内壁表面进行亲水处理。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶预聚体在内相中的浓度为0.2-50w/v％，光固化剂在内相中的浓度为0.25-2w/v％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂在中间相中的浓度为0.1-5v/v％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述在聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇的浓度为1-20w/v％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的激发水凝胶预聚体交联的装置是紫外光源、设置在输出通道出口端外壁上的加热或制冷装置或输出通道内注入离子的离子注入装置中的一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将所述内相、中间相和外相通过微量泵或微注射器分别以100-2000μLhr-1、100-2000μLhr-1和1000-20000μLhr-1的流速输送至微流控装置的相应微通道中，形成单分散的水包油包水双乳液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述内相流速与中间相流速的比为0.5:1～4:1，内相流速和中间相流速的总和与外相流速比为1:5～1:50。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的水凝胶预聚体为可光固化聚合物单体、可离子交联的聚合物单体、温敏性的聚合物单体或其他可实现快速交联固化的水凝胶预聚体中的一种。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的可光固化聚合物单体为聚乙二醇双丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或二丙烯酸酯接枝的水溶性高分子中的一种；所述的可离子交联的聚合物单体为多糖类亲水性高分子海藻酸钠或壳聚糖中的一种；温敏性的聚合物单体为明胶、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或琼脂糖中的一种。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的细胞选自原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种；所述生物活性分子选自具有生物活性的药物、蛋白质和信号因子中的一种。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的光固化剂为1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮、1-羟基己基苯基酮或安息香双甲醚中的一种。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的油为矿物油、植物油、橄榄油或氟化油中的一种。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的表面活性剂为山梨醇酐月桂酸酯、山梨醇单棕榈酸酯、失水山梨醇油酸酯、倍半油酸山梨坦、三油酸山梨坦、失水山梨醇异硬脂酯、聚氧乙烯山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯山梨醇六油酸酯、A块共聚物表面活性剂、脱水山梨醇单异硬脂酸酯、聚氧乙烯(10)油基醚、聚氧乙烯(2)油基醚或Krytox-PEG-Krytox表面活性剂中的一种。
14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的内相中活细胞浓度为1-107个/mL。
15.权利要求1～14所述的任一项所述的方法制备得到的微凝胶的直径为10-1000μm，粒径分布的离散系数在3％～10％。
16.权利要求1～14所述的任一项所述的方法制备得到的微凝胶在制备载细胞支架中的应用。
17.一种用于制备固载有活细胞或生物活性分子的微凝胶的微流控装置，包括第一微通道、第二微通道、第三微通道、输出通道、紫外光源和收集容器，所述第一微通道、第二微通道和第三微通道分别具有送样端和插入端，所述第二微通道的插入端从第一微通道的送样端非密封地插入于第一微通道中；第三微通道的插入端从第二微通道的送样端非密封地插入于第二微通道中，形成套管；输出通道的一端从第一微通道的插入端非密封地插入于第一微通道中，与第一微通道内的套管端口非端到端连接，输出通道的另一端与收集容器相连，在第一微通道的插入端与收集容器之间的输出通道上设置有紫外光源。
18.根据权利要求17所述的微流控装置，其特征在于，所述的第二微通道的插入端的端口为锥形端口，所述的第三微通道的插入端的端口为锥形端口，所述的输出通道的插入于第一微通道的一端的端口为锥形端口。
19.根据权利要求18所述的微流控装置，其特征在于，所述的第二微通道的插入端端口的直径为5-1000μm，所述的第三微通道的插入端端口的直径为5-1000μm，所述的输出通道的插入于第一微通道的一端的端口的直径为10-2000μm。
20.根据权利要求17或18所述的微流控装置，其特征在于，在所述套管中，第三微通道插入端的端口不超出第二微通道的插入端端口，两端口之间距离大于1mm。
21.根据权利要求17所述的微流控装置，其特征在于，所述的第一微通道、第二微通道和第三微通道的送样端分别与微蠕动泵或微注射器相连，以实现自动进样。
22.根据权利要求17所述的微流控装置，其特征在于，在所述第一微通道内，所述套管的端口与输出通道的端口的距离为50～500μm。
23.根据权利要求17所述的微流控装置，其特征在于，所述第一微通道插入端连接有排气口。
24.根据权利要求17所述的微流控装置，其特征在于，第一微通道内壁表面进行亲水处理，所述第二微通道内壁表面进行疏水处理，所述第三微通道内壁表面进行亲水处理，所述输出微通道内壁表面进行亲水处理。
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