CN112409553B - 微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用 - Google Patents

微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112409553B
CN112409553B CN202011339217.7A CN202011339217A CN112409553B CN 112409553 B CN112409553 B CN 112409553B CN 202011339217 A CN202011339217 A CN 202011339217A CN 112409553 B CN112409553 B CN 112409553B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hydrogel
microspheres
solution
micro
phase solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011339217.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112409553A (zh
Inventor
赵静文
崔文国
俞小华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Xianshi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Xianshi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Xianshi Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Xianshi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202011339217.7A priority Critical patent/CN112409553B/zh
Publication of CN112409553A publication Critical patent/CN112409553A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112409553B publication Critical patent/CN112409553B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F299/00—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers involving only carbon-to-carbon unsaturated bond reactions, in the absence of non-macromolecular monomers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/222—Gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2/00—Processes of polymerisation
    • C08F2/46—Polymerisation initiated by wave energy or particle radiation
    • C08F2/48—Polymerisation initiated by wave energy or particle radiation by ultraviolet or visible light
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J9/00—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof
    • C08J9/28—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof by elimination of a liquid phase from a macromolecular composition or article, e.g. drying of coagulum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/602—Type of release, e.g. controlled, sustained, slow
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/24—Materials or treatment for tissue regeneration for joint reconstruction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2355/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers, obtained by polymerisation reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, not provided for in groups C08J2323/00 - C08J2353/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
  • Colloid Chemistry (AREA)

Abstract

本发明提供了一种微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：(1)将水凝胶材料、缓冲液和光引发剂混合，得到水凝胶溶液，向其中加入二甲基亚砜，得到水相溶液；将油性材料与表面活性剂混合，得到油相溶液；(2)将水相溶液和油相溶液加入微流控装置，制备得到水凝胶微液滴；(3)将水凝胶微液滴进行低温处理，以形成冰晶；待冰晶形成完全之后，维持低温环境，在紫外光照射下进行固化交联，交联完全后升至室温，使冰晶融化后形成孔隙，即得到多孔水凝胶微球。本发明所述水凝胶微球具备多孔且孔径平均的特点，可负载不同类型的细胞，作为优良的细胞载体在骨修复、皮肤缺损等方面有着非常大的应用前景。

Description

微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用
技术领域
本发明属于水凝胶材料制备技术领域，具体涉及一种微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用。
背景技术
水凝胶是一种由亲水高分子交联而成的含有大量水的三维网络结构，具有高亲水性、高粘弹性好、低摩擦系数、生物相容性优异等优点，使得水凝胶材料在细胞载体、药物载体、组织工程等生物医学领域有着非常广泛的应用。通常，水凝胶的构建材料主要分为天然高分子和人工合成高分子材料两种。其中，天然高分子材料是指来源于天然动植物的高分子材料，具有极好的生物相容性和生物活性，主要包括如海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸等多聚糖以及如胶原蛋白、明胶等蛋白聚糖；人工合成高分子主要包括聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯酮(PVP)和聚丙烯酰胺(PAAm)等，具有结构可控等优点。水凝胶的成胶方式有包括温度变化引起聚合链段缠结、分子自组装、离子相互作用和静电相互作用在内的物理交联，以及包括亚胺交联、巯基-Michael加成、Diels-Alder反应以及叠氮-炔反应的化学交联。
作为细胞载体和组织工程支架，块材水凝胶支架大多体积较大，需进行外科手术移植，因而将支架微型化是很好的解决方案之一。可注射水凝胶微球是指利用特定方式将水凝胶做成球形，并且尺寸满足可注射的要求，与传统3D支架相比，可注射微球避免了手术移植，提供了微创治疗的可能性，并且可被注入任何缺陷内，无需考虑形状变化，将细胞与药物等运送到特定部位，因而受到了广泛关注。然而，目前常用的水凝胶微球存在如下问题：(1)微球内部缺少孔隙，导致营养物质无法渗透，内部细胞无法存活；(2)制备过程中需要加热，对微球负载的生物活性因子造成影响；(3)制备过程中运用了化学交联剂，其降解产物对机体有一定毒性。
目前常用的制备多孔水凝胶的方法主要是冷冻干燥法、颗粒浸出法和气泡法，然而，这些方法存在材料外部结构发生改变、孔隙尺寸不可控、只适合块材水凝胶而不适用于微米级的水凝胶微球的制备等问题。
因此，如能在保留传统微球的生物相容性、可注射性等优点的同时，还能将多孔结构引入微球内部并能够很好调控，从而实现营养物质在球内的渗透，并在制备过程中避免对负载物的损伤，这对于扩展水凝胶微球在生物医学领域中的应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用。本发明提供了一种依托微流控技术、利用冰晶的形成来制备多孔3D水凝胶微球的方法，并能实现对其微观孔隙的调控，进一步地，本发明还提供了对该多孔水凝胶微球的生物应用。
本发明的目的之一是提供一种微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法，其采用的技术方案为：
(1)将水凝胶材料、缓冲液和光引发剂混合，得到水凝胶溶液，向该水凝胶溶液中加入二甲基亚砜，所述二甲基亚砜的浓度为占水凝胶溶液的质量体积比为0～10％m/v(不为零)，通过调节DMSO的加入量来控制孔径大小，得到水相溶液；将油性材料与表面活性剂混合，得到油相溶液；
(2)将步骤(1)所述水相溶液和油相溶液加入微流控装置，制备得到水凝胶微液滴；
(3)对步骤(2)所得水凝胶微液滴进行-20℃以下的低温处理，使得水凝胶微液滴中的水分形成冰晶；待冰晶形成完全之后，维持相同的低温环境，在紫外光照射下进行固化交联，交联完全后进行升温，使冰晶融化后形成孔隙，即得到多孔水凝胶微球。
微流控技术是一种精确控制和处理微流体的技术，利用该技术制备的水凝胶微球具有单分散性好、稳定性高、产量高等优点。光化学反应具有非物理接触、剂量可调、能源清洁、无毒副产物等优势，可实现时间与空间的精确操控，因为被广泛应用于生物医学水凝胶的构建。本发明以微流控技术和可光交联水凝胶为依托，利用水凝胶在低温环境下冰晶的形成来制备多孔水凝胶微球，同时通过在水凝胶溶液中添加二甲基亚砜，来实现对其孔隙大小进行调控，从而获得了孔径更小、内部表面积更大的水凝胶微球结构。
本发明所述的微流控技术也被称为芯片实验室技术，是指在微通道内精确操控和处理微尺度流体的技术，具有微型化和集成化的特点。因微流控通道内样品损耗少，混合速率快，流体流速可控等特点，液滴微流控技术在生物医学研究中有着广泛的应用。液滴微流控技术利用互不相容的流体相互剪切而形成分散的微米级乳液液滴，并可对液滴的大小和结构实现精准控制。
本发明利用微流控装置来制备油包水型(water-in-oil,W/O)水凝胶微液滴，即利用油相流体作为连续相来剪切水相使其分散在油相中形成微液滴，其中原理是在连续相流体剪切分散相流体时，当剪切力大于两相的界面张力时，分散相在两相交界处被剪切为单个分散的液滴。本发明方法获得的水凝胶微球具有尺寸可控、单分散性好、重复率高等特点。
本发明利用水凝胶的高含水量以及水在低温下形成冰晶的特性来制备多孔水凝胶微球，更为重要的是本发明利用二甲基亚砜(DMSO)实现了对微球孔隙大小的控制。本发明人利用水溶液中DMSO的存在会阻碍冰晶的形成，从而对溶液的凝固点有很大影响，高浓度的DMSO会使溶液的凝固点降低。在冷冻凝胶化的过程中，通过将含有DMSO的水凝胶微液滴收集于-20℃的低温环境下。当冰晶开始生长后，冰晶周围剩余液体中DMSO浓度增大，凝固点降低至-20℃以下，导致冰晶生长停滞，从而控制冰晶，即孔隙的大小。冰晶形成结束后，在低温环境下进行紫外照射，形成多孔的水凝胶微球。
在本发明中，所述多孔水凝胶微球的大小可以通过微流控技术中油相和水相的流速比来调控，而孔隙大小可以通过加入DMSO的量来进行调节。在本发明中，所述多孔水凝胶微球可负载不同类型的药物和生物活性因子，并可实现其调控释放。本发明对负载的不同类型的药物比例没有特殊限制，可直接将药物与水凝胶溶液混合，制得微液滴后交联即得。
进一步的是，步骤(1)中所述水凝胶材料选自透明质酸水凝胶、纤维素水凝胶、海藻酸盐水凝胶、胶原蛋白水凝胶、聚酯类水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯水凝胶，透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺水凝胶或不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶中的一种或多种。本发明对所述水凝胶材料的来源没有特殊限制，可以采用市售产品，也可以自行制备。
进一步的是，步骤(1)中所述光引发剂选自LAP、Irg.184、Irgacure2959、三乙醇胺(TEOA)或者二苯甲酮中的一种。
进一步的是，步骤(1)中所述油性材料选自全氟油、矿物油、硅油、石蜡油和豆蔻酸异丙酯中的一种或多种；所述表面活性剂包括脂肪酸山梨坦(司班)、烷基葡糖苷(APG)、脂肪酸甘油酯、聚山梨酯(吐温)中的一种或多种。
进一步的是，步骤(2)中所述水相溶液和油相溶液是在微流控装置中通过流动剪切力的作用形成油包水形态的水凝胶微液滴。
进一步的是，步骤(2)中所述水相溶液的流速为10～100μL/min，所述油相溶液的流速为50～800μL/min。
进一步的是，步骤(3)中所述紫外光照射的时间为10～30s；所述升温至温度为10～30℃。
本发明的目的之二是提供由上述方法制备得到的可注射多孔水凝胶微球，所述水凝胶微球的粒径为100-500μm，平均孔径大小为9～25μm。
本发明的目的之三是提供由上述方法制备得到的可注射多孔水凝胶微球在组织修复和/或制备用于疾病治疗中相关药物的应用，例如在制备用于骨修复、关节填充、创面修复、神经修复、卒中治疗中的药物方面的应用，包括将该多孔水凝胶微球负载不同类型的药物和生物活性因子，并可调控其释放，或作为细胞载体用于骨修复和皮肤缺损等生物医药方面的应用。
本发明所述水凝胶微球得益于其多孔且孔径平均的性能，使得营养液可以向微球内充分渗透，可负载不同类型的细胞，作为优良的细胞载体在骨修复、皮肤缺损等方面有着非常大的应用前景。在本发明的一些实施例中，可成功地实现注射负载细胞的水凝胶微球到特定位置，并保持很好的细胞活性。本发明所述的可负载不同类型药物和细胞的多孔水凝胶微球可根据疾病及其康复需求按时段进行微创注射，为联合用药以及植入性材料功能化奠定了基础，也为其作为细胞载体在组织工程领域的应用开辟了新的方向，对水凝胶微球在生物医学领域的拓展应用具有重要意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明方法获得的水凝胶微球具有尺寸可控、单分散性好、重复率高等特点；该水凝胶微球的粒径为100-500μm，平均孔径大小为9～25μm，孔径分布均匀。
(2)本发明方法中所述多孔水凝胶微球的大小可以通过微流控技术中油相和水相的流速比来调控，而孔隙大小可以通过加入DMSO的量来进行调节。
(3)本发明所述多孔水凝胶微球可负载不同类型的药物和生物活性因子，并可实现其调控释放。
附图说明
图1为GelMA的合成示意图。
图2为明胶和GelMA的核磁氢谱图。
图3为共轴毛细管微流控装置制备油包水型微液滴示意图。
图4为自制的共轴毛细管微流控装置图。
图5为微流控平台实物图。
图6为不同粒径水凝胶微球的光学显微镜照片，其中相对应油/水相流速比分别为(A)40，(B)20，(C)10，(D)5；图中比例尺为200μm。
图7为油/水相流速比与水凝胶微球粒径大小的关系图。
图8为微流控装置制备实心(上)和多孔(下)水凝胶微球示意图。
图9为(A)实心水凝胶微球和(B)多孔水凝胶微球的光学显微镜照片；图中比例尺为50μm。
图10为实心和多孔水凝胶微球分别在去离子水和PBS中的溶胀率结果。
图11为不同浓度的DMSO与水的混合液对溶液凝固点的影响。
图12为不同浓度的DMSO生成的多孔微球的SEM形貌；其中A-C图中比例尺为200μm，D-F图中比例尺为50μm。
图13为DMSO浓度对微球孔隙大小的影响。
图14为不同浓度DMSO生成的多孔微球的共聚焦显微镜照片；图中比例尺为100μm。
图15为实心水凝胶微球和多孔水凝胶微球细胞毒性检测结果。
图16为实心和多孔水凝胶微球负载内皮细胞的增殖实验结果。
图17为实心和多孔水凝胶微球负载成纤维细胞的增殖实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
以下实施例中，所涉及的部分实验材料来源如下：
标准带丝玻璃毛细管(型号1B100F-3，购自世界精密仪器商贸(上海)有限公司)；0.22μm、0.45μm针式过滤器(购自芯硅谷)；透析袋(截留分子量8000-14000、截留分子量3500，购自上海源叶生物科技有限公司)；丙酮(CAS:67-64-1，购自国药试剂)；明胶(批号:180LB8，购自罗赛洛(大安)明胶有限公司)；甲基丙烯酸酐(CAS:760-93-0，购自阿拉丁试剂)；2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(CAS:106797-53-9，购自百灵威科技有限公司)；十八烷基三甲氧基硅烷(CAS:3069-42-9，购自阿拉丁试剂)；失水山梨醇油酸酯(司班80)(CAS:1338-43-8，购自麦克林试剂)；二甲基亚砜(CAS：67-68-5，购自阿拉丁试剂)；苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(CAS:85073-19-4，购自阿拉丁试剂)。
实施例1、GelMA的制备及表征(一)GelMA的制备(见图1)
称取20g明胶，加入到2L锥形瓶中并加入200mL PBS，将该锥形瓶置于60℃水浴中，搅拌至明胶完全溶解，待明胶完全溶解后，向该锥形瓶内逐滴加入甲基丙烯酸酐共计16mL，整个滴加过程持续1h。滴加结束2h后，将预热至50℃的800mL PBS加入到上述锥形瓶中，再持续搅拌15min。15min后将锥形瓶内的液体倒入截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析一天。第二天，收集透析袋内的液体，在37℃、7000rpm条件下进行离心，并取上清液，在37℃下继续透析三天。之后，将液体预热至60℃，用孔径为0.22μm的微孔滤膜趁热对其进行过滤，将过滤所得的液体放置于-80℃预冻过夜，进行冷冻干燥，得到GelMA材料，反应产物最终保存在-20℃。
(二)GelMA的核磁表征
为了验证GelMA的合成，利用BrukerAdvance 600MHz核磁共振仪来测所得产物的核磁氢谱(1H NMR)(见图2)。与明胶相比较，GelMA的图谱在5-6ppm显示了对应接枝的甲基丙烯酰基中赖氨酸和羟基赖氨酸基团的峰；3ppm处峰的减弱表明赖氨酸基团的修饰；而1.8ppm处峰则对应着甲基丙烯酰基中的甲基。因此，核磁氢谱可以证明GelMA的成功合成。
实施例2、水凝胶的配制
称取50mg(5wt％)实施例1制备的GelMA加入到1ml去离子水中，加热至50℃保持1小时，进行溶解。待充分溶解后加入5mg光引发剂LAP，充分溶解后，避光存储备用。
实施例3、微流控装置的制备
本发明利用共轴毛细管微流控装置来制备油包水型(water-in-oil,W/O)水凝胶微液滴(其原理示意图见图3)，即利用油相流体作为连续相来剪切水相使其分散在油相中形成微液滴，其中原理是在连续相流体剪切分散相流体时，当剪切力大于两相的界面张力时，分散相在两相交界处被剪切为单个分散的液滴。本发明利用自制的玻璃毛细管设计制作适合于产生水凝胶微球的微流控装置，其制作方法简单，所产生水凝胶微球具有尺寸可控、单分散性好、重复率高等特点。
上述共轴毛细管微流控装置的具体制作方法如下：
(一)毛细玻璃管的准备
主要制作步骤包括：毛细玻璃管的拉磨、玻璃管的亲疏水性修饰以及玻璃管的组装。用玻璃切割刀将毛细管切至适宜长度，然后用微电极拉制仪或乙炔喷灯将玻璃管口烧拉，使管口成为锥形，有一定程度缩窄，使其便于嵌套组装。经过拉制的毛细管还可以用砂纸打磨进一步调整管口尺寸，并使其平整光滑，接着用氮气吹走残留在管口的碎屑，然后浸泡在乙醇中超声，清洗干燥，备用。拉磨清洗后的玻璃毛细管可根据需要进行亲疏水修饰，从而避免溶液粘连毛细管内壁，或者乳液贴壁而无法成功乳化。采用十八烷基三甲氧基硅烷(trimethoxyoctadecyl-silane)对微通道进行疏水性处理。
(二)玻璃微流控装置的制作
本实施例中提供的玻璃毛细管微流控装置如图4所示，包括：①载玻片，用于支撑和固定玻璃毛细管以及进样针头；②内相毛细管，两端连接进样针头，一端用于注入内相溶液，另一端按钮经过拉制具有缩窄口，伸入外相玻璃毛细管，即内相溶液的出口；③外相收集管，一端连接内相毛细管并用于注入外相溶液，另一端连接收集软管；④收集软管，产生的乳液经过收集管进入收集容器；⑤进样针头。组装玻璃毛细管微流控装置的整个过程需在显微镜下操作，以保证同轴。第一步，匹配玻璃毛细管，在载玻片上确定管道的位置，并注意预留进样针头和粘胶的空间；第二步，逐步使用5min环氧树脂胶固定外相收集管、收集软管、内相管，过程在光学显微镜下操作，严格保证整体同轴；第三步，管道固定好之后，将按照管道形状和直径刻好缺口的进样针头固定在指定位置，并用胶水固定来保证其密封性，待胶干后，装置组装完成。
实施例4、水凝胶微液滴的制备
制备水凝胶微液滴的各相溶液如下：内相(水相)为含光引发剂LAP的5wt％的GelMA溶液，外相(油相)为含5wt％表面活性剂(司班80)的石蜡油。玻璃毛细管微流控装置使用前，首先用去离子水将装置内空气排出，从各个进样口依次排气。使用时，通过PE软管将装有溶液的注射器和点样针头连接，注射器置于微量注射泵上，以设定好的速度匀速推动溶液进入微流控装置。通过调节油相和水相的流速，可以控制生成微液滴的大小。将配制的溶液装入注射器，去除多余气泡，减少流体的不稳定。在保证密封的条件下，连接微流控通道各部分。实验过程中，微流控通道应保持水平，减少振动，同样是为了降低流体的不稳定性。
在制备油包水W/O双乳液时，最内相的水相进入与其不相溶的中间油相，在管口形成凸起液滴，受到自身流体的推力作用，连续相流体的剪切作用，表面张力作用以及液体与管壁之间的粘滞作用等。液滴不断长大，当剪切力大于表面张力时，分散相液滴就周期性地因油相剪切而产生。
图5所示为本实施例玻璃毛细管微流控装置运行实物照片，其是采用两台相同型号的微量注射泵来提供稳定的推动力，并连接两支相同型号的注射器，通过PE管与微流控装置相连接，所有部位均需紧密连接以防止泄露。开始实验前，需设置微量注射泵参数，如注射器型号、直径、液体流速等。注射泵开始运行，调节油相和水相的相对流速，观察微液滴形成情况，待流速稳定、液滴周期性形成且大小均一后，可开始后续微液滴的收集、固化交联等操作。
实施例5、实心水凝胶微球的交联固化
将按照上述方法得到的水凝胶微液滴进行收集，并立即用紫外灯照射5分钟，即可完成GelMA的交联，得到实心的水凝胶微球。将固化交联好的水凝胶微球置于共聚焦培养皿中，用光学显微镜对微球的形态和粒径进行观察。其中，水凝胶微球的粒径可通过调节水相、油相的相对流速来进行调节。本实施例中将水相的速度固定在20μL/min，通过调节油相的流速来控制油/水相的流速比。如图6所示，通过自制微流控设备可得到形貌光滑、粒径分布均一、粒径可调的水凝胶微球。其中，具体油/水相的流速比对微球粒径的影响如图7所示。随着油相流速的增高，油相对水相的剪切力越大，生成的微球也越小。本发明可实现粒径100-500μm微球的制备和调控。
实施例6、多孔水凝胶微球的制备
为制备多孔水凝胶微球，将实施例4中得到的水凝胶微液滴收集在温度为-20℃的低温装置里，使得微液滴中的水分形成冰晶。本发明所述低温装置为温度可控的内部充满乙醇的低温槽，开始收集之前，先将收集皿置于低温槽内预冷，待温度稳定之后开始收集。水凝胶微液滴在低温下形成冰晶，因而在不交联的情况下也能维持微球形态，球与球之间不会发生融合。待冰晶形成完全之后，温度保持在-20℃，在紫外灯下进行固化交联，交联完全后置于室温，冰晶融化，冰晶占取的位置形成孔隙，即可生成多孔水凝胶微球(见图8)。图9所示为光镜下实心微球(A)和多孔微球(B)的照片，与实心微球相比，可以观察到多孔微球明显的孔隙微结构，其中孔隙均匀分布在整个微球，并且尺寸均一。
实施例7、水凝胶微球溶胀性能测试
为检测水凝胶微球的溶胀性能，分别将制备好的实心、多孔水凝胶微球表面石蜡油拭去并置于24孔板内在光学显微镜下观察，计算此时微球平均体积为V0，然后分别加入2mL的去离子水以及pH＝7.4的PBS。溶胀24小时后，再次将孔板置于光学显微镜下观察并计算此时微球平均体积为VSwelling。溶胀率计算公式如下：
Swelling Ratio＝VSwelling/V0
两种水凝胶微球在去离子水和PBS环境下的溶胀率结果如图10所示。其中实心水凝胶微球在水和PBS中的溶胀率分别为3.20±0.5和1.57±0.12，而多孔水凝胶微球在水和PBS中的溶胀率分别为1.00±0.07和1.27±0.12。
实施例8、微球的洗涤过程
利用微流控法制备水凝胶微球涉及到油相，因而微球制备成功之后很重要的步骤是将附着在微球表面以及多孔微球内部的石蜡油和表面活性剂洗掉。本发明使用两种方法进行洗涤：方法一，利用乙醚萃取石蜡油：(1)将收集好交联完全的微球转移至50mL离心管并尽量洗干净上层漂浮的石蜡油；(2)加入15mL去离子水和15mL乙醚；(3)将离心管颠倒混匀后静置沉淀，液体开始分为三层，其中上层为乙醚，中层为石蜡油，下层则为含有水凝胶微球的水；(4)静置分层完毕后，吸取上层乙醚，再加入适量乙醚，重复上述步骤，直至油相完全被乙醚萃取；(5)将上部液体全部吸取，用去离子水进行清洗。方法二，利用丙酮溶解石蜡油：(1)将收集好交联完全的微球转移至50mL离心管并尽量洗干净上层漂浮的石蜡油；(2)加入20mL丙酮，剧烈震荡后静置，待微球沉入底部后，去除上层液体；(3)重复上述步骤两次，直至石蜡油被清洗干净；(4)将丙酮尽量去除干净后，加入20mL去离子水，按照上述步骤清洗三次。注意：整个步骤在通风橱内操作；清洗好的微球4℃冰箱保存备用。
实施例9、多孔水凝胶微球孔隙大小的调控
本发明利用DMSO来实现对孔隙大小的控制。水溶液中DMSO的存在会阻碍冰晶的形成，从而降低溶液的凝固点。本实施例中将含有不同浓度DMSO(m/v)的DMSO与水的混合液置低温环境下，观测其凝固点，结果如图11所示。不含DMSO的水在0℃凝固，加入10％的DMSO使得凝固点略低于0℃，随着DMSO浓度的增高，混合液的凝固点越来越低，50％的DMSO与水混合液的凝固点低于-40℃，可见DMSO对溶液的凝固点有着非常重要的影响。
为考察DMSO对多孔水凝胶微球孔隙大小的影响，本实施例中首先分别配制了含有0％、5％和10％(m/v)DMSO的GelMA溶液，并利用上述微流控装置制成水凝胶微液滴，之后收集于-20℃的低温环境下。当冰晶开始生长后，冰晶周围剩余液体中DMSO浓度增大，凝固点降低至-20℃以下，导致冰晶生长停滞，从而控制冰晶，即孔隙的大小。为了更好的考察微球的微观形貌，本发明将制备好洗好的微球在-80℃预冻后进行冷冻干燥，便于在扫描电子显微镜(SEM)下观察。取少量的冷冻干燥后的水凝胶微球利用导电胶固定在导电板上，利用离子溅射仪进行30s喷金，然后通过SEM(FEI Quanta 250)观察并采集图像。含0％、5％和10％DMSO的GelMA溶液制得的多孔微球的SEM图像如图12所示，其中A-C为微球整体形貌，三种微球都是球状，并呈现多孔状态，未发现局部缺陷或过度交联。为了更好的观察球表面的孔隙，我们还观察了球的局部结构(图12D-F)，发现孔隙形态匀称，孔径大小均一，并且DMSO的加入对孔隙大小影响显著：0％DMSO生成的微球结构最为疏松，平均孔径为～26μm，加入DMSO后微球结构按开始变得致密，平均孔径随着其浓度的升高而降低，当浓度达到10％时，相对平均孔径只有～9μm(图13)。
实施例10、共聚焦显微镜考察微球形貌
冷冻干燥的过程会对水凝胶的结构产生影响，不能反映其真实形貌。为了更好地了解多孔水凝胶微球的结构，本实施例中利用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710)来观察微球的形貌。
为了制备共聚焦可以观察到的样品，本实施例首先合成了荧光修饰的GelMA材料，合成步骤如下：(1)将10mg荧光素-5-异氰酸酯溶于0.1mL DMSO中；(2)将200mg GelMA在60℃环境下溶于3.9g盐酸盐缓冲溶液(CBS)中；(3)在60℃环境下将上述两种溶液混合，反应1小时；(4)反应完成后，将反应液在37℃环境下透析三天，之后冷冻干燥，保存在-20℃备用。
将用荧光修饰的GelMA依次按照实施例2、5、7、8方法配制水凝胶溶液、利用微流控装置制备水凝胶微液滴、制备多孔微球、以及洗球，将得到的多孔水凝胶微球置于共聚焦皿中，在共聚焦显微镜下进行观察并采集图像，结果如图14所示。三种微球的微观孔隙清晰可见，孔隙大小随着DMSO浓度的增大而减小，与我们的设想以及扫描电镜的结果一致。
实施例11、水凝胶微球细胞毒性检测
分别收集GelMA实心微球和多孔微球96小时的浸出液，检测其对HUVEC细胞活力的影响。使用各组的浸出液在96孔板上培养HUVEC细胞(1000细胞/孔)，在培养的第1、4、7天使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测细胞的活力。具体过程为：去除培养液，用PBS清洗2次，接着向每个样本中加入100μL培养基和10μL CCK-8试剂，放入37℃培养箱2小时。最后用酶标仪在450nm波长下读出吸光度的数值。结果如图15所示，与对照组(PBS)相比，实心微球和多孔微球浸出液培养的细胞增殖正常，各组之间没有显著差异，证明材料生物相容性优异，没有细胞毒性。
实施例12、水凝胶微球的细胞培养
为了探究实心和多孔水凝胶微球负载细胞的能力以及细胞在球上的生长情况，本实施例中将微球与HUVEC细胞共混培养，并进一步评估细胞活力。开始细胞实验前，分别将两种微球在紫外灯下灭菌48小时，置于细胞培养板内，加入等量细胞悬液(10000细胞/孔)，置于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱内进行培养。为评估细胞在微球上的生长情况，在共培养期间的第1，4，7天取载细胞微球，分别进行活死细胞荧光染色、细胞骨架和细胞核荧光染色，并在共聚焦显微镜下进行观察评估。
其中，活死细胞染色的步骤为：(1)将5μL钙黄绿素和20μL溴乙非啶豪莫二聚体加入10mLPBS中，来配制活死染色溶液；(2)吸掉孔板中培养液，用PBS清洗负载细胞的微球3次，最后吸掉PBS；(3)每个孔板加入200μL上述活死染色溶液，室温孵育30分钟；(4)去除染色溶液，PBS清洗3次，室温遮光保存备用。
细胞骨架和细胞核荧光染色的步骤为：(1)将鬼笔环肽储存液用PBS稀释至200nM备用，配制4％多聚甲醛作为固定液备用；(2)吸掉孔板中培养液，用PBS清洗负载细胞的微球3次，最后吸掉PBS；(3)加入4％多聚甲醛进行细胞固定，室温固定15分钟后用PBS清洗3次；(4)用0.5％Triton X-100溶液透化处理5分钟并用PBS清洗3次；(5)将200μL配制好的鬼笔环肽工作液加入孔板内，室温避光孵育30分钟，用PBS清洗3次；(6)加入200μL4、6-二氨基-2-苯并吲哚二乳酸酯(DAPI)来标记细胞核，室温避光孵育5分钟；(7)去除染色溶液，PBS清洗3次，室温遮光保存备用。
将荧光染色的样品置于共聚焦显微镜下进行观察，结果如图16所示。其中上、下排分别为实心水凝胶微球和多孔水凝胶微球负载细胞的活死染色和骨架/细胞核染色。可以看到细胞活力及在微球上的形态正常，细胞在微球上随时间增殖，测试的三个时间点(1、4、7天)多孔微球上的细胞都比实心微球上要多。证明由于多孔微球的特殊结构，细胞更容易附着在表面并且向内生长，有利于携载更多的细胞，在组织工程等方面有着更加广泛的应用。
为了验证水凝胶微球负载不同细胞的能力，本实施例中将微球与成纤维细胞共混培养，并进一步评估细胞活力，具体实验步骤与以上描述相同。共聚焦显微镜结果如图17所示，其中A和B分别为实心水凝胶微球和多孔水凝胶微球负载细胞的活死染色和骨架/细胞核染色。与负载内皮细胞类似，细胞在微球上随时间增殖，测试的三个时间点(1、4、7天)多孔微球上的细胞都比实心微球上要多。证明多孔微球负载细胞能力相比较实心微球有着显著的提高，并且可实现不同细胞的负载。

Claims (7)

1.一种微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将水凝胶材料、缓冲液和光引发剂混合，得到水凝胶溶液，向该水凝胶溶液中加入二甲基亚砜，所述二甲基亚砜的浓度按与水凝胶溶液的质量体积比为0~10 % m/v，得到水相溶液；将油性材料与表面活性剂混合，得到油相溶液；
（2）将步骤（1）所述水相溶液和油相溶液加入微流控装置，制备得到水凝胶微液滴；
（3）对步骤（2）所得水凝胶微液滴进行-20℃以下的低温处理，使得水凝胶微液滴中的水分形成冰晶；待冰晶形成完全之后，维持相同的低温环境，在紫外光照射下进行固化交联，交联完全后进行升温，使冰晶融化后形成孔隙，即得到多孔水凝胶微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述水凝胶材料选自透明质酸水凝胶、纤维素水凝胶、海藻酸盐水凝胶、胶原蛋白水凝胶、聚酯类水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯水凝胶、透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺水凝胶或不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述光引发剂选自LAP、Irg.184、Irgacure2959、三乙醇胺或者二苯甲酮中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述油性材料选自全氟油、矿物油、硅油、石蜡油和豆蔻酸异丙酯中的一种或多种；所述表面活性剂包括脂肪酸山梨坦、烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯和聚山梨酯中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述水相溶液和油相溶液是在微流控装置中通过流动剪切力的作用形成油包水形态的水凝胶微液滴。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述水相溶液的流速为10～100μL/min，所述油相溶液的流速为50～800 μL/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述紫外光照射的时间为10～30s；所述升温至温度为10~30℃。
CN202011339217.7A 2020-11-25 2020-11-25 微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用 Active CN112409553B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011339217.7A CN112409553B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011339217.7A CN112409553B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112409553A CN112409553A (zh) 2021-02-26
CN112409553B true CN112409553B (zh) 2023-03-14

Family

ID=74842344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011339217.7A Active CN112409553B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112409553B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115894964A (zh) * 2021-09-23 2023-04-04 四川大学 光固化多孔水凝胶细胞制剂及其制备方法
CN114028618A (zh) * 2021-10-25 2022-02-11 广东普洛宇飞生物科技有限公司 一种基于羊膜基底膜的生物材料及其制备方法和应用
CN115227869B (zh) * 2022-08-15 2023-07-21 浙江大学 一种具有神经干细胞移植和信号传导增强功能的人工耳蜗电极及其制备方法
CN117771445A (zh) * 2023-05-16 2024-03-29 上海市第十人民医院 一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102757517A (zh) * 2011-04-28 2012-10-31 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于微流控技术制备快速响应温敏多孔微球的方法
CN105153440A (zh) * 2015-07-10 2015-12-16 南雄阳普医疗科技有限公司 一种葡聚糖微球凝胶的制备方法
CN109880151A (zh) * 2019-02-21 2019-06-14 上海市伤骨科研究所 一种水凝胶多孔微球的制备方法与多孔支架材料

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10864520B2 (en) * 2015-07-22 2020-12-15 The University Of North Carolina At Chapel Hill Fluidic devices with freeze-thaw valves with ice-nucleating agents and related methods of operation and analysis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102757517A (zh) * 2011-04-28 2012-10-31 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于微流控技术制备快速响应温敏多孔微球的方法
CN105153440A (zh) * 2015-07-10 2015-12-16 南雄阳普医疗科技有限公司 一种葡聚糖微球凝胶的制备方法
CN109880151A (zh) * 2019-02-21 2019-06-14 上海市伤骨科研究所 一种水凝胶多孔微球的制备方法与多孔支架材料

Also Published As

Publication number Publication date
CN112409553A (zh) 2021-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112409553B (zh) 微流控冰晶法制备可注射多孔水凝胶微球的方法及其应用
CN105641743B (zh) 一种微流控装置及利用该装置制备微凝胶的方法
Yin et al. Agarose particle-templated porous bacterial cellulose and its application in cartilage growth in vitro
EP3227116B1 (en) 3d printing using phase changing materials as support
JP6882449B2 (ja) 内部を固定した脂質小胞
Salem et al. Porous polymer and cell composites that self‐assemble in situ
US5629191A (en) Method of making a porous matrix particle
Mazzitelli et al. Preparation of cell-encapsulation devices in confined microenvironment
Rojek et al. Microfluidic formulation of topological hydrogels for microtissue engineering
US20180258382A1 (en) Apparatus for culturing and interacting with a three-dimensional cell culture
WO2015178427A1 (ja) 中空マイクロファイバ
Zhang et al. Bioink design for extrusion-based bioprinting
CN111201047A (zh) 组织构建体、其生产和使用方法
Paterson et al. Porous microspheres support mesenchymal progenitor cell ingrowth and stimulate angiogenesis
CN113559328B (zh) 一种生物墨水及其制备方法
CN109806919B (zh) 一种3d细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法
CN107412877B (zh) 一种磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的制备方法及其应用
Jansen et al. Hydrogel-based cell therapies for kidney regeneration: current trends in biofabrication and in vivo repair
CN114796617B (zh) 一种复合3d打印墨水及其应用
JP2019506884A (ja) 細胞化した足場の３ｄプリント
CN205549077U (zh) 一种用于制备微凝胶的微流控装置
WO2005014774A1 (ja) 動物細胞の培養担体と、該培養担体を用いた動物細胞の培養方法および移植方法
Mohajeri et al. Cell encapsulation in alginate-based microgels using droplet microfluidics; a review on gelation methods and applications
CN111410766A (zh) 一种分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法
Cheng et al. Injectable composite hydrogels encapsulating gelatin methacryloyl/chitosan microspheres as ARPE-19 cell transplantation carriers

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220302

Address after: 310000 room 112, block D, 79 Jinyi Road, Xiaoshan Economic and Technological Development Zone, Hangzhou City, Zhejiang Province

Applicant after: Hangzhou Xianshi Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 310000 room B611, building 1, No.209, No.3 street, Qiantang New District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Applicant before: Hangzhou Shudao Biotechnology Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant