CN114949348B - 藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种壳‑核结构的藻酸盐‑载hDPSCs的GelMA纤维微球及其制备方法，壳结构由凝胶化的藻酸盐构成；核结构由GelMA纺丝纤维片段与hDPSCs共同构成，不同GelMA纺丝纤维片段，在交叉接触的位点发生交联聚合，形成具有孔隙的GelMA纤维微球，hDPSCs均匀分布于孔隙中。其中，壳结构能够保证GelMA纤维微球间的独立性，可有效的解决现有利用GelMA微球制备细胞支架材料时存在的GelMA微球团聚问题。而作为核结构的GelMA纤维微球是由GelMA纺丝纤维片段自身搭建起来的，具有疏松的多孔网状结构，这为搭载细胞提供了适当的包裹和充足的附着位点，细胞能够分布于整个GelMA纤维微球，并为细胞的增殖迁移、新组织和血管的形成提供更多的空间，和更丰富的营养交换孔隙，极大的提升了细胞存活率。

Description

藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球及其制备方法。

背景技术

牙髓组织是牙齿的重要组成部分，由神经、血管、淋巴管及结缔组织组成，有多种包括成牙本质细胞、成纤维细胞、具有多向分化潜能的干细胞及免疫细胞在内的细胞分布，为牙齿提供营养、感觉以及防御等功能。其四周为坚硬的牙本质包围，与下方的牙周组织仅通过一狭窄的根尖孔相连，是牙髓与外界进行营养与废物交换的主要途径。牙髓的独特结构使得其抵御外界伤害的能力极弱，一旦发生炎症，如深龋、外伤及根尖周疾病引起的牙髓感染，最终坏死的可能性极大，而其自我修复的潜力十分有限。应对牙髓疾患，目前普遍使用的治疗方法为根管治疗，即用非天然材料填充去除坏死组织和感染物的根管，以阻绝病变进一步蔓延，对于消炎止痛是最佳选择。然而，剩余的牙体组织因失去了牙髓的支持而变脆易折，又因为缺乏修复性牙体组织的形成，剩余牙体组织的寿命和功能都大打折扣。

细胞疗法为不可逆转的组织损伤和病变提供了新的治疗思路，通常在实际应用中，往往需要数量巨大的组织细胞，在众多递送细胞的支架材料中，微球以其比表面积大、可注射性，制备途径多样、材料来源丰富等优越的性能在再生领域中受到广泛研究。

目前常见应用于牙髓再生的微球有聚合材料和天然材料，其中聚合材料中聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、左旋聚乳酸(PLLA)曾受到广泛研究，但研究发现，其酸性降解物带来的酸性环境不利于植入的细胞生存，甚至会引起周围组织的炎症，此外，这些聚合材料的降解速率极慢，也不利于组织的再生与重建。

天然材料中，GelMA材料生物相容性很高，细胞可以很好的在其中增殖、分化并分泌细胞外基质等蛋白，并且在体内生物降解效果较好。有学者通过静电液滴法制备出载有hDPSCs的GelMA微球，将其置入牙本质小管中并植入免疫缺陷小鼠皮下，验证了其生成牙髓样组织的能力。然而，在载hDPSCs的GelMA微球体外培养的过程中，细胞会逐渐聚集分布于微球的表面，而中心部位不再有活细胞分布，此外，微球会逐渐相互粘接成一整个团块，影响注射效果。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种具有壳-核结构的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球及其制备方法，其中，壳结构能够保证GelMA纤维微球间的独立性，可有效的解决现有利用GelMA微球制备细胞支架材料时存在的GelMA微球团聚问题，同时，壳层在进入接收液时即固化，有助于核相在未光交联时维持微球形态，此外，在静电液滴法制备过程中，由于有壳层液体的包裹，能有效减少因液体飞溅导致的细胞浪费，很大程度上减少细胞损失；而作为核结构的GelMA纤维微球是由GelMA纺丝纤维片段自身搭建起来的，具有疏松的多孔网状结构，极大的提高了GelMA微球内部的孔隙率，细胞能够分布于整个GelMA纤维微球，材料的空间利用率大大提升。多孔的GelMA纤维微球结构特性，为搭载细胞提供了适当的包裹和充足的附着位点，为细胞的增殖迁移、新组织和血管的形成提供更多的空间，极大的提升了细胞存活率。

具体发明内容如下：

第一方面，本发明提供一种藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，所述藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球具有壳-核结构；其中，壳结构由凝胶化的藻酸盐构成；

核结构由GelMA纺丝纤维片段与hDPSCs共同构成，其中，不同所述GelMA纺丝纤维片段，在交叉接触的位点发生交联聚合，形成具有孔隙的GelMA纤维微球，所述hDPSCs均匀分布于所述孔隙中，形成载hDPSCs的GelMA纤维微球。

可选地，所述GelMA纺丝纤维片段的纤维直径为1μm-16μm，所述GelMA纺丝纤维片段的纤维长度为15μm-60μm。

可选地，所述核结构的平均粒径为196-197μm；所述壳结构的平均粒径为311-331μm。

第二方面，本发明提供一种上述第一方面所述的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

S1、用适量的2,2,2-三氟乙醇将冻干的甲基丙烯酰化明胶溶解，得到质量浓度为10％(w/v)的电纺液；

S2、将所述电纺液装入静电纺丝机中，调节电纺参数至合适后，制备得到GelMA纺丝纤维膜；

S3、将所述GelMA纺丝纤维膜浸泡于交联液中，20-24h后，使用PBS缓冲液漂洗被交联液浸泡后的GelMA纺丝纤维膜，得到交联处理后的GelMA纺丝纤维膜；

S4、将所述交联处理后的GelMA纺丝纤维膜放入PBS缓冲液中，进行超声细胞破碎、离心沉淀，得到GelMA纺丝纤维片段；

S5、将所述GelMA纺丝纤维片段、引发剂Lap和hDPSCs混合均匀，得到核相前体溶液；

S6、配置质量浓度为2％w/v的藻酸盐溶液，作为壳相前体溶液；

S7、调节共轴静电液滴设备的相关参数，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球。

可选地，所述步骤S2中，所述调节电纺参数包括：调节推注速度为0.5mL/h，调节电压为25kV，注射器针尖据接收装置距离为15cm，接收装置转速为1000转/分。

可选地，所述步骤S3中，所述交联液由质量体积比为0.47g：0.28g：100mL的EDC、NHS和无水乙醇混合而成。

可选地，所述步骤S5中，所述引发剂是质量浓度为0.25％w/v的Lap；

所述GelMA纺丝纤维片段与所述引发剂Lap的体积比为1:1-2。

可选地，所述核相前体溶液中，所述hDPSCs的浓度为不大于1×10⁷cells/mL。

可选地，所述步骤S7中，调节共轴静电液滴设备的相关参数包括：调节静电正电压为15kV，接受距离为12cm，核层溶液流速为15μL/min，壳层流速为70μL/min，共轴针头内径为25G，外径为16G。

可选地，所述步骤S7中，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球包括：

核相前体溶液与壳相前体溶液在共轴针头出口端，以壳相前体溶液包覆核相前体溶液的形式流出，流出的溶液在高压静电场的作用下，拉长、断裂，落入装有1％w/v氯化钙溶液的接收装置中，外层壳相前体溶液与钙离子交联形成凝胶，进一步对接收装置进行蓝光光照，内层核相前体溶液在蓝光光照和Lap作用下发生交联形成载hDPSCs的GelMA纤维微球。

与相关技术相比，本发明包括以下优点：

本发明提供了一种具有壳-核结构的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球及其制备方法，该壳-核结构中，壳结构由凝胶化的藻酸盐构成；核结构由GelMA纺丝纤维片段与hDPSCs共同构成，并且，GelMA纺丝纤维片段，在交叉接触的位点发生交联聚合，形成具有孔隙的GelMA纤维微球，而hDPSCs则均匀分布于GelMA纤维微球的孔隙中，形成载hDPSCs的GelMA纤维微球。作为核结构的GelMA纤维微球是由GelMA纺丝纤维片自身搭建起来的，具有疏松的多孔网状结构，极大的提高了GelMA微球内部的孔隙率，细胞能够分布于整个GelMA纤维微球，材料的空间利用率大大提升。多孔的GelMA纤维微球结构特性，为搭载细胞提供了适当的包裹和充足的附着位点，为细胞的增殖迁移、新组织和血管的形成提供更多的空间，极大的提升了细胞存活率。而壳结构能够保证GelMA纤维微球间的独立性，有效的解决现有利用GelMA微球为支架材料递送细胞时存在的GelMA微球团聚问题。此外，在静电液滴法制备过程中由于有壳层液体的包裹，能有效减少因液体飞溅导致的细胞浪费，很大程度上减少细胞损失。

附图说明

图1示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的制备方法流程图；

图2示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维膜的SEM图；

图3示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维膜的纤维直径分布图；

图4示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段在光镜下的结构图；

图5示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段的长度分布；

图6示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段的直径分布；

图7示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球在光镜下的结构图；

图8示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球光镜下的结构图；

图9示出了本发明实施例提供的载hDPSCs的GelMA纤维微球的电镜扫描图；

图10示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球和藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的直径分布；

图11示出了本发明实施例提供的载hDPSCs的GelMA纤维微球和载hDPSCs的GelMA实心的直径分布；

图12示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中hDPSCs的存活情况；

图13示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的激光共聚焦显微镜扫描图；

图14示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球d14的子代分布峰图；

图15示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中hDPSCs的形态；

图16示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中干性基因表达情况；

图17示出了本发明实施例提供的体内植入2个月后动物实验结果；

图18示出了本发明实施例提供植入物体内植入8周后的H&E染色结果；

图19示出了本发明实施例提供的体内植入8周后套管内新生牙髓面积定量分析结果；

图20示出了本发明实施例提供的体内植入8周后套管内新生牙髓组化免疫荧光染色结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

本发明旨在提供一种具有壳-核结构的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，及其制备方法，为实现该目的本发明具体实施方式如下：

第一方面，本发明提供一种具有壳-核结构的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，其中，壳结构由凝胶化的藻酸盐构成；核结构由GelMA纺丝纤维片段与hDPSCs共同构成，其中，不同所述GelMA纺丝纤维片段，在交叉接触的位点发生交联聚合，形成具有孔隙的GelMA纤维微球，所述hDPSCs均匀分布于所述孔隙中，形成载hDPSCs的GelMA纤维微球。

具体实施时，组成核结构的GelMA纺丝纤维片段中的醛基基团经过紫外光或蓝光的照射可相互交联，这些交联位点像锚一样可以将材料互相接触的位点彼此固定在一起形成具有贯通孔隙的球体。多孔的GelMA纤维微球结构特性，为搭载细胞提供了适当的包裹和充足的附着位点，细胞能够分布于整个GelMA纤维微球，材料的空间利用率大大提升。此外，贯通孔隙为细胞的增殖迁移、新组织和血管的形成提供更多的空间，能够极大的提升细胞存活率。

进一步地，组成壳结构的凝胶化的藻酸盐能够保证GelMA纤维微球间的独立性，避免GelMA微球为支架材料递送细胞时出现GelMA微球团聚而影响使用效果。并且，在静电液滴法制备过程中，由于有壳层液体的包裹，能有效减少因液体飞溅导致的细胞浪费，很减少细胞损失。

此外，载hDPSCs的GelMA纤维微球保留了水凝胶材料吸水、保水的特性，营养物质能够顺利的在GelMA纤维微球聚合物网络内传递、扩散，有利于搭载细胞的增殖、迁移。

第二方面，本发明提供一种上述第一方面所述的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的制备方法，图1示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的制备方法的流程图，如图1所示，该方法包括：

S1、用适量的2,2,2-三氟乙醇将冻干的甲基丙烯酰化明胶溶解，得到质量浓度为10％(w/v)的电纺液；

S2、将所述电纺液装入静电纺丝机中，调节电纺参数至合适后，制备得到GelMA纺丝纤维膜；

S3、将所述GelMA纺丝纤维膜浸泡于交联液中，20-24h后，使用PBS缓冲液漂洗被交联液浸泡后的GelMA纺丝纤维膜，得到交联处理后的GelMA纺丝纤维膜；

S4、将所述交联处理后的GelMA纺丝纤维膜放入PBS缓冲液中，进行超声细胞破碎、离心沉淀，得到GelMA纺丝纤维片段；

S5、将所述GelMA纺丝纤维片段、引发剂Lap和hDPSCs混合均匀，得到核相前体溶液；

S6、配置质量浓度为2％w/v的藻酸盐溶液，作为壳相前体溶液；

S7、调节共轴静电液滴设备的相关参数，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球。

具体实施时，本实施例制备方法通过结合静电纺丝法和共轴静电液滴法制备得到壳-核结构的藻酸盐-GelMA纤维微球，首先，将GelMA溶液通过静电纺丝装置制备出GelMA纺丝纤维膜，对GelMA纺丝纤维膜进行交联处理后，使用超声细胞破碎仪将纤维膜破碎成GelMA纺丝纤维片段并清洗、离心；用含有引发剂的水溶液将适量GelMA纺丝纤维片段和hDPSCs进行重悬，得到核相前体溶液；进一步以藻酸盐溶液为壳相的前体溶液，通过共轴静电液滴法制备出藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球。

为使本领域技术人员更加清楚地理解本发明，现通过以下实施例对本发明所述的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球及其制备方法进行详细说明。

实验过程中，需对所有需要用到的材料均进行消毒灭菌处理。0.25％引发剂溶液、5％w/v纯GelMA水溶液以及2％w/v藻酸盐水溶液使用0.22μm一次性针头式滤器过滤除菌，将制备得到的GelMA纺丝纤维片段通过75％酒精浸泡过夜并用PBS漂洗3遍。

实施例1：藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的制备

(1)GelMA纤维片段的制备及相关材料学表征

称取1g冻干的GelMA材料(GelMA-60)加入至装有10mL的2,2,2-三氟乙醇的离心管中，将该离心管置于设置为50℃的烘箱中，维持20min后取出稍摇晃，即可得到均匀的10％(w/v)GelMA-三氟乙醇纺丝前体溶液，均匀分成三份分别装进三个10mL针筒，各与24G不锈钢针头相连，并将其固定于静电纺丝机的推注泵上，将锡纸固定到接有负极的接收轴上，将正极接到将三个针头相连接的铁片上。

GelMA纺丝纤维膜的一个重要结构参数是纤维直径，纤维直径的变化主要受到纺丝液浓度、纺丝电压、溶液推注速度以及接收距离等的影响，本实验主要通过调控溶液推注速度来调控纤维直径，经预实验探究发现，在其他纺丝参数保持不变的情况下，推注速度越大，纤维直径越粗，并且随着速度的增加，纺出来的纤维粗细越不均匀，甚至会出现杂丝，且在纺丝过程中，针头处材料凝胶，最终会导致材料的浪费。本实验较优的推注速度为0.5mL/h。

最终确定的电纺参数具体为，最终将推注速度设置为0.5mL/h，纺丝电压设置为25kv，接受轴与针头的距离约为15cm，接受轴的转速设置为1000rpm，进行静电纺丝。

在高电压的作用下，GelMA纺丝液射流拉伸成纳米纤维，随机堆积在带有负电场的接受轴的锡纸上，三氟乙醇溶液在喷射过程中蒸发，最后在接收装置上留下GelMA纺丝纤维膜。

将制备成的GelMA纺丝纤维膜裁剪成0.5cm×0.5cm的片状，通过导电胶固定在样品台上并喷金，在电压为20kv的条件下，通过SEM来观察其表面形貌及其微观结构，并通过粒径分析软件(Nanomeasurer)来测定纤维直径，选取三个视野，测量纺丝纤维直径，并计算平均数。

图2示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维膜的SEM图，如图2所示，GelMA纺丝纤维无序堆叠成膜状，纤维分布较均匀。图3示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维膜的纤维直径分布图，如图3所示，GelMA纺丝纤维膜的纤维平均直径为1.35μm。

(2)GelMA静电纺丝膜的交联

由于GelMA材料可溶解于水，需对其交联处理。将推注速度为0.5mL/h的GelMA纺丝膜从锡纸上揭下，用剪刀将纺丝膜剪成边长约为5cm的正方形小片。

配备GelMA纺丝膜交联液：往100mL无水乙醇中加入0.47g EDC和0.28g NHS，混合均匀后向细胞培养大皿倒入约10mL的交联液，并放入数片剪好的纤维膜，再加入少量交联液，确保纤维膜被交联液覆盖；将大皿置于定轨摇床上，以匀速缓慢摇晃24h后，弃去交联液，并使用PBS缓冲液漂洗3次，每次漂洗时均浸泡5min以充分去除残留的交联液。

(3)GelMA纺丝纤维片段的制备及尺寸表征

为了得到单独的纤维片段，我们选择了超声波破碎法，可以很简便地的将一整块纤维破碎成分布均匀的纤维片段，仅有少量破碎成碎屑状，材料浪费较少，并且超声波破碎适用于大部分玻璃转移温度较高的材料制备成的纤维膜。

将交联漂洗好的推注速度为0.5mL/h的GelMA纤维膜取出，置于盛有80mL PBS缓冲液的烧杯中。将烧杯置于超声细胞破碎仪的工作台上，将安装有15号工作杆的超声波工作头放入烧杯中，调整工作杆底部至距离烧杯底部2cm的位置上，设置超声波工作功率为200w，超声开/关时间设置为1s/1s，工作总时长为15min。

使用巴氏管将GelMA纤维片段吹散，并将GelMA纺丝纤维片段悬液分别吸至15mL离心管中，通过台式离心机1600rpm，5min的离心沉淀，弃去上清液，向其中加入10mL 75％乙醇，再次经过台式离心机1600rpm，5min的离心沉淀脱水，弃去上清液，再加入10mL无水乙醇重复一遍脱水离心，弃去上清液，即可得到最终的纤维片段沉淀物。

取其中一管GelMA纺丝纤维片段，分别加入10mL PBS缓冲液，并转移至5个大皿中并向其中各再加入10mL PBS，在光学显微镜下观察，每组取两个不同视野的纤维片段样品，随机选取总共50根不同的纤维片段，通过粒径分析软件(Nano measurer)来测量纤维片段长度及直径，并计算平均数。

图4示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段在光镜下的结构图；由图4可知，GelMA纺丝纤维片段呈短棒状、部分呈卷曲状，长短不一；图5示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段的长度分布，图6示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段的直径分布，如图5、图6所示，GelMA纺丝纤维片段的长度及直径分布成近似正态分布，GelMA纺丝纤维片段的长度主要集中在15-60μm，平均长度为40μm；GelMA纺丝纤维片段的直径主要分布在1μm-16μm，平均直径为约8.78μm。

与图3结果比对发现，超声破碎后形成的GelMA纺丝纤维片段在缓冲液中会有一定的溶胀现象，这是因为在静电纺丝的过程中，我们采用的冻干GelMA材料溶于有机溶剂中，纤维膜中的有机溶剂挥发，因此，刚纺出来的纤维膜中间不含水分。当GelMA纺丝纤维膜转移至PBS缓冲液中时，GelMA材料高吸水能力使其快速溶胀，直径增大至未溶胀时的7倍，可见其含水量极高。

(3)核向前体溶液、壳相前体溶液、交联液及其溶解液的配备

Ⅰ、细胞处理：将复苏后生长良好的第三代hDPSCs用胰蛋白酶消化下来，通过终止消化离心后得到细胞沉淀，去掉上清液；

Ⅱ、制备1：1组GelMA纤维片段悬液：取体积比为1：1的GelMA纤维片段与0.25％w/v苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(Lap)将两者混合吹打均匀；

Ⅲ、制备1：2组GelMA纤维片段悬液：取体积比为1：2的GelMA纤维片段与0.25％w/v苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(Lap)将两者混合吹打均匀；

Ⅳ、用1：1组GelMA纤维片段悬液重悬处理后的第三代hDPSCs，作为实验1组的核相前体溶液，用1：2组GelMA纤维片段悬液重悬处理后的第三代hDPSCs，作为实验2组的核相前体溶液(其中hDPSCs的浓度均为3×10⁶cells/mL)，以下将；

Ⅴ、制备5％w/v GelMA水溶液：配置含有5％w/v GelMA、0.25％w/v的Lap引发剂的水溶液；

Ⅵ、用5％w/v GelMA水溶液重悬处理后的第三代hDPSCs，作为对比例组的核相前体溶液(其中hDPSCs的浓度为3×10⁶cells/mL)。

Ⅶ、配制2.0％(w/v)的藻酸盐溶液作为壳相前体溶液，通过超声震荡使溶液分布均匀；

Ⅷ、配制1％(w/v)氯化钙作为藻酸盐的交联液。

Ⅸ、将1g柠檬酸三钠溶解于100mL PBS中，得到1％(w/v)柠檬酸三钠溶液作为溶解液，用于溶解交联后的藻酸盐壳层。

(4)共轴静电液滴法制备藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球

共轴静电液滴设备由两台垂直放置的微量注射泵、高压静电装置及接收装置这三个部分组成构成，此外还有一个不锈钢共轴针头连接两台微量注射泵上的注射器。

参数选择：静电正电压为15kV(当电压小于14kV时，针头处喷出的液柱为稳定性极差，有大液滴滴落，小液滴飞溅，微球内部少有纤维微球内核形成，当电压逐渐从14kV升高，可以看到液柱逐渐稳定，形成泰勒锥样液柱，当电压达到15kV时，针头处为稳定的泰勒锥)，接受距离为12cm，核层溶液流速为15μL/min，壳层流速为70μL/min，共轴针头内径为25G，外径为16G，且内针稍长于外针针头。

在高压静电场的作用下，均匀分布的壳-核结构的溶液拉长、断裂形成均匀的壳-核微球结构进入到接受装置中，通过钙离子的交联作用，外层藻酸盐交联成凝胶，随后使用蓝光照射90s，使得核层GelMA交联定型。

随后将壳-核微球转移到离心管内，去除上层的氯化钙溶液，使用PBS重悬清洗3次。

制备过程中，由于有壳层的包裹，在静电液滴法制备的过程中，因液体飞溅未包进微球导致的浪费的细胞较少，在选择初始细胞浓度时可适当减小，这对于一些珍贵的细胞来说是很重要，可以很大程度上减少细胞损失。

其中，实验1组是以1：1组GelMA纤维片段悬液重悬hDPSCs作核相前体溶液、以2.0％藻酸盐溶液作壳相前体溶液。实验2组是以1：2组GelMA纤维片段悬液重悬hDPSCs作核相前体溶液、以2.0％藻酸盐溶液作壳相前体溶液。对比例组是以5％w/v GelMA水溶液重悬hDPSCs作核相前体溶液、以1.9％藻酸盐溶液作壳相前体溶液，重悬的hDPSCs的浓度均为3×10⁶cells/mL。

最终得到实验1组和实验2组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，以及对比例组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球。

进一步将1mL实验1组和实验2组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球沉淀分别用6mL PBS重悬，并向6孔板中每孔各加入1mL微球悬液。将收集到的壳核微球放置于光学显微镜下，进行观察并拍摄照片。然后使用粒径分析软件(Nano Measurer)，对拍摄的至少每组3幅图像的至少100各微球进行粒径分析。

进一步将实验1组和实验2组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球转移到离心管内，去除上层的氯化钙溶液，使用PBS重悬清洗3次。

具体实施时，图7示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球在光镜下的结构图，图7(a)为实验1组藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球光镜下的结构图，图7(b)为实验2组藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球光镜下的结构图，如图7所示，光镜下，壳层结构呈现均匀球形，核层结构同样为球形，并且具有孔隙。hDPSCs呈圆球状均匀分布于核层中，细胞折光性好、亮度高，提示细胞活性较好。也见到少数纤维微球组微球核层中不规则形态如半球形、条状等，但包裹细胞的能力不受影响，就像鸟巢一样为细胞提供适当的包裹和充足的附着位点。图8示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球光镜下的结构图。

图9示出了本发明实施例提供的载hDPSCs的GelMA纤维微球的电镜扫描图，如图9所示，溶解掉藻酸盐外壳后的载hDPSCs的GelMA纤维微球经冻干后，电镜扫描图像显示，GelMA纤维微球由根根分明的GelMA纤维片段搭建而形成网状结构，其表面有不规则的多孔结构，而hDPSCs存在于网状结构的孔隙中。

图10示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球和藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的直径分布，其中，图10(a)、图10(b)和图10(c)分别示出了实验1组、实验2组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的直径分布和对比例组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的直径分布；图11示出了本发明实施例提供的载hDPSCs的GelMA纤维微球和载hDPSCs的GelMA实心的直径分布，其中，图11(a)、图11(b)和图11(c)分别示出了实验1组、实验2组提供的载hDPSCs的GelMA纤维微球的直径分布以及对比例组提供的载hDPSCs的GelMA实心微球的直径分布，如图10、图11所示，实验1组、实验2组制备的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，以及对比例组制备的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的平均直径分别约为331μm、311μm、301μm，去壳层后的平均直径分别约为197μm、196μm、210μm。

实施例2：藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的体外培养

Ⅰ：藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中细胞的存活情况

在特定的时间点(1d、4d、7d、14d)，我们对实验1组、实验2组获得的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与对比例组获得的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球内部细胞的生长情况进行评估。分别取三组微球悬液各1mL，使用PBS缓冲液清洗三次，除去残余的培养基。并依照活/死染色试剂盒的使用方法来检验细胞的存活率，并判断细胞的增殖情况。往2mL生理盐水中各加入1μL碘化丙二醇，和1μL钙蛋白酶-AM，配制成活/死染料溶液。向三组微球中各加入1mL染色液，将微球完全覆盖，使其避光并在37℃条件敷箱中孵育2min，转移至激光共聚焦荧光显微镜下观察，每组各拍摄10张照片进行统计分析，使用Image J软件计算活细胞与总细胞的比值即为细胞的存活率。

图12示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中hDPSCs的存活情况，如图12所示，三组实验中，hDPSCs的存活率均高于90％，在培养至第4、7、14天时，可看到实验1组、实验2组和对比例组的单个微球内hDPSCs数目逐渐增加。进一步地，图13示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的激光共聚焦显微镜扫描图，由图13可知，hDPSCs仅分布在GelMA实心微球的表面。

Ⅱ：藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中细胞的增殖情况

CFSE染料(5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺酯)可以穿过细胞膜进入细胞内并与细胞骨架蛋白结合，并且可以激发出荧光。酶解后保留于细胞内，仅在细胞分裂时，随细胞骨架均分至子代细胞中，因此单细胞流式检测中，荧光强度越弱，分裂次数越多。在体外培养一天后，我们使用CFSE试剂盒对实验1组、实验2组获得的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与对比例组获得的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中包裹的细胞骨架进行标记，分别取上述三组微球悬液各2mL，使用PBS缓冲液漂洗微球一遍去除培养基，去除上清液，各加入1mL生理盐水，并加入1μl 5mM CFSE储存液，在避光条件下室温孵育20min，孵育完成后加入5mL培养基停止孵育5min，去除上清液，加入新鲜培养基洗涤两遍，最后加入培养基重悬，重新均分至6孔板中，每组各占两孔，避光置于敷箱中，每隔两天换液进行培养。

培养至14天时，将微球转移至ep管中，PBS洗涤三遍，加入柠檬酸三钠后轻轻吹打，离心后去除上清液，再加入1mL PBS以及6μL GelMA裂解液，重复上述吹打、离心、洗涤步骤得到三组细胞沉淀，使用1mL培养基重悬并过一道细胞筛，经过计数稀释后以每组10⁶个细胞/mL，通过流式细胞仪检测细胞荧光强度。

图14示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球d14的子代分布峰图，其中，图14(a)、图14(b)、图14(c)分别为实验1组、实验2组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的子代分布峰图，以及对比例组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球d14的子代分布峰图，图14(d)为为上述三组的子代分布峰图叠加显示效果图，如图14所示，经过14天的体外培养，实验1组、实验2组和对比例组中的细胞经流式检测呈现的结果为典型的连续多峰结构，相较于最右边的父代峰，实验1组、实验2组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，以及对比例组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中，hDPSCs增殖子代峰所占比例分别为：54％、53％、47％，可见，实验1组、实验2组中hDPSCs增殖子代峰所占比例要高于对比例组，且对比例组中，代数更大的细胞所占比例呈递减趋势，而实验1组、实验2组纤维微球较为均匀，组间差别不大，上述结果提示培养于藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球中的hDPSCs具有更强的增殖能力。

Ⅲ：藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球和藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中细胞形态及干性基因表达

在特定的时间点(4d、7d、14d)，我们对实验1组、实验2组获得的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与对比例组获得的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球内部细胞的细胞形态进行评估。分别取上述三组微球悬液各1mL，使用PBS缓冲液清洗三次，除去残余的培养基，加入4％多聚甲醛没过微球，于避光状态下在37℃下固定15min，随后去除上清液，使用PBS清洗三次，加入0.5％TritonX-100没过微球，在室温下对细胞膜打孔15min后，除去上清液并清洗三遍，加入1％(w/v)BSA没过微球，在37℃下封闭30min后，去上清，加入Phalloidin(1％BSA1：200稀释)对细胞骨架进行标记，避光孵育染色30min，去上清并用PBS清洗三次，最后加入DAPI(1μg/mL)对细胞核进行标记，室温下孵育10min后去上清，PBS清洗三次去除剩余的染料。在CLSM下对上述载细胞微球中细胞形态进行观察，对整个微球每间隔5μm进行图像采集，并最后叠加Z轴，对细胞分布情况进行分析。

在体外培养两周后，对细胞分泌细胞外基质及细胞干性基因表达进行简单的评估和对比。

同样是上述三组载hDPSCs微球悬液各取1mL，PBS清洗后用前述方法对微球进行固定、打孔、封闭处理，每次加入新液体前均用PBS清洗三遍以去除前一液体的残余。使用细胞增殖抗原Ki67(1:200稀释)对微球进行染色标记，在4℃环境中避光孵育过夜。第二天去上清，用PBS漂洗三次去除剩余染料，接着用488偶联抗体(1：200稀释)在37℃中避光孵育2h，并清洗掉残余染液以待观察。使用CLSM对上述微球进行荧光成像，采取5μm为图像采集间隔，最后进行Z轴叠加出三维重建图像。

图15示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中hDPSCs的形态，如图15所示，实验1组和实验2组中，藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球由于有的核结构的包裹，并未出现相互粘连、聚集成团的现象，并且，实验1组和实验2组中，中细胞生长旺盛且分布均匀，而对比例组中细胞生长较为集中，且其生长速度明显低于实验组。

图16示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中干性基因表达情况，如图20所示，经过14天的体外培养，实验1组和实验2组与对比例组中的细胞均有干性基因表达。

通过体外培养发现，本发明提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球中，hDPSCs均可以成功粘附在材料上，并可以自由生长，这证实营养物质、代谢废物可以穿过藻酸盐壳层不受阻碍。

上述实施例2说明，本发明提供的藻酸盐-GelMA纤维微球作为载hDPSCs的载体，在体外培养条件下，hDPSCs具有良好的存活情况和增殖情况，发明人用下述实施例3进一步验证本发明提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微的动物实验，以证实本发明提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球有助于牙髓再生的效果。

实施例3：载hDPSCs的GelMA纤维微球用于牙髓再生的动物实验

为了验证载hDPSCs的GelMA纤维微球在体内再生牙髓的能力，我们将其植入免疫缺陷小鼠皮下，为了给其提供一个成牙分化的环境，我们采用了牙本质套管，本实施例制备了长约5mm的猪牙牙本质套管，将其一端使用材料封口，将壳层藻酸盐溶解后，将载hDPSCs的GelMA纤维微球注入牙本质套管内，并以载hDPSCs的纯GelMA微球进行对比，将复合套管置入免疫缺陷小鼠皮下，在体内构建牙髓再生模型。植入2月后收样，并进行3个月的脱矿，随后观察体内牙髓再生情况，使用HE染色、免疫组化法进行观察，并判断材料的生物相容性和在体内的降解能力。

(1)牙本质套管的制备

从菜市场购得的猪头清洗干净，使用牙钳轻轻转动猪前牙并拔除，将新鲜猪牙使用PBS缓冲液反复冲洗，并用刀片反复刮除表面残留牙周膜、牙龈组织，并从根尖处拔除牙髓组织，尽量去除至肉眼不可见，并反复用PBS缓冲液冲洗干净，将处理后的猪牙浸泡于双抗(100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素)的PBS溶液中过夜。

浸泡后将猪牙取出，使用牙科专用高速涡轮手机将一个猪牙的牙冠和根尖1cm处磨除，并在磨除过程中保持用PBS缓冲液冲洗，避免温度过高破坏牙体组织，将剩余的牙分成2-3段，每段长约4-5mm，进一步磨除表面的牙骨质、牙周膜组织，以及根管内的牙髓组织和部分牙本质，修整其外形，最终得到数个外径约为4mm，内径约为2-3mm的圆柱状牙本质套管。将打磨完成的牙本质套管置于装有50mL PBS的离心管中，并把离心管放于超声震荡清洗机内震荡清洗约20mins，随后弃去上清液，依次加入不同浓度的50mL EDTA的PBS溶液：17％、10％、5％，并将其置于超声清洗机中，分别震荡脱矿30min、20min、15min，随后弃去上清液，再加入50mL PBS溶液，在超声清洗机内震荡10min。除去残余的EDTA脱矿液，弃除上清液，加入5.25％次氯酸钠消毒15min，随后去除上清液，PBS缓冲液超声震荡清洗20min，最终得到牙本质基质套管。我们使用修补根管侧漏的成品iRoot材料对套管的一端进行封闭处理，最终得到单端开口的套管。

(2)载hDPSCs微球-牙本质套管复合物的免疫缺陷小鼠皮下植入

本实验从四川大学实验动物中心购得四周龄BALB/c Nude雌性小鼠，在动物房适应生长2周，以待后续实验。

样品制备：

1、实验1组载hDPSCs的GelMA纤维微球；

2、实验2组载hDPSCs的GelMA纤维微球；

3、对比例1组载hDPSCs的GelMA实心微球；

4、对比例2组纯GelMA纤维微球组；

其中，实验1组、实验2组和对比例1组的制备方法见实施例1，对比例2组为不载hDPSCs的对照组，具体由体积比为1：1的GelMA纤维片段与0.25％w/v苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(Lap)水溶液作为核相前体溶液；2％w/v藻酸盐溶液作为壳相前体溶液制备得到。

以上四组载细胞微球中，初始细胞混悬液的负载细胞浓度均为3×10⁶cells/mL。

用实施例3提供的四组具有壳层的载细胞微球，在体外培养7天，将微球悬液转移至离心管中，弃去上层清液，并用PBS清洗两次，弃去上层清液，各加入5mL 1％柠檬酸三钠(去壳层)，轻轻吹打均匀后经500rpm 3min的离心，弃去上清液，并用PBS清洗1次后离心得到预植入载细胞微球聚合体。将TDM随机分成四组，分别向每个TDM中注入30-40μL上述各组微球聚合体，并小心将TDM开口朝上放于96孔板中，每孔中加入10μL生理盐水保持湿润环境，并置于冰盒上以待植入。

体内植入：在超净工作台中将免疫缺陷小鼠进行逐一称重，并使用耳标对小鼠进行标记，使用1wt％戊巴比妥钠对每只小鼠按照50mg/kg的剂量进行腹腔注射麻醉，待小鼠活动能力减弱即麻醉起效后开始植入手术。使用碘伏擦拭小鼠背部皮肤进行消毒，在背部正中处用直刀片竖直向切开长约1.5cm皮肤切口，向左、右边各钝性分离皮肤及皮下组织至两侧，小心用镊子夹起TDM，并将TDM开口朝头部放入小鼠背部，左右各一个(每组n＝6)，使用1mL空针将植入TDM周围的空气抽除，使得周围黏膜紧紧包裹住TDM，严密缝合背部皮肤，并涂抹少量红霉素眼膏避免细菌感染，密切观察待小鼠完全苏醒且活动正常后，将其放入笼中继续饲养。

收样：待体内植入2月后，将样品与周围组织锐性分离，分离去除周围覆盖的小鼠组织，将其置于4％多聚甲醛中进行固定过夜，以待后续观察。

(3)H&E染色法组织学评价微球体内牙髓再生效果

将多聚甲醛固定后的TDM样本放于流水下冲洗48h去除残留的多聚甲醛。将样本按组别分别放于10％EDTA溶液中，并将其放于37℃水浴摇床中进行脱矿处理，每3天更换一次新鲜的脱矿液并持续三个月，直到针头触及样品可轻易刺破样品即为脱矿完成。

将脱矿完成后的组织稍作修整后置于包埋盒中，按照75％乙醇1h、85％乙醇1h、95％乙醇2h、100％乙醇2h以此将样品浸泡其中进行梯度脱水处理，随后置于二甲苯中1h进行透明处理，随后将样本置于融化后的石蜡并置于60℃烘箱中处理24h，使得石蜡浸透样品，随后使用石蜡包埋机将模具中的样品包埋成蜡块。

使用切片机修整样品后将样品沿长轴纵向切割成5μm厚的组织切片，置于烘片机上烘至肉眼不可见水分后再放置在60℃烘箱中继续烘干，便可将切片置于切片盒中常温保存，以待后续实验。将处理好的切片放入二甲苯进行脱蜡处理1h，之后再按照100％乙醇2h、95％乙醇2h、85％乙醇1h、75％乙醇1h以此将样品浸泡其中进行梯度复水处理，并使用PBS缓冲液冲洗，进行H&E染色：将苏木素溶液滴在切片上覆盖组织1min进行染色，用PBS洗去多余染料；随后将伊红溶液滴在切片上覆盖组织5min进行染色，用PBS洗去多余染料后，按照75％乙醇1h、85％乙醇1h、95％乙醇2h、100％乙醇2h对切片进行梯度脱水处理，随后置于二甲苯中1h进行透明处理，滴上中性树胶进行封片，最后将切片置于通风橱中晾片12h，便可在光学显微镜下对套管内再生牙髓样组织的结构和形态进行观察评价。

(4)免疫荧光染色法组织学评价微球体内牙髓再生效果

取各个组的切片，进行切片免疫荧光染色。具体方法如下：将切片放入二甲苯进行脱蜡处理1h，之后再按照100％乙醇2h、95％乙醇2h、85％乙醇1h、75％乙醇1h以此将样品浸泡其中进行梯度复水处理，并使用PBS缓冲液冲洗，进行免疫荧光染色。使用免疫组化笔在样品周围画圈，使用无水乙醇配制3％H₂O₂，将其在避光条件下滴加于切片样品上，置于室温下避光封闭20min，随后使用PBS缓冲液清洗掉残余封闭液，重复洗涤三次；用滤纸将周围多余水分吸干，并滴加冰冻切片抗原修复液(5X稀释)修复5min，随后使用PBS缓冲液清洗掉残余封闭液，重复洗涤三次；滴加10％羊/兔血清在室温下对样品进行封闭30min，随后用滤纸将周围残留血清吸干。我们选用牙本质基质蛋白1(DMP-1)、CD31抗体(均以1％BSA进行1:200稀释)对再生牙髓样组织进行评价微球中hDPSCs牙向分化效果以及血管生成效果，同时我们选用1％BSA以1:200稀释的mitochondria抗体来标记人线粒体，以辨别来源于人细胞再生的组织。将配制好的一抗加入至切片上，并将切片放入湿盒中置于4℃孵育过夜。第二天弃去一抗，用PBS缓冲液洗涤三次，并加入二抗在37℃烘箱内孵育2h，随后弃去二抗，用PBS缓冲液洗涤三次后即刻封片。将上述切片置于CLSM下观察。

体内实验结果探究：

图17示出了本发明实施例提供的体内植入2个月后动物实验结果，如图17所示，经切开免疫缺陷小鼠的皮肤组织我们可以发现，植入2个月后四组牙本质套管开口端均有血管长入，提示宿主血管与植入样本内的新生血管有吻合，证实套管内血供良好，能为组织的新生提供了营养，带走代谢废物。

图18示出了本发明实施例提供植入物体内植入8周后的H&E染色结果，其中，红色框标记典型区域，其下方为相应典型结构的高倍镜下图像。如图18示出的组织学切片H&E染色显示，四组微球材料均在体内降解完成，仅对比例2组可以在空腔中看到微量材料碎片残余，并且，对比例2组仅在套管开口处可见小鼠的结缔和脂肪组织长入，其余三组载hDPSCs微球所在套管除管口可见小鼠组织外，其内均可见牙髓样组织再生，并可以见到近牙本质处，有类似于成牙本质细胞层排列。进一步地，与对比例1组相比较，在植入细胞总量相近的前提下，实验1组和实验2组形成了更多的牙髓样组织，且血管更丰富、新生牙体组织更多，组织结构更有层次。

图19示出了本发明实施例提供的体内植入8周后套管内新生牙髓面积定量分析结果，其中，植入实验1组和实验2组提供的载hDPSCs的GelMA纤维微球和植入对比例1组提供的载hDPSCs的GelMA实心微球的套管内新生牙髓面积分别约为套管截面总面积的71％、76％、56％，其新生血管面积占比分别约为4.4％、3.6％、1.6％。并且，除植入对比例2组提供的纯GelMA纤维微球组的套管，其余各组套管内均无残留材料。

图20示出了本发明实施例提供的体内植入8周后套管内新生牙髓免疫荧光染色结果，如图20所示，对比例2组纯材料组内未查及DMP-1、CD31及人线粒体抗体表达，其余三组中(实验1组、实验2组和对比例1组)载hDPSCs各组微球内均可探及DMP-1、CD31及人线粒体抗体表达。

本实施例将载hDPSCs的GelMA纤维微球、GelMA实心微球与牙本质套管复合，构建了免疫缺陷小鼠体内半原位牙髓再生模型。动物实验的结果充分证明了本实验制备的载hDPSCs的GelMA纤维微球能够在体内极高效地促进牙髓组织再生，并且与GelMA纯微球相比，载hDPSCs的GelMA纤维微球具有更好的牙髓组织再生效果，具备极佳的降解性能。

体内实验结果验证了利用GelMA纤维微球来进行牙髓再生的优越性。纤维微球内的营养和氧气条件优于纯微球组，使得搭载的细胞活性较高，这与体外培养的结果一致，且纤维微球组细胞增殖效率更高，更易形成三维微组织结构。进一步地，GelMA纤维微球支架由于比表面积高、材料占据空间更小，其降解速率更快，为细胞的增殖迁移、新组织和血管的形成提供的空间更多，相较于GelMA实心微球，细胞分布于整个纤维微球，材料的空间利用率大大提升，十分适用于狭长崎岖的根管环境。此外，GelMA纤维微球组由于孔隙充足，有更多的空间提供给新生微血管组织网络，最终形成与宿主血管相吻合的血管网络，能为组织再生提供源源不断的动力。

以上对本发明所提供的一种藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球及其制备方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (7)

1.一种藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

S1、用适量的2,2,2-三氟乙醇将冻干的甲基丙烯酰化明胶溶解，得到质量浓度为10％(w/v)的电纺液；

S2、将所述电纺液装入静电纺丝机中，调节电纺参数至合适后，制备得到GelMA纺丝纤维膜；

S3、将所述GelMA纺丝纤维膜浸泡于交联液中，20-24h后，使用PBS缓冲液漂洗被交联液浸泡后的GelMA纺丝纤维膜，得到交联处理后的GelMA纺丝纤维膜；

S4、将所述交联处理后的GelMA纺丝纤维膜放入PBS缓冲液中，进行超声细胞破碎、离心沉淀，得到GelMA纺丝纤维片段；

S5、将所述GelMA纺丝纤维片段、引发剂Lap和hDPSCs混合均匀，得到核相前体溶液；

S6、配置质量浓度为2％w/v的藻酸盐溶液，作为壳相前体溶液；

S7、调节共轴静电液滴设备的相关参数，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球；

其中，步骤S2中，所述调节电纺参数包括：调节推注速度为0.5mL/h，调节电压为25kV，注射器针尖据接收装置距离为15cm，接收装置转速为1000转/分；

步骤S3中，所述交联液由质量体积比为0.47g：0.28g：100mL的EDC、NHS和无水乙醇混合而成；

步骤S5中，所述引发剂是质量浓度为0.25％w/v的Lap；

所述GelMA纺丝纤维片段与所述引发剂Lap的体积比为1:1-2。

2.根据上述权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核相前体溶液中，所述hDPSCs的浓度为不大于1×10⁷cells/mL。

3.根据上述权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，调节共轴静电液滴设备的相关参数包括：调节静电正电压为15kV，接受距离为12cm，核层溶液流速为15μL/min，壳层流速为70μL/min，共轴针头内径为25G，外径为16G。

4.根据上述权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球包括：

核相前体溶液与壳相前体溶液在共轴针头出口端，以壳相前体溶液包覆核相前体溶液的形式流出，流出的溶液在高压静电场的作用下，拉长、断裂，落入装有1％w/v氯化钙溶液的接收装置中，外层壳相前体溶液与钙离子交联形成凝胶，进一步对接收装置进行蓝光光照，内层核相前体溶液在蓝光光照和Lap作用下发生交联形成载hDPSCs的GelMA纤维微球。

5.一种上述权利要求1-4任一所述的制备方法获得的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，其特征在于，所述藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球具有壳-核结构；其中，壳结构由凝胶化的藻酸盐构成；

核结构由GelMA纺丝纤维片段与hDPSCs共同构成，其中，不同所述GelMA纺丝纤维片段，在交叉接触的位点发生交联聚合，形成具有孔隙的GelMA纤维微球，所述hDPSCs均匀分布于所述孔隙中，形成载hDPSCs的GelMA纤维微球。

6.根据权利要求5所述的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，其特征在于，所述GelMA纺丝纤维片段的纤维直径为1μm-16μm，所述GelMA纺丝纤维片段的纤维长度为15μm-60μm。

7.根据权利要求5所述的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，其特征在于，所述核结构的平均粒径为196-197μm；所述壳结构的平均粒径为311-331μm。