CN109806919B

CN109806919B - 一种3d细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法

Info

Publication number: CN109806919B
Application number: CN201711155388.2A
Authority: CN
Inventors: 秦建华; 王慧; 刘海涛
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2037-11-20
Also published as: CN109806919A

Abstract

本发明提供了一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法。该方法主要包括：明胶甲基丙烯酰胺材料的合成、明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核内细胞负载、细胞3D单独/共培养等。本发明实现一步、可控、制备核壳微球，并用于细胞3D培养，基于材料良好的生物相容性，该发明在细胞培养、微组织模型构建、组织块移植、药物缓释与筛分等生物学应用方面具有极大的应用价值。

Description

一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法

技术领域

本发明涉及材料化学与微流控技术领域，具体涉及一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法。

背景技术

体外构建功能化的组织模型在组织工程、组织块移植、伤口愈合、药物筛分等领域已被广泛关注。在体内，功能化组织涉及多种类型的细胞以及细胞与细胞外基质间的相互作用。此外，在体外构建功能化组织中，细胞外基质也提供了3D支架材料，并用于实现一种或多种细胞的培养。

水凝胶材料作为细胞3D培养支架材料，已经在细胞培养、组织块移植等方面得到了广泛的应用。而目前用到的用于细胞3D培养的水凝胶材料主要分为天然水凝胶材料和人工合成水凝胶材料两种。天然材料主要为明胶、海藻酸盐、胶原等，人工合成的材料主要为聚乙二醇(PEG)材料。无论是天然材料还是人工合成的材料在用于负载细胞时均需考虑到材料的生物相容性、可降解性、机械强度等因素。目前应用最为普遍的是海藻酸盐与明胶，由于其极好的生物惰性与机械强度，在用于细胞负载时形成的微球只是作为3D的支架材料，而缺乏支架材料与细胞之间的相互作用，且海藻酸盐材料降解性差，在用于体内移植时会存在支架材料残留在体内而难降解得问题。而明胶材料因包含许多能促进细胞粘附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列故具有很好的生物相容性；因含有适合细胞重新构造的基质金属蛋白酶(MMP)序列故可降解；因含有很多氨基、羧基、羟基，故可用于修饰嫁接官能团。但由于其低温呈现固态、高温呈现液态的性质，在用于细胞37℃培养时为液态，不能形成稳定的支架材料。然而，明胶用甲基丙烯酸酐修饰后在光引发剂存在的条件下，紫外条照射发生自由基聚合反应，从而将明胶固化，即形成明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料，能很好的用于细胞37℃培养。

传统的微球制备方法主要是悬滴法与机械搅拌法，由于存在可控性差、均一性差的问题而在用于细胞3D培养方面受到限制，随后微孔膜新技术的提出虽然微球粒径的可控性和均一性都很好，但是在小体系下做到粒径的可控性和均一性还相对较差。而微流控体系因其在微米尺度下对流体精确控制的特点能韩浩解决传统技术存在的瓶颈问题。当前，基于微流控技术制备的明胶甲基丙烯酰胺材料，用于细胞3D培养主要是实心微球内负载细胞，而实心微球用于细胞3D培养存在流体剪切力对细胞的损伤、细胞在微球内生长的不可控、等缺点，所以核壳微球的构建解决了以上问题。本发明基于微流控技术提出制备明胶甲基丙烯酰胺核壳微球并用于细胞3D培养。

发明内容

本发明提供了一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，致力于提出一种将生物相容性很好水凝胶材料用于细胞3D单独/共培养的的方法。

本发明一种微流控芯片，主要由连续相入口、壳流体入口、核流体入口、微球出口、连续相通道、壳流体通道、核流体通道、层流通道及主通道组成连续相入口通过连续相通道与主通道连接，壳流体入口、核流体入口分别通过壳流体通道、核流体通道均与层流通道及主通道连接。

所述的微流控芯片，连续相通道、壳流体通道、核流体通道、层流通道、主通道宽度范围均为100-500μm，芯片各部分通道高度范围为50-400μm，主通道长1-2cm，层流通道长范围为0.5-1.5mm。

一种微流控芯片的制备方法，该微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为洁净的玻璃片。PDMS层和玻璃片分别用等离子体处理15s进行封接，通道用1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷疏水处理。所述1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷浓度为0.5％-5％。

本发明一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，采用上述微流控芯片，具体包括下列步骤：

(1)明胶甲基丙烯酰胺材料的合成：将明胶溶于DPBS溶液，然后加入甲基丙烯酸酐溶液，之后加入DPBS溶液来终止反应；随后用去离子水透析，接着将以上透析液过滤，最后将滤液冻干数天从而得到多孔的明胶甲基丙烯酰胺材料；

所述所述DPBS配制成分为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.15g，KH₂PO₄0.2g于1L蒸馏水中，明胶浓度为0.01-0.2g/mL，甲基丙烯酸酐溶液浓度5％-10％，

所述明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为5:4，甲基丙烯酸酐与首次加入的DPBS体积比为2:25，先后两次加入的DPBS体积比为1:4，甲基丙烯酸酐加入速率为0.5mL/min。透析时间为1-10天，过滤器孔径为0.22-8μm，冻干天数为1-10天；

(2)明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核内细胞负载：将甲基纤维素溶于DPBS中制得甲基纤维素溶液备用，将步骤(1)中制备的多孔明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料和光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于DPBS中制得明胶甲基丙烯酰胺混合液备用；

一种或多种细胞经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的甲基纤维素溶液充分混匀，得到细胞密度为10⁴-10¹⁰个/ml的悬液，最终得到悬有细胞的甲基纤维素溶液，通过微流控芯片的核流体入口通入到核流体通道中，

将溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺混合液从壳流体入口通入到壳流体通道中，通过调节流速使得两种水溶液在层流通道中形成稳定的层流，

再由连续相入口通入的含span80的矿物油将层流截断，形成负载细胞的液滴，液滴在微球出口处经过紫外光固化，即形成含有固化的壳及负载细胞的核结构的微球；通过核流速、壳流速、连续相流速的调节，控制微球核尺寸、壳厚度以及微球整体大小等参数；

所述甲基纤维素溶液浓度为1％-10％；2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮浓度为0.5％-5％，明胶甲基丙烯酰胺浓度为4％-30％，悬有细胞的甲基纤维素溶液浓度为0.5％-5％，span80浓度为0.1％-10％，

所述紫外固化光强度为58J/cm²，固化时间为10-25s；核流速范围：0.01-20μL/min，壳流速范围：0.01-60μL/min，连续相流速范围：1-80μL/min。

(3)细胞3D单独/共培养：经过上述步骤制备的核中负载一种或多种细胞的微球可以经过离心收集，离心速率300-800rpm，1-3min，后直接转移到培养基中进行3D单独/共培养，培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征。

本发明实现一步、可控、制备核壳微球，并用于细胞3D培养，基于材料良好的生物相容性，该发明在细胞培养、微组织模型构建、组织块移植、药物缓释与筛分等生物学应用方面具有极大的应用价值。

附图说明

图1是明胶甲基丙烯酰胺核壳微球芯片示意图。

其中，1代表连续相入口；2代表壳流体入口；3代表核流体入口；4代表微球出口；5代表连续相通道；6代表壳流体通道；7代表核流体通道；8代表层流通道；9代表主通道。

图2是实例1中不含细胞的水凝胶微球的表征图，其中：a是明场表征图(标尺：200μm)；b是SEM表征图。

图3是实施例1中核负载HepG2细胞的水凝胶微球，其中：a是核内负载细胞第一天的明场表征图(标尺：400μm)；b是负载的细胞在十五天内的死活情况统计表征图。

图4是实施例2中核中负载HepG2和HUVEC细胞的水凝胶微球，其中：a是核内负载两种细胞第一天的明场表征图(100x视野，标尺：200μm)；b是核内负载两种细胞第三天的明场表征图(100x视野)；c是核内负载两种细胞第五天的明场表征图(100x视野)。

具体实施方式

在体系中加入细胞悬液，并通过层流技术及油水不相容原理，可控地形成均一、稳定的细胞分区负载液滴，然后在紫外灯照射下，水凝胶预聚体经过自由基反应快速交联形成含固化的壳和水溶液的核结构的3D微球，通过对微球核内负细胞并进行体外3D培养可进一步形成微组织。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

本发明一种其微流控芯片，如图1所示，主要由连续相入口1、壳流体入口2、核流体入口3、微球出口4、连续相通道5、壳流体通道6、核流体通道7、层流通道8及主通道9组成；连续相入口1通过连续相通道5与主通道8连接，壳流体入口2、核流体入口3分别通过壳流体通道6、核流体通道7均与层流通道8及主通道9连接；

所述的微流控芯片，连续相通道高度和宽度分别为310μm、270μm，壳流体通道高度和宽度分别为150μm、150μm，核流体通道高度和宽度分别为150μm、130μm，层流通道高度和宽度分别为150μm、150μm，主通道高度和宽度分别为310μm、350μm，主通道长1cm，层流通道长为1mm。

芯片的制备及修饰：所述的微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为洁净的玻璃片。PDMS层和玻璃片分别用等离子体处理15s进行封接，通道用2％的1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷疏水处理。

所述DPBS配制成分为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.15g，KH₂PO₄ 0.2g于1L蒸馏水中，明胶浓度为0.2g/mL，甲基丙烯酸酐溶液浓度5％，

所述明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为5:4，甲基丙烯酸酐与首次加入的DPBS体积比为2:25，先后两次加入的DPBS体积比为1:4，甲基丙烯酸酐加入速率为0.5mL/min。透析时间为7天，过滤器孔径为0.45μm，冻干天数为3天；(2)明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核内细胞负载：将甲基纤维素溶于DPBS中制得甲基纤维素溶液备用，将步骤(1)中制备的多孔明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料和光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于DPBS中制得明胶甲基丙烯酰胺混合液备用；

一种细胞(HepG2细胞)经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的甲基纤维素溶液充分混匀，得到细胞密度为9×10⁶个/mL的悬液，最终得到悬有细胞的甲基纤维素溶液，通过微流控芯片的核流体入口3通入到核流体通道7中，

将溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺混合液从壳流体入口2通入到壳流体通道6中，通过调节流速使得两种水溶液在层流通道8中形成稳定的层流，

再由连续相入口1通入的含span80的矿物油将层流截断，形成负载细胞的液滴，液滴在微球出口处4经过紫外光固化，即形成含有固化的壳及负载细胞的核结构的微球；通过核流速、壳流速、连续相流速的调节，控制微球核尺寸、壳厚度以及微球整体大小等参数；

所述甲基纤维素溶液浓度为2％，悬有细胞的甲基纤维素溶液浓度为1％，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的浓度为1％，明胶甲基丙烯酰胺溶液浓度为8％；span80浓度为2％，紫外固化光强度为58J/cm²，固化时间为20s；核流速：2μL/min，壳流速：2μL/min，连续相流速：20μL/min。,

(3)细胞3D单独养：经过上述步骤制备核中的负载一种细胞(HepG2细胞)的微球可以经过离心收集，离心800rpm，3min，后直接转移到培养基中进行培养，培养期间每天换液一次，保证细胞营养，期间对微球核内负载HepG2细胞的培养生长情况进行表征，如图3所示。不含细胞的水凝胶微球的表征图如图2所示。

实施例2

所述的微流控芯片，连续相通道5高度和宽度分别为310μm、270μm，壳流体通道6高度和宽度分别为150μm、150μm，核流体通道7高度和宽度分别为150μm、130μm，层流通道8高度和宽度分别为150μm、150μm，主通道9高度和宽度分别为310μm、350μm，主通道9长1cm，层流通道8长为1mm。

本发明一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，采用上述芯片，具体包括下列步骤：

所述所述DPBS配制成分为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.15g，KH₂PO₄0.2g于1L蒸馏水中，明胶浓度为0.2g/mL，甲基丙烯酸酐溶液浓度5％，

所述明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为5:4，甲基丙烯酸酐与首次加入的DPBS体积比为2:25，先后两次加入的DPBS体积比为1:4，甲基丙烯酸酐加入速率为0.5mL/min。透析时间为7天，过滤器孔径为0.45μm，冻干天数为3天；

两种细胞(HepG2细胞和HUVEC细胞)经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的甲基纤维素溶液充分混匀，得到细胞密度为9×10⁶个/ml的悬液，最终得到悬有细胞的甲基纤维素溶液，通过微流控芯片的核流体入口3通入到核流体通道7中，

所述甲基纤维素溶液浓度为2％，悬有细胞的甲基纤维素溶液浓度为1％，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的浓度为1％，明胶甲基丙烯酰胺浓度为8％；span80浓度为2％，紫外固化光强度为58J/cm²，固化时间为20s；核流速：2μL/min，壳流速：2μL/min，连续相流速：20μL/min。

(3)细胞3D共培养：经过上述步骤制备的核中负载2种细胞(HepG2细胞和HUVEC细胞)的微球可以经过离心收集，离心800rpm，3min，后直接转移到培养基中进行培养，培养期间每天换液一次，保证细胞营养，期间对2种细胞3D共培养生长情况进行表征，如图4所示。

Claims

1.一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于采用微流控芯片，按照以下步骤进行：

（1）明胶甲基丙烯酰胺材料的合成：将明胶溶于 DPBS溶液，然后加入甲基丙烯酸酐溶液，之后加入DPBS溶液来终止反应；随后用去离子水透析，接着将以上透析液过滤，最后将滤液冻干数天从而得到多孔的明胶甲基丙烯酰胺材料；

（2）明胶甲基丙烯酰胺核壳微球核内细胞负载：将甲基纤维素溶于DPBS中制得甲基纤维素溶液备用，将步骤（1）中制备的多孔明胶甲基丙烯酰胺水凝胶材料和光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于DPBS中制得明胶甲基丙烯酰胺混合液备用；

一种或多种细胞经消化后，加入体积比为1:1的培养基与以上配好的甲基纤维素溶液充分混匀，得到细胞密度为10⁴-10¹⁰个/ml的悬液，最终得到悬有细胞的甲基纤维素溶液，通过微流控芯片的核流体入口（3）通入到核流体通道（7）中；

将溶有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的明胶甲基丙烯酰胺混合液从壳流体入口（2）通入到壳流体通道（6）中，通过调节流速使得两种水溶液在层流通道（8）中形成稳定的层流；

再由连续相入口（1）通入的含 span80的矿物油将层流截断，形成负载细胞的液滴，液滴在微球出口处（4）经过紫外光固化，即形成含有固化的壳及负载细胞的核结构的微球；通过核流速、壳流速、连续相流速的调节，控制微球核尺寸、壳厚度以及微球整体大小及其他参数；

（3）细胞3D单独/共培养：经过上述步骤制备的负载细胞的微球可以经过离心收集，离心速率300-800 rpm，1-3 min，后直接转移到培养基中进行培养，培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间进行相关生物学表征；

所述微流控芯片主要由连续相入口（1）、壳流体入口（2）、核流体入口（3）、微球出口（4）、连续相通道（5）、壳流体通道（6）、核流体通道（7）、层流通道（8）及主通道（9）组成；连续相入口（1）通过连续相通道（5）与主通道（9）连接，壳流体入口（2）、核流体入口（3）分别通过壳流体通道（6）、核流体通道（7）与层流通道（8）及主通道（9）连接；连续相通道（5）、壳流体通道（6）、核流体通道（7）、层流通道（8）、主通道（9）宽度范围均为100-500 μm，芯片各部分通道高度范围为50-400 μm，主通道（9）长1-2 cm，层流通道（8）长范围为0.5-1.5 mm。

2.按照权利要求1所述3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于所述的微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为洁净的玻璃片；PDMS层和玻璃片分别用等离子体处理15s进行封接，通道用1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷疏水处理；所述1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷浓度为0.5%-5%。

3.按照权利要求1所述的一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述DPBS配制成分为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄1.15g，KH₂PO₄0.2g溶于1L蒸馏水中。

4.按照权利要求1所述的一种用于细胞3D培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤（1）所述明胶浓度为0.01~0.2g/mL，甲基丙烯酸酐溶液浓度5%-10%，所述明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为5:4，甲基丙烯酸酐与首次加入的DPBS体积比为2:25，先后两次加入的DPBS体积比为1:4，甲基丙烯酸酐加入速率为0.5 mL/min。

5.按照权利要求1所述的一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤（1）透析时间为1-10天，过滤器孔径为0.22-8 μm，冻干天数为1-10天。

6.按照权利要求1所述的一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤（2）所述甲基纤维素溶液浓度为1%-10%，悬有细胞的甲基纤维素溶液浓度为0.5%-5%，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮浓度为0.5%-5%，明胶甲基丙烯酰胺浓度为4%-30%，span80浓度为0.1%-10%，紫外固化光强度为58J/cm²，紫外固化时间为10-25s。

7.按照权利要求1所述的一种3D细胞培养的明胶甲基丙烯酰胺核壳微球的制备方法，其特征在于步骤（2）核流速范围：0.01-20 μL/min，壳流速范围：0.01-60 μL/min，连续相流速范围：1-80 μL/min。