CN117771445A - 一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法 - Google Patents
一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法，包括以下步骤，a，确定药物浓度；b，制备负载CGA的Gelma微球；制备PCLNGCs和CGM‑PCLNGCs。本发明制备的复合导管非常支持雪旺细胞的附着和增殖，此外，CGA具有良好抗炎抗氧化、促血管生成作用，为神经再生创造良好的微环境，负载CGA的Gelma微球具有良好的缓释体系，有效地避免了直接局部注射CGA给药可能会出现初始突释，同时保持局部药物的有效浓度，进而降低其系统性副作用。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法。
背景技术
外周神经损伤(PNI)是由于事故、创伤和其他原因引起的外周神经的结构或功能丧失，可导致感觉、运动和自主神经功能的部分或完全丧失和神经病性疼痛。在发达国家，每年每10万人中约有13人到23人受到PNI的影响。虽然PNI后的损伤的周围神经有再生能力，但轴突再生过程缓慢，再生速度仅为1-3mm/天。目前，尽管自体神经移植仍然是PNI治疗的金标准，但存在供体神经来源的缺乏和供体部位的功能障碍等限制。为了克服这些问题，来源广泛、易获取的神经导管(NGC)越来越多地被认为是治疗周围神经损伤的自体神经移植物的潜在替代品。
PCL是制备NGC最常用的合成聚合物之一，具有优异的机械性能、易加工性和生物相容性，已经获得FDA批准在临床使用。PCL虽已用于临床，但仍存在治疗受损神经时生长速度过缓等问题，研究人员通过构建复合材料导管或者载药导管等对PCL神经导管进一步优化，以寻求更快的生长速度。其中，载药神经导管具有可靶向、长时间持续释放给药的优点，利于促进周围神经再生。并且有证据表明，中空管腔不能为周围神经再生提供允许的基质，尽管可以在损伤部位保留神经营养因子并为轴突生长提供宏观物理指导。
绿原酸(CGA)是一种重要且具有生物活性的膳食多酚，具有多种重要的治疗作用，如抗炎、抗氧化活性、抗菌、神经保护、抗病毒、抗微生物、免费自由基清除剂。它是酚酸类化合物中最有用的酸之一，由咖啡酸与奎宁酸酯化形成,可以在生咖啡提取物和茶中自然发现。PNI后施旺细胞的增殖和炎性微环境状态是影响神经再生的重要方面。
基于此，使用微球策略从多孔聚合的PCL导管的内壁递送CGA的制备神经导管的方法已成为新的研究方向之一。
发明内容
本发明的目的是针对上述背景技术中存在的不足，提供一种用于周围神经损伤修复的且修复效果较好的负载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法。
为实现上述目的，本发明一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法，采用了如下技术方案：
一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法，包括以下步骤，
a，确定药物浓度，将RSC 96接种到密度为2000个细胞/孔的96孔板中，然后向组织培养板上分别加入不同浓度的CGA处理24和48小时，之后，向每个孔中加入10μL的CCK-8试剂，置于培养箱孵育2h，之后，在450nm下用酶标仪检测每个孔的吸光度，确定施旺细胞最佳生长适宜的CGA浓度；
b，制备负载CGA的Gelma微球，包括，制备LAP标准液，之后将GelMA、CGA粉末充分浸没于LAP标准液，之后将含有CGA的GelMA溶液立即用0.22μm无菌针头过滤器灭菌，之后采用微流控同步交联装置以合适的流速比制备MS，其中含有CGA的GelMA溶液为水相，油相为含有7％v/v Span 80的矿物油，之后将形成的MS收集于干净的培养皿中，洗涤、干燥即得；
c，制备PCL NGCs和CGM-PCL NGCs，包括，制备纯PCL NGCs，将PCL颗粒加入三氟乙醇中，在室温下搅拌24h，形成透明胶液，采用静电纺丝设备制得PCL NGCs，再将步骤b中MS注入PCL NGCs内形成CGM-PCL NGCs。
本发明一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法的进一步改进之处在于，步骤a中加入的CGA的浓度分别为0、25、50、100、200、400μM。
本发明一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法的进一步改进之处在于，步骤b中，LAP标准液的制备方法包括，取20ml PBS、0.05g引发剂LAP，以40-50℃水浴加热溶解15分钟，期间振荡数次，可得到LAP标准液。
本发明一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法的进一步改进之处在于，步骤c中，PCL颗粒质量为2g，三氟乙醇体积为12ml，搅拌后，形成17％(w/v)透明胶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明利用静电纺丝和微流控同步交联法设计了一种可负载CGA的复合导管，CGM/PCL导管创造了一种仿生微环境，以加速神经再生。将CGA与具有智能控释功能的生物材料相结合，解决了CGA生物利用度差、体内吸收效率低的问题。有效地避免了直接局部注射CGA给药可能会出现初始突释，同时保持局部药物的有效浓度，进而降低其系统性副作用。
2、本发明CGM/PCL导管为RSC的粘附和增殖创造了良好的环境，此外，导管为神经提供足够的营养和代谢空间，同时有效地引导和保护它们。
附图说明
图1，采用微流控同步交联装置生产GelMA微球(GM)的工艺，并制备了多孔GelMA微球(GM)(A)甲基丙烯酸化明胶(GelMA)在光引发剂存在下使用紫外线照射进行交联。(B)采用静电纺丝法制备PCL NGCs并向导管空腔内注射含药MS制成复合神经导管；
图2，材料的表征；PCL NGC(A)、GM(D、E)的代表性光学图像，PCL NGC(B、C)和GM(F)的SEM图像，GM(G-I)的粒度分布、膨胀和重量损失，CGA(J)的累积释放曲线。比例尺分别是20微米(B)，6微米(C)，500微米(E)，40微米(F)；
图3，生物相容性评价；RSC 96的生长受不同浓度的CGA(A，B)的影响。在TCP(E，I，M)、PCL(F，J，N)、GM(G，K，O)和GM/PCL(H，L，P)上培养的RSCs的活/死细胞染色分析。活细胞(绿色荧光，E，F，G，H)，死细胞(红色荧光，I，J，K，L)和合并图像(M，N，O，P)。将RSC接种在TCP、PCL、GM和CGM上，并在24、72、120和168h(C)通过CCK-8试验检测细胞毒性。通过活/死染色评估细胞活力(D)。孵育7天后，通过鬼笔环肽免疫荧光染色观察GM上RSCs的形态。实验重复了三次。比例尺是500微米(E-P)和100微米(Q-S)。
图4，GM/PCL NGC和再生神经的形态学、肌肉神经支配(SFI)和电生理学评估；植入CGM/PCL后的形态学(A)，植入后12周的PCL支架和自体神经移植物(B，D)，从CGM/PCL NGC组获得的再生神经和PCL支架(C)。植入后12周自体神经移植手术后12周获得腓肠肌的代表性光学(E-H)和MASSON染色照片(I-L)。植入后12周测量坐骨神经功能指数(M)、腓肠肌标准化湿重(N)、远端联合运动动作电位(O)、胶原纤维截面积百分比(P)、肌纤维(Q)、神经传导速度(R)。实验重复了三次。▲代表p<0.05，▲▲代表与PCL相比p<0.01#代表GM对CGM/PCL的p<0.05*表示PCL与CGM/PCL的p<0.05。比例尺为100μm。
图5，所有标本均用透射电镜观察，来自自体移植组(A、E和I)、GM(B、F和J)、GM/PCL(C、G和K)和CGM/PCL(D、H和L)的再生神经的TEM图像。各组有髓轴突密度(M)、神经髓鞘厚度(N)和平均有髓轴突直径(O)。实验重复了三次。▲代表p<0.05，▲▲代表与PCL相比p<0.01#代表GM对CGM/PCL的p<0.05*表示PCL与CGM/PCL的p<0.05。比例尺为500μm。
图6，S100(A、D、G和J)-MBP(B、E、H和K)、TUJ1(M、P、S和V)-NF200(N、Q、T和W)以及来自自体移植组(A、B、C、M、N和O)、PCL组(D、E、F、P、Q和R)、GM/PCL组(G、H、I、S、T和U)的融合体(C、F、I、L、O、R、U和X)的免疫荧光染色S100(Y)、MBP(Z)、TUJ1(i)和NF200(ii)的相对表达水平。实验重复了三次。▲代表p<0.05，▲▲代表与PCL相比p<0.01#代表GM对CGM/PCL的p<0.05*表示PCL与CGM/PCL的p<0.05。比例尺为250μm
图7，术后12周对自体移植组(A、E、I、M和Q)、PCL组(B、F、J、N和R)、GM/PCL组(C、G、K、O和S)和CGM/PCL组(D、H、L、P和T)的HO-1(A-D)、TNF-α(E-H)、IL-1β(I-L)、GCLC(M-P)和MnSOD(Q-T)进行免疫组织化学染色；HO-1(U)、TNF-α(V)、IL-1β(W)、GCLC(X)和MnSOD(Y)的相对表达水平；实验重复了三次。▲代表p<0.05，▲▲代表与PCL相比p<0.01#代表GM对CGM/PCL的p<0.05*表示PCL与CGM/PCL的p<0.05。比例尺为100μm。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
体外实验
a，确定药物浓度；按照制造商的说明进行细胞计数试剂盒-8(CCK-8)分析，以评估CGA对施旺细胞的细胞毒性作用。将RSC 96接种到密度为2000个细胞/孔的96孔板中，然后向组织培养板上分别加入0、25、50、100、200、400μM不同浓度的CGA处理24和48小时。随后，向每个孔中加入10μL的CCK-8试剂，置于培养箱孵育2h。最后，在450nm下用酶标仪检测每个孔的吸光度。经过实验观察可知，在不同浓度的CGA中培养施旺细胞1天后，浓度为50μM的CGA组吸光度最高，细胞活力高于200μM的CGA组(p＜0.05)和400μM的CGA组(p＜0.01)。培养2天后，浓度为100μM的CGA组吸光度最高，100μM(p<0.01)和200μM CGA(p<0.05)的值均高于未加药组，当浓度＞100μM，细胞活力呈下降趋势。综上，在一定浓度范围内CGA对施旺细胞的生长有积极作用，100μM CGA可能是施旺细胞最佳生长适宜浓度；
b，负载CGA的Gelma微球的制备；采用微流控同步交联装置制备负载CGA的Gelma微球。明胶链的甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯的侧基在掺入光引发剂、进行UV等辐照的条件下发生聚合，固化后得到交联明胶网络。首先取20ml PBS、0.05g引发剂LAP，以40-50℃水浴加热溶解15分钟，期间振荡数次，可得到LAP标准液。将所需质量的GelMA、CGA粉末充分浸没于LAP标准液，以60-70℃水浴避光加热溶解20-30分钟，期间振荡数次。将含有CGA的GelMA溶液立即用0.22μm无菌针头过滤器灭菌以防止低温凝胶化。我们采用微流控同步交联装置以合适的流速比制备MS，上述配置的含有CGA的GelMA溶液作为水相溶液，油相溶液由含有7％v/v Span 80的矿物油制备，水相溶液和油相溶液分别注入a口和b口(图3A)(a口内径0.16mm，b口内径0.5mm)，复合溶液液滴(油包水)在c口处形成并通过硅胶管向前端推进，并将部分硅胶管暴露于405nm紫外线照射下15秒后即可光交联形成MS(图3C)。随后，将形成的MS收集于干净的培养皿中，用75％酒精洗涤3次，丙酮洗涤1次，再用去离子水洗涤3次，最后置于真空冷冻干燥机2小时即可；
c，PCL NGCs和CGM-PCL NGCs的制备；为制备纯PCL NGCs，将2g PCL颗粒加入12ml三氟乙醇中，在室温下搅拌24h，形成17％(w/v)透明胶液。采用静电纺丝设备(长沙伊娜仪器技术有限公司)制备了NGC。简言之，将获得的溶液转移至5ml注射器中，并在12-kV高DC电压下以0.8ml/h的速度进行电纺，用旋转收集器均匀收集电纺丝溶液将得到的具有随机或取向纤维排列的PCL纤维薄膜，将其沿钨钢棒卷曲，置于合适的温度下热加工1小时再轻轻分离，即可获得的PCL NGCs。将步骤b中MS注入PCL NGCs内形成CGM-PCL NGCs。
之后，计算微球的溶胀和降解；取15mg干燥的MS置于50ml离心管底部，向其中加入20ml PBS(pH 7.4)缓冲液，将离心管放置于37℃恒温震荡培养箱中以70rpm温和震荡。分别不同的时间间隔取出样本，以5000rpm的转速离心收集微球并用滤纸吸去微球表面残余的水珠，称取此时MS的质量，记为Wsw。Esw＝Wsw-W0/W0*100。同样，将15mg干燥的MS浸入20mlPBS中，温和震荡，PBS每两天更新一次。分别在第7、14、21、28天取出样本，用去离子水冲洗，冻干，称重。Ewl＝(W0-W1)/W0×100％，W1为每个时间点的干重，用于评估MS在每个时间点的重量损失百分比(W0表示干燥的微球质量，W1为每个时间点的干重，Wsw表示溶胀后微球的质量，Esw表示微球溶胀率，Ewl表示微球降解率，该实验重复3次)。
药物释放曲线；CGA(纯度98％，Aladdin)的校准曲线是通过在浓度为100mg/L的PBS溶液中逐渐稀释CGA并使用紫外分光光度计(UV-2600，Shimadzu)测量325nm处的最大吸光度获得的)。曲线显示最大吸光度与CGA浓度在12.5–57.5mg/L范围内具有极好的线性关系。发现校准方程为A＝18.631c–0.0345，R 2＝0.9992。将1g含或不含CGA的MS放置于5ml的玻璃瓶底部。然后将3ml的PBS溶液作为释放介质小心地放置在MS的顶部，在37℃下孵育。在设计的时间间隔内，取出1ml上清液进行测定，并立即更换为新鲜的释放介质，以保持释放介质的体积恒定。来自无药物MS的PBS作为对照，根据校准曲线测量325nm处的最大吸光度来确定释放的CGA量。从图2H中可以看出，药物释放在前20min内具有爆发效应，约26.97％的CGA被释放。这可能归因于药物释放基于浓度扩散的原因。随着释放时间的延长，药物释放速度变慢，CGA在320h内从负载CGA的MS中的累积释放率为77.29％。这表明负载CGA的MS可以实现CGA的缓释。
细胞形态和生物相容性；将RSCs以8000/孔的密度接种于PCL、MS、CGA/MS、组织培养板(TCP)上，培养基每两天更新一次。3天后弃去原培养基，用PBS洗涤2-3次，3.7％多聚甲醛固定，依次用10、30、50、70、80、90、95、100％乙醇梯度脱水，每次15min。然后用扫描电镜(ZEISS Gemini 300)观察细胞在支架上的黏附情况。此外，我们使用Actin-tracker Red(Beyotime，China)进行细胞骨架染色，以观察支架上细胞的形态。同样，用3.7％多聚甲醛固定细胞，并用含0.1％Triton X-100的PBS洗涤2-4次，每次5min。含有1-5％BSA和0.1％Triton X-100稀释Actin-tracker Red的PBS(配置为工作液)，向平板中加入400μL工作液，在无光条件下培养30-60min。最后，用含0.1％Triton X-100的PBS洗2-4次,DAPI(中国贝约提姆)对细胞进行核染色3-5分钟。用共聚焦荧光显微镜观察观察染色的支架，并用Image-J软件处理细胞图像。大鼠雪旺细胞(RSCs)由中国科学院(中国上海)提供。将MS-PCL和PCL膜浸泡在75％乙醇中，并用PBS反复冲洗至少3次。然后，将其置于无菌培养皿中，在通风柜中干燥，并分别对正面和背面照射2h，以通过紫外线灯实现灭菌。我们以2×104cm2/孔的密度将细胞接种在MS、CGA-MS、PCL支架和TCP。培养72h后，使用LIVE/DEAD试剂(Beyotime，中国)根据标准方案进行细胞存活率分析。最后，在荧光显微镜下对各组细胞进行拍照。在支架上接种72h后，用SEM观察了RSC的形态和附着情况。结果表明，RSCs附着在PCL纤维表面，并延伸出许多伪足。用鬼比环肽对F-actin染色也可获得类似的结果。这些结果从不同方面充分说明MS-PCL NGCs具有良好的生物相容性，为载CGA的GelMA MS在体内促进神经再生奠定良好基础。
细胞毒性实验；使用细胞计数试剂盒8(CCK-8，Beyotime，中国)评估细胞毒性。将细胞培养在MS、CGA-MS、PCL支架和TCP，在24孔板中培养24、72、120、168h，然后向各孔中加入40ul CCK-8检测溶液，在37℃下培养2h后，从相应的24孔板中吸取100μL的上清液转移到96孔板中，使用酶标仪(Thermo3，001，Thermo Fischer Scientific，美国)在450nm波长下检测上清液的吸光度。使用TCP作为对照。每组至少重复3次。
体内实验：
动物外科手术：
选用SD大鼠(雄性，体质量150～200g)评价神经再生能力。根据随机分组原则，将模型大鼠随机分为3组:PCL组、自体移植组和MS-PCL组。用2％戊巴比妥钠溶液从腹腔注射麻醉大鼠。在无菌条件下暴露坐骨神经及其主要分支，切除12mm神经组织。在PCL或MS-PCL组中，以神经导管桥接神经断端，将两端的神经内膜、神经外膜各缝至管壁上，制成12mm坐骨神经缺损模型。自体移植组在神经残端旋转180°左右后，进行神经端对端缝合。所有操作完成后逐层缝合肌肉和皮肤，为预防术后感染，连续腹腔注射抗生素(头孢呋辛钠，0.1g/kg)3天。在第4、8和12周评估术后情况，同时观察大鼠术侧伤口恢复情况。动物研究的伦理批准来自上海市第十人民医院机构动物保护和使用委员会(SHDSYY-2021-2，305)。
坐骨神经电生理及功能分析：
术后第4、8、12周进行坐骨神经功能分析。将大鼠双足仔细涂满红泥后置于白纸一端，引导大鼠爬行至白纸另一端。采集纸上留下的完整的红色足迹，计算术后4、8、12周坐骨神经功能指数(SFI)。神经功能测定公式:SFI＝(13.3×(EIT-NIT)/NIT)+(38.3×(EPL-NPL)/NPL)+(109.5×(ETS-NTS/NTS)8.8。在这个公式中，IT代表从第二个脚趾到第四个脚趾的距离；PL表示从第三趾的远端到脚跟的长度；TS为第1趾至第5趾的长度，N为正常侧，E为实验侧。SFI评分从0分(正常功能)到100分(功能完全受损)。术后12周进行电生理分析，记录复合运动动作电位(CMAP)、神经传导速度(NCV)等电信号。我们发现，术后12周时，MS/PCL/CGA组(40.5)的SFI效应明显优于PCL组(56.0，p<0.05)，且与自体移植组(33.7，p>0.05)无明显差异。电生理分析显示，在植入后12周MS/PCL/CGA组(19.0mv和14.8m/s)的再生神经DCMAP和NCV高于PCL组(14.2mv和12.5m/s，p<0.05)和MS/PCL组(15.4mv和12.7m/s，p<0.05)，与自体移植组(23.6mv和16.9mV，p>0.05)比较差异不显著。
腓肠肌重量分析：
测量植入后第12周的腓肠肌湿重。解剖双腿腓肠肌，用眼科剪小心去除附着的脂肪结缔组织。腓肠肌湿重比(％)＝Wo/Wn，其中Wo为手术腿的腓肠肌重量，Wn为非手术腿的腓肠肌重量。
组织学分析：
对大鼠实行安乐死，收集术后12周大鼠的再生神经进行组织分析。我们通过TB染色、TEM和苏木精-伊红(HE)染色观察神经的横截面形态(标本中间)。4％多聚甲醛固定后包埋于石蜡中切片进行HE染色。4℃下用2.5％戊二醛固定样本，然后包埋在Epon812中，切成超薄切片进行TEM和TB染色。使用免疫荧光显微镜(美国徕卡)观察切片。在80kV电压下，通过TEM(China Titan)观察再生髓鞘的超微结构。应用ImageJ软件定量分析轴突直径、密度、髓鞘厚度。S100/MBP、NF200/Tuj1三重免疫荧光染色分别检测再生神经的神经髓鞘蛋白和神经轴突蛋白。用1％四氧化三铁溶液固定组织，脱水，并包埋在Epon812树脂中。将横截面切割至4微米的厚度，并安装在2％明胶包被的载玻片上。主要抗体(美国Proteintech)包括抗MBP(1:200)和抗S100(1:200)。使用免疫荧光显微镜(美国徕卡)评估所有载玻片。通过HE染色评估肌纤维(来自手术腿的腓肠肌)的形态。通过免疫组化染色检测HO-1、TNF-α、IL-1β、GCLC和MNSOD的表达情况。选用TEM、HE和甲苯胺蓝染色进行组织学分析。结果表明CGA/MS/PCL组有髓轴突的直径、密度和髓鞘的厚度(5.2μm、2.5*104/mm2、0.6μm)明显优于PCL组(3.3μm、1.5*104/mm2、0.27μm)、MS/PCL组(3.5μm、1.5*104/mm2、0.3μm)(p<0.05)，与自体移植组(5.6μm、2.8*104/mm2、0.7μm)无明显差异.CGA/MS/PCL组和自体神经组的髓鞘致密，在轴突周围呈多层螺旋排列(图S4).相比之下，PCL组中可见空泡状结构，神经纤维鲜有，且有髓轴突的直径和密度以及髓鞘厚度明显小于MS-PCL组和自体移植组。另外，我们选用雪旺细胞标记蛋白(S-100)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)评估CGA/PCL/MS NGCs的神经再生作用。CGA/PCL/MS组是PCL组的2.06倍，是MS/PCL组的1.80倍(p<0.05)且和自体神经组无明显差别。
综上，CGA作为一种抗炎和抗氧化剂在PNI后可能发挥着重要的抗炎、抗氧化应激、抗凋亡的作用，我们通过免疫法检测HO-1、TNF-α、IL-1β、GCLC、MnSOD的表达评估其抗氧化应激和炎症能力。与自体神经组、CGA/MS/PCL组相比，PCL组和MS/PCL组中IL-β和TNF-α的表达显著升高(p<0.05)，自体移植物组与CGA/MS/PCL组之间没有差异。(图7)。此外，我们检测了HO-1、GCLC和MnSoD的表达水平，CGA/MS/PCL组明显高于PCL组和MS/PCL组(p<0.05)，与自体移植组之间的差异无统计学意义(图7)。因此，CGA/MS/PCL NGCs(即CGM-PCL NGCs)可抑制PNI模型大鼠体内炎症活动。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (4)
1.一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
a，确定药物浓度，将RSC96接种到密度为2000个细胞/孔的96孔板中，然后向组织培养板上分别加入不同浓度的CGA处理24和48小时，之后，向每个孔中加入10μL的CCK-8试剂，置于培养箱孵育2h，之后，在450nm下用酶标仪检测每个孔的吸光度，确定施旺细胞最佳生长适宜的CGA浓度；
b，制备负载CGA的Gelma微球，包括，制备LAP标准液，之后将GelMA、CGA粉末充分浸没于LAP标准液，之后将含有CGA的GelMA溶液立即用0.22μm无菌针头过滤器灭菌，之后采用微流控同步交联装置以合适的流速比制备MS，其中含有CGA的GelMA溶液为水相，油相为含有7％v/vSpan80的矿物油，之后将形成的MS收集于干净的培养皿中，洗涤、干燥即得；
c，制备PCLNGCs和CGM-PCLNGCs，包括，制备纯PCLNGCs，将PCL颗粒加入三氟乙醇中，在室温下搅拌24h，形成透明胶液，采用静电纺丝设备制得PCLNGCs，再将步骤b中MS注入PCLNGCs内形成CGM-PCLNGCs。
2.根据权利要求1所述的一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法，其特征在于：步骤a中加入的CGA的浓度分别为0、25、50、100、200、400μM。
3.根据权利要求2所述的一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法，其特征在于：步骤b中，LAP标准液的制备方法包括，取20mlPBS、0.05g引发剂LAP，以40-50℃水浴加热溶解15分钟，期间振荡数次，可得到LAP标准液。
4.根据权利要求3所述的一种载绿原酸的GelMA微球复合神经导管的制备方法，其特征在于：步骤c中，PCL颗粒质量为2g，三氟乙醇体积为12ml，搅拌后，形成17％(w/v)透明胶液。
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