CN116536156A - 微流控细胞修复芯片及其在细胞修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微流控细胞核芯片技术领域，具体涉及微流控细胞修复芯片及其在细胞修复中的应用。该微流控细胞修复芯片，包括注液层、导液层以及捕捉层，注液层向微流控细胞修复芯片的内部注入液体，导液层将注入的液体导向捕捉层，捕捉层捕捉液体中的细胞或细胞团体。捕捉层中形成有多个捕捉结以及连接捕捉结的连柱，多个捕捉结和多个连柱相互连接形成一个立体的三维阵列结构。该微流控芯片能够提高细胞存活率，对HaCat细胞的细胞活性无影响，并对氧化损伤和光老化损伤的细胞具有修复作用。

Description

微流控细胞修复芯片及其在细胞修复中的应用
技术领域
本发明涉及微流控细胞核芯片技术领域，具体涉及微流控细胞修复芯片及其在细胞修复中的应用。
背景技术
微流控的含义是微尺度下的流体控制，其研究对象是使用微米级通道操控纳升级以下微量液体的系统。芯片是实现微流体控制的主要技术平台，因而微流控技术的内容是微流控芯片。目前，主流形式的微流控芯片指的是把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测，或者细胞培养、分选、裂解、分析等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以实现常规化学、生物、医学等不同类型实验功能的一种技术。发展到现在，微流控芯片应用到细胞生物学领域已经很成熟，其中一些技术平台已经从实验室发展到医疗应用领域的市场。过去曾经认为芯片操控流体过程中导致的细胞死亡是微流控技术发展的主要障碍。近年来的研究已经很大程度上克服了这一问题，已经能够控制芯片内对细胞的时空液体状态、细胞黏附和机械刺激，完成具有高活力细胞的组织构建，而且能重建天然细胞或者组织水平的功能和显微解剖结构。然而，未见有将微流控芯片进行细胞修复培养的报道，对细胞修复的应用前景未知。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了微流控细胞修复芯片及其在细胞修复中的应用，以提供至少一种微流控芯片的新的应用前景。
本发明的第一方面，提供了一种微流控细胞修复芯片，包括注液层、导液层以及捕捉层，所述注液层向微流控细胞修复芯片的内部注入液体，所述导液层将注入的液体导向所述捕捉层，所述捕捉层捕捉液体中的细胞或细胞团体。其中，所述捕捉层中形成有多个捕捉结以及连接所述捕捉结的连柱，多个所述捕捉结和多个所述连柱相互连接形成一个立体的三维阵列结构。
第一方面中，所述捕捉层含有多个微腔，所述微腔之间相互隔离，所述微腔内容纳所述捕捉结和所述连柱形成的三维阵列结构，其中，所述三维阵列结构中间孔隙尺寸为10～20m。
第一方面中，所述导液层具有由内部通道形成十字液滴发生器实现对将注液层的液体形成微液滴并导入至捕捉层，所述导液层的高度为30～60μm。
本发明的第二方面，提供了一种HaCat细胞的氧化损伤修复方法，包括：
采用第一方面所述的微流控细胞修复芯片对氧化损伤的HaCat细胞进行培养；
将无菌的微流控细胞修复芯片进行预处理后，向所述芯片内灌注含HaCat细胞的培养基培养12h；
将无血清DMEM稀释的15μM FCCP溶液以1μL/min的流量从HaCat细胞入口灌入芯片中，连续灌注处理HaCat细胞0.5h；
继续培养至收获细胞。
第二方面中，对所述微流控细胞修复芯片进行预处理的步骤包括：
将洁净的芯片进行紫外灭菌；
向芯片内灌注无菌0.01M、pH7.4的PBS，清洗芯片微管道，去除微管道内的气泡；
向芯片内灌注无菌的含200μg/mLI-型胶原蛋白和150μg/mL III-型胶原蛋白的溶液进行管道及培养腔的包被；
向芯片内灌注含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，并将芯片放置于37℃培养箱中孵育0.5h。
第二方面中，向所述芯片内灌注含HaCat细胞的培养基培养的步骤包括：
排出芯片中的气泡；
分别用1mL注射器吸取酸化的1％PFPE-PEG-PFPE氟化油和含有细胞的水相溶液，以在所述液滴发生器处产生油包水的液滴，海藻酸钠和Ca-EDTA在酸性条件下发生反应形成海藻酸钙水凝胶；
排除油相；
吸取新鲜的细胞培养基，以10μL/min的流量从水相入口灌入芯片；
芯片完成灌注操作后，滴加PBS缓冲液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
本发明的第三方面，提供了一种光老化HaCat细胞的修复方法，包括：
取对数期的HaCat细胞采用如权利要求1～3任一所述的微流控细胞修复芯片对HaCat细胞进行培养；
并在细胞灌注进行入芯片通道后进行120mJ/cm2辐射处理30min后，继续进行培养72h。
第三方面中，“取对数期的HaCat细胞采用如权利要求1～3任一所述的微流控细胞修复芯片对HaCat细胞进行培养”包括：
将无菌的微流控细胞修复芯片进行预处理后，向所述芯片内灌注含HaCat细胞的培养基培养，继续培养至收获细胞。
本发明的第四方面，提供了第一方面所述的微流控细胞修复芯片在细胞修复中的应用。
有益效果：
本发明标准软刻蚀技术加工制得了第一方面的微流控细胞修复芯片，其包括注液层、导液层以及捕捉层。其中，注液层向微流控细胞修复芯片的内部注入液体。导液层将注入的液体导向捕捉层，捕捉层捕捉液体中的细胞或细胞团体。相对于一般的微流控芯片能够提高细胞存活率，对HaCat细胞的细胞活性无影响。
对氧化损伤的HaCat细胞进行微流控培养后，细胞活性和细胞面积开始回升，说明本发明提供的微流控芯片进行培养细胞，对细胞的氧化损伤有一定修复作用。
对于光老化损伤的HaCat细胞进行微流控培养后，细胞的SOD活性和CAT活性得以提升，MDA含量得以降低，GSH含量得以升高，说明利用本发明提供的微流控细胞修复芯片对HaCaT细胞进行微流控培养能够修复UVB造成的HaCaT细胞的光老化性能。
附图说明
图1为本发明实施例提供的微流控细胞修复芯片截面结构示意图。
图2为本发明实施例提供的微流控细胞修复芯片平面结构示意图。
图3为图1中A处放大图。
图4为HaCat细胞在实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3的方式下培养后的细胞活性。
图5为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3的方式下培养HaCat细胞氧化损伤后的细胞活性。
图6为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3的方式下培养HaCat细胞氧化损伤后的细胞面积。
图7为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的方式下培养HaCat细胞UVB损伤后的细胞活性。
图8为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的方式下培养HaCat细胞UVB损伤后的细胞SOD活性。
图9为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的方式下培养HaCat细胞UVB损伤后的细胞CAT活性。
图10为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的方式下培养HaCat细胞UVB损伤后的细胞MDA含量。
图11为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的方式下培养HaCat细胞UVB损伤后的细胞GSH含量。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字，以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
一、微流控细胞修复芯片
1、芯片结构
本发明提供的微流控细胞修复芯片包括注液层12、导液层13以及捕捉层14。其中，注液层12向微流控细胞修复芯片的内部注入液体。导液层13将注入的液体导向捕捉层14，捕捉层14捕捉液体中的细胞或细胞团体。
其中，捕捉层14中形成有多个捕捉结141以及连接捕捉结的连柱142。具体的，多个捕捉结141和多个连柱142相互连接形成一个立体的三维阵列结构。
其中，注液层12是注入油相、水相等包含细胞和细胞营养成分等液体的通道，高度为300～600μm，具有若干注入口120和注入通道121。
导液层13具有由内部通道形成十字液滴发生器实现对将注液层的液体形成微液滴并导入至捕捉层14，导液层13的高度为30～60μm。水相和油相分别由独立的通道流经十字液滴发生器130处，在此处发生流动聚集剪切生成油包水的液滴。
捕捉层14含有256000个微腔140，微腔140之间相互隔离，微腔140内容纳捕捉结141和连柱142形成的三维阵列结构。其中，三维阵列结构中间孔隙尺寸为10～20m。
进一步地，在微流控细胞修复芯片中心设置捕捉层14，在捕捉层14个平行的表面分别延伸出一导液层13和一注液层2，以便于在十字液滴发生器130处形成的油包水的液滴进入捕捉层14的微腔140，以便于从微腔140内回收细胞。例如，当微流控细胞修复芯片水平放置时，可以从下方灌入水相，从上方回收液体，从而便于在十字液滴发生器130处形成的油包水的液滴进入捕捉层14的微腔140。
2、芯片加工及制造
使用标准软刻蚀技术加工制得上述结构的微流控细胞修复芯片，加工流程包括：
(1)抛光硅片清洗
浓硫酸(98％)倒入烧杯中，再用玻璃棒引流缓慢倒入过氧化氢溶液(30％)混合溶液的液面高度必须保证高于硅片表面，保证硅片完全浸入清洗液，加热煮沸约30min，停止加热，缓慢冷却至室温。硅片冷却完成后，超纯水反复冲洗3次。将硅片置于超纯水中超声清洗机处理2次，每次约15min。最后，将硅片用氮气吹干，置于135℃的烘箱中烘干，回到室温后用氧等离子清洗机处理。
(2)甩胶
根据通道高度的要求，设置好甩胶机的参数。硅片上分别旋涂GM2150，GM3025，或GM3050型号的SU-8光刻胶。从甩胶机上取下硅片，室温静置15min。光刻胶对光敏感性，需全程避光操作。
(3)前烘
将SU-至95℃加热1.5h，8胶的硅片放入烘箱中，缓慢升温至65℃后加热30min，再缓慢升温前烘后SU-8硅片在加热台上缓慢降温至室温。
(4)曝光
将芯片微通道结构图案的光刻掩膜贴到SU-8硅片上，在紫外光刻机中曝光15s。紫外光将透明部分的结构光刻在SU-8胶上，紫外光引起光刻胶发生交联反应紧密贴合到硅片上，而不透光部分的光刻胶则无法发生交联反应。在硅片上光刻上透光部分微图形的阳模。光刻后，硅片在室温下避光静置15min，使光刻胶发生充分交联反应。实验操作需全程注意严格避光。
(5)后烘
曝光后的硅片置于烘箱中加热，缓慢升温至65℃，加热30min，再缓慢升温至95℃，加热60min，结束加热后静置15min，缓慢降温至室温。
(6)每隔显影
将硅片浸入显影液中，置于摇床上低速旋转，显影约5min。1min观察显影情况，避免显影过度。显影至微结构出现且轮廓清晰，显影过程中，无多余SU-8胶残留，则显影完成。
(7)建模
显影后的硅片放置在通风橱中晾干，置于烘箱中135℃加热2h，以强化固定光刻胶通道结构。烘烤完成后缓慢降温至室温。光刻胶形成的微结构结合到硅片，完成模具的制作。
(8)倒模
先使用三甲基氯硅烷熏蒸处理模具表面，使PDMS基片易于从模具上剥离。完成前处理后，将PDMS前体和引发剂按10:1充分混匀，均匀倒入模具。真空抽取处理直至PDMS胶中的气泡完全去除，置入烘箱中，85℃下烘烤20min，取出模具冷却至常温。将PDMS基片从硅片模具上轻轻剥离，并在通道的流体入口和出口处打孔。
(9)封接
按照“Singh SK,Hawkins C,Clarke ID,Squire JA,Bayani J,Hide T,etal.Identification of human brain tumour initiating cells[J].Nature.2004,432(7015):396-401.”报道的方法将PDMS基片依次封接。用氧等离子清洗机处理PDMS基片1min。捕捉层的两个平行表面分别与导液层通道面重叠封接，再将注液层通道面与导液层光面一侧封接。按设计要求封接后，小心压紧，排出气泡，得到完整的微流控细胞修复芯片。将制备好的芯片置于重物下过夜。芯片封接应在无尘条件下完成。
(10)无菌处理
PDMS芯片使用前在121℃下高压灭菌35min，并在60℃下干燥4h。
3、微流控细胞修复芯片操作
(1)排出气泡
1mL注射器吸取纯氟化油，用聚四氟乙烯毛细管连接到芯片的油相入口，以60μL/min的流量由注射泵驱动灌入芯片，排出芯片通道内的气泡。
(2)液滴发生
分别用1mL注射器吸取酸化的1％PFPE-PEG-PFPE氟化油和含有细胞的水相溶液。聚四氟乙烯毛细管分别连接油相和水相入口，用注射泵将两相引入微流控细胞修复芯片。注射泵调节水相流量(10μL/min)和油相流量(30μL/min)，水相和油相到达液滴发生器，可生成油包水的液滴。同时海藻酸钠和Ca-EDTA在酸性条件下发生反应形成海藻酸钙水凝胶。
(3)排出油相
1mL注射器吸取纯氟化油，用聚四氟乙烯毛细管连接到芯片的油相入口，以30μL/min的流量引入芯片中，稀释液滴表面的表面活性剂PFPE-PEG-PFPE，后续无血清的培养基进入后包裹液滴的油层被轻易地排走。
(4)芯片上细胞培养
1mL注射器吸取新鲜的细胞培养基，用聚四氟乙烯毛细管连接到芯片的水相入口，以10μL/min的流量灌入芯片。芯片完成灌注操作后，滴加PBS缓冲液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。每天从水相入口10μL/min的流量灌入新鲜的细胞培养基，补充培养层中的细胞培养液，进行细胞的连续培养及后续研究。
(5)芯片上细胞回收
1mL注射器吸取10mM EDTA溶液，用聚四氟乙烯毛细管连接到芯片的油相入口，再在芯片出口处用聚四氟乙烯毛细管连接无菌的1.5mL离心管。用注射泵驱动EDTA溶液以10μL/min的流量灌入芯片溶解海藻酸钙水凝胶，海藻酸钙遇到EDTA释放钙离子变成海藻酸盐溶液，水凝胶破裂进而释放细胞。灌注10min后，将注射器内的EDTA溶液改为新鲜培养基，上下翻转芯片，再以60μL/min的速度继续灌注芯片，使细胞降落至导液层及注液层后，将细胞冲出，回收至离心管中。
二、微流控细胞修复芯片上的HaCat细胞培养
实施例1：
HaCat细胞(货号：CM-H377，盖宁生物)消化成细胞悬液。采用上述步骤制得的微流控细胞修复芯片对HaCat细胞进行培养。其中，微流控细胞修复芯片的注液层高度为450μm，导液层的高度为50μm，三维阵列结构中间的最大孔隙尺寸为10μm，三维阵列结构的最大边缘尺寸为50μm。
(1)微流控细胞修复芯片预处理
将芯片表面清理干净，放置在超净工作台内，用紫外灭菌灯照射2h以上；向芯片内灌注无菌PBS(0.01M，pH7.4)，清洗芯片微管道，去除微管道内的气泡；向芯片内灌注无菌的含200μg/mL I-型胶原蛋白和150μg/mL III-型胶原蛋白的溶液进行管道及培养腔的包被，将芯片放置于37℃培养箱中孵育2h以上；向芯片内灌注含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，并将芯片放置于37℃培养箱中孵育0.5h。
(2)微流控细胞修复芯片内细胞的接种与培养
将106/mL的HaCat细胞悬液用微量注射泵和注射器以4μL/min的流量，按照上述微流控细胞修复芯片操作步骤(1)～(5)注入、形成液滴并使得液滴进入捕获层，进行微流控细胞修复芯片的细胞培养。
实施例2：
采用上述步骤制得的微流控细胞修复芯片对HaCat细胞进行培养。其中，微流控细胞修复芯片的注液层高度为450μm，导液层的高度为50μm，三维阵列结构中间的最大孔隙尺寸为5μm，三维阵列结构的最大边缘尺寸为50μm。其具体培养步骤与实施例1相同。
对比例1：
采用与实施例1相同的微流控细胞修复芯片对HaCat细胞进行培养，具体如下：(1)微流控细胞修复芯片预处理
将芯片表面清理干净，放置在超净工作台内，用紫外灭菌灯照射2h以上；向芯片内灌注无菌PBS(0.01M，pH7.4)，清洗芯片微管道，去除微管道内的气泡；向芯片内灌注含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，并将芯片放置于37℃培养箱中孵育0.5h。
(2)微流控细胞修复芯片内细胞的接种与培养
将106/mL的HaCat细胞悬液用微量注射泵和注射器以4μL/min的流量，按照上述微流控细胞修复芯片操作步骤(1)～(5)注入、形成液滴并使得液滴进入捕获层，进行微流控细胞修复芯片的细胞培养。
对比例2：
市售微流控细胞修复芯片(细胞培养用PMMA微流控细胞修复芯片，管道宽度100μm，管道深度100μm，苏州汶颢微流控技术股份有限公司)。采用上述相同步骤对该微流控细胞修复芯片进行预处理后，再将106/mL的HaCat细胞悬液用微量注射泵和注射器以4μL/min的流量，按照上述微流控细胞修复芯片操作步骤(1)～(5)注入、形成液滴并使得液滴进入捕获层，进行微流控细胞修复芯片的细胞培养。
对比例3：
将106/mL的HaCat细胞悬液接种于低黏附六孔板(美国康宁公司)中，并加入1mL/孔的含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2天换一次液，观察和统计细胞成球情况，培养周期为14天。
单细胞水凝胶液滴形成后，实验检测第0、5、10、15天的细胞活力。注射器抽取100μL细胞死/活染色染料(终浓度：Calcein-AM为1μmo1/L，PI为1μmol/L)，以5μL/min的流体流量置换细胞培养液。芯片输入细胞死/活染色染料后，置于培养箱孵育10min，再用PBS以5μL/min的流体流量冲洗芯片。最后，芯片放置在倒置荧光显微镜上进行观察和成像。在Calcein-AM/PI染色的荧光图像中，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。ImageJ软件处理数据，统计细胞存活率为Ni/Nt×100％，其中Ni为芯片内的绿色荧光强度，Nt为芯片同一位置红色和绿色荧光强度之和。
结果如图4所示，实施例1和实施例2在连续培养15天后，细胞存活率仍然维持在100％以上。而对比例1～2提供的培养方式在连续培养15天后，细胞存活率低至20％以下。说明采用实施例1和实施例2分别提供的微流控细胞修复芯片对HaCat细胞的细胞活性无影响。
三、细胞氧化损伤修复实验
1、芯片内实验
实施例1实施例2、对比例1和对比例2的芯片内细胞氧化损伤修复实验按照如下步骤进行，其中的细胞培养参照上述各自对应的细胞培养实验步骤。
本发明以线粒体解偶联试剂FCCP为缺氧试剂(Caietal.2002)，构建芯片内HaCat细胞缺氧模型，具体操作方法详述如下：
待HaCat细胞以连续灌注培养基的方式在芯片HaCat细胞培养区内培养12h，汇合形成单层后，将无血清DMEM稀释的FCCP溶液(15μM)以1μL/min的流量从HaCat细胞入口灌入芯片中，连续灌注处理HaCat细胞0.5h。在HaCat细胞培养区内FCCP缺氧处理HaCat细胞的过程，用相差显微镜连续拍照，观察细胞的形态变化，并用Image-Pro.Plus6.0(MediaCyternetics)软件计算细胞面积；化学缺氧处理30min后，在Calcein-AM/PI染色的荧光图像中，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。ImageJ软件处理数据，统计细胞存活率为Ni/Nt×100％，其中Ni为芯片内的绿色荧光强度，Nt为芯片同一位置红色和绿色荧光强度之和。
用4％多聚甲醛固定细胞，分别用TRITC-鬼笔环肽和Hoechst33258染肌动蛋白纤维和细胞核。细胞骨架和细胞核染色：(1)将4％的多聚甲醛溶液灌注入芯片细胞培养区，室温下固定10min，PBS清洗去除多聚甲醛；(2)用膜穿孔试剂(0.1％Triton-X100)室温下处理细胞30min，PBS清洗去除Triton-X 100；(3)用TTRITC-鬼笔环肽(100nM)溶液标记肌动蛋白纤维，37℃孵育20min，PBS清洗去除未结合的TRITC-鬼笔环肽；(4)用Hoechst 33258(0.5μg/mL)标记细胞核，室温下孵育10min，PBS清洗去除未结合的Hoechst 33258；(5)用倒置荧光显微镜观察并拍摄细胞的白光和荧光照片。
2、芯片外实验
对比例3的芯片外细胞氧化损伤修复实验按照如下步骤进行。
将106/mL的HaCat细胞悬液接种于低黏附六孔板中，并加入1mL/孔的含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养2d后，用于FCCP损伤的细胞毒性试验。临用前，将FCCP原液加入DMEM培养液中，制备成含15μmol/L的FCCP浓度的培养基，加至细胞孔中，每孔加入100μL，作用0.5h。FCCP作用后，检测细胞活力，分析细胞形态变化。
为了分析HaCat细胞损伤后的继续发展，在上述FCCP作用后，弃去FCCP溶液并用DMEM培养基清洗各孔3次，即每孔加入100μL培养基孵育，每次1min。然后各孔加入细胞培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h后对细胞活力和细胞形态的变化进行分析。FCCP处理后的六孔板培养的HaCat细胞活力测定采用了MTT还原比色法。首先，弃去各孔FCCP溶液，加入100μLDMEM培养基洗3次，随后各孔加入20μLMTT溶液和无血清DMEM培养基150μL，同时设空白组(用培养液代替FCCP)，放入培养箱中继续培养4h。弃上清液，各孔加入100μLDMSO，震荡10min，用酶标仪检测各孔在490nm波长吸光度值(A)，并记录。MTT实验重复4次，计算细胞活力＝Ad/Ac×100％。
其中Ad和Ac分别为FCCP作用和对照细胞孔的吸光度。细胞的活力通过OA-PI染色进行分析。上述培养的HaCat细胞经不同浓度FCCP作用不同时间后，弃去FCCP溶液，用PBS清洗后各孔加入OA溶液终浓度为5mg/mL，并同时加入PI溶液终浓度为1.0μmol/L，孵育10min后，在倒置荧光显微镜下观察并拍摄图片。
3、结果
本试验首先采用传统的MTT试验分析了FCCP的HaCat细胞毒性。试验采用不同浓度的15μmol/L的FCCP作用0.5h进行细胞氧化损伤。如图5、6所示，MTT分FCCP作用于HaCat细胞0.5h后，细胞在0～15h内活性和细胞面积显著降低，说明在细胞在缺氧状态下最早出现的形态学变化是皱缩，细胞受到氧化损伤。而在15～20h后，采用实施例1～2分别提供的芯片进行微流控培养后，细胞活性和细胞面积开始回升，说明采用此2种方式培养细胞，对细胞的氧化损伤有一定修复作用。而对比例1～3并不存在此种现象，说明采用对比例1～2提供的芯片及微流控培养以及采用对比例3的芯片外一般培养方式并不能使得HaCat细胞遭受FCCP的氧化损伤得以修复。四、HaCat细胞的光老化修复
1、建立HaCaT细胞光老化模型
(1)开灯15min后，用紫外辐照计测的距离光源垂直15cm处辐射强度为0.17mW/cm2。并根据公式计算出辐射时间：辐射剂量(mJ/cm2)＝辐射强度(mW/cm2)×时间(s)。
(2)取对数生长期的HaCaT细胞进行消化、离心，使用血球计数板计数，将细胞调整浓度为1×105个/mL，取100μL/孔接种于96孔板，每组设置3个复孔，放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养24h。
(3)将96孔板内细胞随机分为空白对照组和UVB组
空白对照组：吸去旧培养液，每孔加入预热的PBS缓冲液50μL覆盖细胞，用铝箔纸覆盖，处理后吸净PBS缓冲液，每孔加入100μL新培养液，放入培养箱中孵育，24h后测定细胞的存活率。
UVB组：吸去旧培养液，每孔加入预热的PBS缓冲液50μL覆盖细胞，根据实验分组辐射剂量((30、60、90、120、150、180)mJ/cm2)进行辐射处理30min，处理后吸净PBS缓冲液，用干净PBS缓冲液洗涤两次，每孔加入100μL新培养液，放入培养箱中孵育，24h后测定细胞的存活率。结果(30、60、90、120、150、180)mJ/cm2剂量下的细胞存活率分别为98.63％、91.73％、83.29％、61.55％、39.43％和12.26％。
2、分组实验
取对数生长期的HaCaT细胞进行消化、离心，使用血球计数板计数，将细胞调整浓度为1×105个/mL，分为空白组、实验组、UVB组以及阳性组。
空白组：
吸去旧培养液，每孔加入预热的PBS缓冲液50μL覆盖细胞，用铝箔纸覆盖，处理后吸净PBS缓冲液，每孔加入100μL新培养液，放入培养箱中孵育72h。
实验组：
取对数生长期的HaCaT细胞分别按照上述实施例1、实施例2、对比例1和对比例2提供的方法接种于对应的微流控细胞修复芯片中进行培养，并在细胞灌注进行入芯片通道后进行120mJ/cm2辐射处理30min后，继续进行培养72h。
UVB组：
吸去旧培养液，每孔加入预热的PBS缓冲液50μL覆盖细胞，120mJ/cm2辐射处理30min后处理后吸净PBS缓冲液，用干净PBS缓冲液洗涤两次，接种于96孔板，每孔加入100μL新培养液，每组设置3个复孔，放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养72h。
阳性组：
吸去旧培养液，每孔加入预热的PBS缓冲液50μL覆盖细胞，120mJ/cm2辐射处理30min后吸净PBS缓冲液，用干净PBS缓冲液洗涤两次，每孔加入100μL含100μg/mL透明质酸培养液，放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养72h。
3、细胞活性
上述UVB组中的细胞活性参照上述实施例1～2和对比例1～2的细胞活性进行检测。空白组和阳性组的细胞活性参照上述对比例3中的MTT法进行检测。结果如图7所示。图7可知，相对于空白组，阳性组的细胞活性在UVB处理后的细胞活性得以恢复，实施例1和实施例2提供的微流控细胞修复芯片中HaCaT细胞在经UVB处理后的细胞活性也得以恢复。而对比例1～2提供的微流控细胞修复芯片中HaCaT细胞在经UVB处理后的细胞活性并未恢复。
4、收集和裂解细胞
从上述空白组、UVB组和阳性组的微流控细胞修复芯片或者细胞培养板中收集细胞，将消化后加入适量完全培养基终止消化，用移液枪反复吹打孔板上未完全脱落的细胞，尽量使细胞都脱落下来，收集细胞悬液转移至EP管，1000/min，离心5min，弃上清废液。加入已预热的PBS缓冲液漂洗，涡旋振荡器重悬后，1000/min，离心5min，重复2次，最后一次吸弃PBS缓冲液。将离心后装有细胞的EP管置于冰盒上备用，每管加入1制剂PMSF的PBS缓冲液重悬细胞，在冰浴条件下超声2min，超声时间6s、间隔6s。细胞裂解完成后，将EP管放入提前预冷的离心机中，12000r/min,40C离心5min，离心后的上清液即为待检测的样品。
5、SOD、CAT、MDA、GSH检测
按照SOD、CAT试剂盒(江苏凯基生物)操作说明书测定各组样品中SOD和CAT的活性。按照MDA、GSH试剂盒(江苏凯基生物)操作说明书测定各组样品中MDA和GSH的含量。
图8示出了各组细胞中的SOD活性，图9示出了各组细胞中的CAT活性。结果相对于空白组，UVB组细胞中SOD活性和CAT活性显著降低，说明UVB光老化模型构建成功。而实施例1和实施例2提供的微流控细胞修复芯片中HaCaT细胞在经UVB处理后细胞中的SOD活性和CAT活性得以提升。而对比例1和2分别提供的微流控培养方式对经UVB处理HaCaT细胞中的SOD活性和CAT活性提升效果有限，说明本发明提供的微流控细胞修复芯片对HaCaT细胞进行微流控培养，能够修复UVB造成的HaCaT细胞的光老化性能。
图10示出了各组细胞中的MDA含量，图11示出了各组细胞中GSH含量。结果相对于空白组，UVB组细胞中GSH含量显著降低，MDA含量显著升高，说明UVB光老化模型构建成功。而实施例1和实施例2提供的微流控细胞修复芯片中HaCaT细胞在经UVB处理后细胞中的MDA含量得以降低，GSH含量得以升高，由此说明利用本发明提供的微流控细胞修复芯片对HaCaT细胞进行微流控培养能够修复UVB造成的HaCaT细胞的光老化性能。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种微流控细胞修复芯片，其特征在于，包括注液层、导液层以及捕捉层，所述注液层向微流控细胞修复芯片的内部注入液体，所述导液层将注入的液体导向所述捕捉层，所述捕捉层捕捉液体中的细胞或细胞团体。
其中，所述捕捉层中形成有多个捕捉结以及连接所述捕捉结的连柱，多个所述捕捉结和多个所述连柱相互连接形成一个立体的三维阵列结构。
2.根据权利要求1所述的微流控细胞修复芯片，其特征在于，所述捕捉层含有多个微腔，所述微腔之间相互隔离，所述微腔内容纳所述捕捉结和所述连柱形成的三维阵列结构，其中，所述三维阵列结构中间孔隙尺寸为10～20m。
3.根据权利要求1所述的微流控细胞修复芯片，其特征在于，所述导液层具有由内部通道形成十字液滴发生器实现对将注液层的液体形成微液滴并导入至捕捉层，所述导液层的高度为30～60μm。
4.一种HaCat细胞的氧化损伤修复方法，其特征在于，包括：
采用如权利要求1～3任一所述的微流控细胞修复芯片对氧化损伤的HaCat细胞进行培养；
将无菌的微流控细胞修复芯片进行预处理后，向所述芯片内灌注含HaCat细胞的培养基培养12h；
将无血清DMEM稀释的15μMFCCP溶液以1μL/min的流量从HaCat细胞入口灌入芯片中，连续灌注处理HaCat细胞0.5h；
继续培养至收获细胞。
5.根据权利要求4所述的氧化损伤修复方法，其特征在于，对所述微流控细胞修复芯片进行预处理的步骤包括：
将洁净的芯片进行紫外灭菌；
向芯片内灌注无菌0.01M、pH7.4的PBS，清洗芯片微管道，去除微管道内的气泡；
向芯片内灌注无菌的含200μg/mLI-型胶原蛋白和150μg/mLIII-型胶原蛋白的溶液进行管道及培养腔的包被；
向芯片内灌注含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，并将芯片放置于37℃培养箱中孵育0.5h。
6.根据权利要求4或5所述的氧化修复方法，其特征在于，向所述芯片内灌注含HaCat细胞的培养基培养的步骤包括：
排出芯片中的气泡；
分别用1mL注射器吸取酸化的1％PFPE-PEG-PFPE氟化油和含有细胞的水相溶液，以在所述液滴发生器处产生油包水的液滴，海藻酸钠和Ca-EDTA在酸性条件下发生反应形成海藻酸钙水凝胶；
排除油相；
吸取新鲜的细胞培养基，以10μL/min的流量从水相入口灌入芯片；
芯片完成灌注操作后，滴加PBS缓冲液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
7.一种光老化HaCat细胞的修复方法，其特征在于，包括：
取对数期的HaCat细胞采用如权利要求1～3任一所述的微流控细胞修复芯片对HaCat细胞进行培养；
并在细胞灌注进行入芯片通道后进行120mJ/cm2辐射处理30min后，继续进行培养72h。
8.根据权利要求7所述的修复方法，其特征在于，“取对数期的HaCat细胞采用如权利要求1～3任一所述的微流控细胞修复芯片对HaCat细胞进行培养”包括：
将无菌的微流控细胞修复芯片进行预处理后，向所述芯片内灌注含HaCat细胞的培养基培养，继续培养至收获细胞。
9.权利要求1～3任一所述的微流控细胞修复芯片在细胞修复中的应用。
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