CN109364306A - Ngf单壳-多核微球/pcl纳米纤维导管及其制备方法 - Google Patents

Ngf单壳-多核微球/pcl纳米纤维导管及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NGF单壳‑多核微球/PCL纳米纤维导管，这种微球/纳米纤维导管可以促进周围神经再生，支配靶肌肉的功能重建，更好更快的促进周围神经运动功能的恢复，本发明还公开了一种NGF单壳‑多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，首先，制备包埋NGF的PLGA微球，然后制备包埋NGF的单壳‑多核微球和聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管，最后将制备的包埋NGF的单壳‑多核微球溶解于PBS溶液中，然后注射入聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管内，得到NGF单壳‑多核微球/PCL纳米纤维导管。

Description

NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管及其制备方法
技术领域
本发明属于生物仿生材料制备方法技术领域，具体涉及一种NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管，本发明还涉及NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法。
背景技术
周围神经损伤(Peripheral nerve injury，PNI)在战创伤中发生率高,是临床处理中最棘手的一种损伤类型。周围神经损伤后的神经再生能力有限，常常导致患者出现感觉功能、运动功能以及自主神经功能障碍，甚至引起受损神经支配的靶器官生理功能永久性丧失，使患者遭受终身残疾，严重影响了生活质量，为家庭和社会带来了沉重的心理压力和巨大的经济负担。神经损伤分为以下三种：神经失用、轴突断裂、和神经断裂。神经失用是由于压缩或挤压髓鞘导致神经局部传导受阻，然而轴突本身仍然完好无损，无明显的形态学改变，神经传导功能只是暂时中断，通常3周～6周内可自行恢复，远端神经纤维不发生华勒变性。轴突断裂主要指神经鞘膜结构完整，但是髓鞘内的轴突发生完全断裂，远端神经纤维发生华勒变性。在一定条件下，断裂的轴突可自行恢复，神经的传导功能也可部分或者完全恢复。神经断裂主要是指整个神经干发生完全断裂，包括神经的鞘膜和轴突。如果没有干预措施，神经元、近端髓鞘以及远端髓鞘均发生病理生理学的改变，从而导致相应肢体的感觉、运动功能出现障碍。这种神经损伤必须通过手术缝合近端神经，缝合后可完全恢复神经功能或不完全功能恢复。周围神经损伤后的功能恢复主要取决于神经受损的严重程度。周围神经的修复过程是一个复杂的动态过程，主要涉及受损的神经细胞、损伤部位以及靶器官三个层面，与再生的微环境密切相关。神经轴突横断后，缺损神经的近端和远端均发生退行性改变，包括轴突和髓鞘的崩解。神经缺损远端发生华勒氏变性，活化的雪旺细胞和巨噬细胞均参与清除轴突和髓磷脂碎片。在神经损伤部位的远端，再生的轴突需要克服若干障碍后才能实现靶器官的神经再支配。再生的轴突在支配靶器官的过程中，尽管有足够的数量，但是如果不能定向生长，重新支配靶器官，而是沿着其他的路径生长，错配到非靶器官，那么神经再生后的功能恢复效果往往不佳。
周围神经横断损伤是所有周围神经损伤类型中最严重的一种损伤类型，通常需要手术治疗，以恢复靶器官的生理功能。目前，临床针对短节段的神经缺损(5mm)采取神经断端的直接吻合技术，受损的神经轴突可自行修复。对于较长节段的神经缺损(＞5mm)，临床上通常采取自体神经移植术，这种术式是临床治疗神经缺损的“金标准”，但是应用该手术方式存在几个不可避免的缺点，例如供体神经的功能丧失、来源有限、直径长度与受体不匹配等。对于同种异体神经移植，优点主要包括：(1)易获得；(2)易保存；(3)对受者的不良影响较小；(4)可得到任意长度和口径的神经段，主要缺点为移植排斥反应。抑制免疫排斥反应主要有两种方法：(1)降低同种异体神经的免疫原性；(2)降低受者免疫反应性。因此，研究者们对同种异体神经移植采用了一些预处理方法，如冷冻、放疗等，降低自身免疫原性，或应用免疫抑制剂降低受者对异体神经的移植排斥反应。虽然上述两种方法均取得了一定的治疗效果，但是潜在需要关注的风险主要涉及自身免疫排斥、术区的感染以及神经肿瘤形成，限制了同种异体神经管道在临床的广泛应用。
近年来，神经组织工程学的迅速发展为临床治疗神经缺损带来新的希望。多种天然或人工合成多聚物可制备神经导管。天然多聚物主要包括：胶原、基底胶以及纤维连接蛋白等材料。Ruszczak等学者以猪I型和III型胶原为原料制备神经导管，桥联大鼠5mm坐骨神经缺损，获得满意的修复效果。术后1周，该导管良好的生物相容性得到证实；术后2周，在导管周围可见再生血管；术后4周，ED1阳性的巨噬细胞侵入神经缺损处。随后，该学者又应用该支架修复大鼠20mm坐骨神经缺损，但神经修复效果并不理想。Lohmeyer等学者将基底胶与雪旺细胞一起注入中空神经导管，随后应用该复合支架修复大鼠15mm坐骨神经缺损，实验结果显示:与单纯中空神经导管相比，该复合支架可有效促进神经再生。Bailey等学者将纤维连接蛋白与层粘连蛋白混合并填充在神经支架内部，随后将这种复合支架桥联大鼠15mm坐骨神经缺损，术后4周，实验结果显示：与盐水填充的中空神经支架相比，该支架逆行标记的运动和感觉神经元数量更多，轴突有髓化程度更高。人工合成多聚物主要包括：脂肪类多元酯(多聚羟乙酸(PGA)、多聚乳酸(PLA)、多聚羟基乙酸内酯(PCL)以及聚乳酸–聚乙醇酸共聚物(PLGA)等)、多聚磷酸酯高分子材料以及多聚丙烯腈-丙烯酸甲酯材料。Bini等学采用10：90的PLGA制备神经支架，该支架具有良好的柔韧性和渗透性，可减少缝合产生的张力，增加与外界营养物质交换的能力。他们应用该支架修复大鼠12mm坐骨神经缺损，术后一个月，实验结果表明：该导管具有良好的促进坐骨神经再生和功能恢复的效果。Wang等学者应用多聚磷酸酯高分子材料制备的神经导管修复大鼠1mm坐骨神经缺损，实验结果发现：与硅胶管相比，这种神经导管无结晶化现象，降解速度更快，再生有髓纤维数量更多，髓鞘厚度更厚。Kim等学者在缺乏外源性细胞或营养支持的条件下(如神经营养因子和细胞外基质蛋白等)，应用多聚丙烯腈-丙烯酸甲酯支架修复大鼠17mm胫神经缺损，电生理学和形态学分析结果均显示：该支架可有效促进感觉和运动神经再生，修复效果与自体神经移植相似，并明显优于非定向神经支架的修复效果。
在神经再生过程中，除了需要神经支架的物理桥连作用以外，还需要提供有效促进神经再生的营养支持，以达到协调促进神经再生的目的，更好更快的促进神经再生，促进靶器官的功能恢复。众所周知，神经营养因子在调控神经元活性和促进受损轴突再生方面具有重要作用。神经营养因子主要包括：神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3(Neurotrophin-3,NT-3)、神经营养素-4/5(Neurotrophin-4/5,NT-4/5)。神经营养因子通过与细胞表面特定受体结合的形式促进一系列神经反应，通常分为两类：p75和酪氨酸激酶受体(TrK)。作为神经营养因子家族中的重要成员，神经生长因子(nerve growth factor,NGF)不仅可以调控感觉神经元的生物活性，促进神经突起生长，而且还可以增强周围神经的再生能力。Rich等学者报道：在神经导管内填充NGF/盐水溶液，修复大鼠的坐骨神经损伤。这项实验结果表明，将NGF添加到神经导管内，可增加轴突的数量和髓鞘的厚度,并改善再生神经成熟度和内部结构。他们的研究结果得到了后续研究的支持。然而，另外一些学者应用NGF结合神经导管，修复神经损伤，却并没有得到上述阳性结果，可能是由于NGF从神经导管内渗漏，或NGF失去活性。目前在周围神经损伤局部应用NGF面临以下挑战：(1)NGF易遭受化学结构破坏或被其他化学物质修饰而失去生物活性；(2)NGF生物半衰期短，不能长期有效促进神经再生。因此，给NGF提供一种蛋白药物缓释载体是必要的，这种缓释载体不仅需要具有保护NGF生物活性免受外界环境破坏的能力，如光线、氧气以及化学物质等，而且还需要具有提高NGF生物利用率的能力。近年来随着组织工程技术的迅猛发展，多种人工和天然聚合物制备的蛋白药物载体在医药缓释领域得到广泛应用。其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactide-co-glycolide，PLGA)是最受关注的一种材料。然而，PLGA多聚物自身存在的一些不利因素，限制了在组织工程修复领域，尤其是神经领域的应用。例如，PLGA多聚物在降解过程中产生羟基乙酸和乳酸，降低周围微环境的pH值，导致包埋的蛋白药物丧失生物活性；此外，经PLGA材料制备的微球具有高“突释”率，可快速将包埋的蛋白药物释放到周围环境中，使缓释的药物接近或者超过中毒剂量，不利于周围神经损伤后早期轴突的再生和功能的恢复。为了克服上述缺点，一些学者使用物理或化学方法对PLGA微球的表面进行修饰，例如使用藻酸盐和壳聚糖涂覆技术。壳聚糖是一种天然的生物材料，主要具有以下优点：无毒性、独特的聚合阳离子特点、弱碱性、良好的生物相容性和生物降解性。壳聚糖的弱碱性特点可以中和PLA和PLGA的酸性降解产物。此外，最近有学者证实壳聚糖和壳聚糖的降解产物可促进轴突的生长和神经元的分化。
综上所述，神经组织工程学的迅速发展为临床治疗周围神经缺损带来新的希望。多种以人工、天然多聚物为主要原料的中空神经支架已经获得美国食品与药物管理局批准，可在临床应用。尽管这些支架对短节段的神经缺损有满意的修复效果，但是对长节段神经缺损的修复效果并不理想。分析原因后，我们认为目前的神经组织工程支架缺乏有效的微结构和化学营养功能。本研究在制备包埋NGF的单壳-多核微球缓释系统基础之上，研发一种NGF单壳-多核微球/纳米纤维支架，为临床治疗长节段的神经缺损提供一种新的思路和治疗方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管，这种微球/纳米纤维导管可以促进周围神经再生，支配靶肌肉的功能重建，更好更快的促进周围神经运动功能的恢复。
本发明的另一目的是提供一种NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法。
本发明所采用的第一技术方案是，NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管，包括聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管，聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管的内部均匀填充有包埋NGF的单壳-多核微球，其中，所述聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管的内径为0.7mm，聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管的管厚度为0.6mm。
本发明所采用的第二技术方案是，NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制备包埋NGF的PLGA微球：
步骤1.1、分别将50～100μg NGF、2～4mg肝素与50～100μL PBS溶液充分混合均匀，制备内水相W1，将200～300mg PLGA充分溶解于200～300μL二氯甲烷中，搅拌，溶解，制备油相；将内水相W1与油相混合并震荡形成乳白色的初乳液W1/O，重读上述步骤3次；
步骤1.2、将步骤1.1得到的初乳液W1/O加入20mL外层水相W2中，初乳液W1/O和外层水相W2震荡形成乳白色的双层终乳液W1/O/W2，重复上述步骤3次；
步骤1.3、将步骤1.2得到的双层终乳液W1/O/W2均匀搅拌充分蒸发有机溶剂二氯甲烷，完全固化溶液中包埋NGF的PLGA微球，经过冲洗、滤过、离心、冰冻干燥，将包埋NGF的PLGA微球冷藏；
步骤2、制备包埋NGF的单壳-多核微球：
步骤2.1、将壳聚糖粉末充分溶解于冰醋酸水溶液中得到浓度为3～5％w/v的壳聚糖溶液；
步骤2.2、将所述步骤1得到的包埋NGF的PLGA微球充分混合于所述步骤2.1得到的壳聚糖溶液中，搅拌均匀，得到包埋PLGA微球的壳聚糖溶液；
步骤2.3、将3～4mL表面活性剂Span80加入200～300mL液体石蜡油中机械搅拌均匀，将步骤2.2得到的包埋PLGA微球的壳聚糖溶液逐滴地加入液体石蜡油中，机械搅拌，得到水/油乳浊液；
步骤2.4、将5～7％w/v离子交联剂三聚磷酸钠STPP溶液逐滴加入步骤2.3得到的水/油乳浊液，机械搅拌一段时间以固化乳浊液中包埋NGF的单壳-多核微球；
步骤2.5、依次使用石油醚、异丙醇以及双蒸水反复清洗乳浊液，得到包埋NGF的单壳-多核微球，冰冻干燥后冷冻储存；
步骤3、制备聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管：
步骤3.1、将三氯甲烷和甲醇溶液按体积比5:1混合为10～15mL三氯甲烷/甲醇混合液，将3～5g聚乙酸内酯PCL充分溶解于三氯甲烷/甲醇混合液中搅拌静置除气后，得到完全溶解的PCL溶液；
步骤3.2、将步骤3.1得到的完全溶解的PCL溶液喷射在静电纺丝装置接收器不锈钢棒上；
步骤3.3、将粘着PCL纤维的不锈钢棒从静电纺丝装置取下，并在酒精中浸泡；从不锈钢棒上取下PCL纤维，剪成PCL纤维段，得到PCL纳米纤维神经中空导管，随后进行Co60消毒，备用；
步骤4、制备NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管：
将50mg所述步骤2得到的包埋NGF的单壳-多核微球溶解于2～3mLPBS溶液中，然后注射入所述步骤3得到的聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管内，得到NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管。
本发明第二技术方案的特点还在于，
步骤1.1中将50～100μg NGF、2～4mg肝素与50～100μL PBS溶液充分混合均匀的环境温度控制在4℃条件下，PBS溶液的pH值＝7.4；
将200～300mg PLGA充分溶解于200～300μL二氯甲烷中搅拌时用保鲜膜封闭烧瓶，防止二氯甲烷挥发；
将内水相W1与油相混合并震荡时使用超声细胞粉碎仪超声分散，超声细胞粉碎仪的探针头直径为3mm、超声分散时间30～50s、超声分散功率30～40％。
步骤1.2中外层水相W2为水溶液和0.2～0.3mL吐温80组成，将初乳液W1/O和外层水相W2震荡时使用超声细胞粉碎机超声分散，超声细胞粉碎仪的探针头直径为3mm、超声分散时间30～50s、超声分散功率30～40％。
步骤1.3中将步骤1.2得到的双层终乳液W1/O/W2均匀搅拌时使用磁力搅拌仪，搅拌时间为30～50min，搅拌速度为500rpm/min；
将包埋NGF的PLGA微球冷藏时的冷藏温度为4℃。
步骤2.4中机械搅拌水/油乳浊液的搅拌时间为1.5～2h；
所述步骤2.5中将包埋NGF的单壳-多核微球冷冻储存的储存温度为-20℃。
步骤3.1中将聚乙酸内酯PCL充分溶解于三氯甲烷/甲醇混合液中搅拌时采用磁力搅拌，搅拌时间为5～7h，静置时温度为室温。
步骤3.2具体如下：
使用注射器吸取10～15mL完全溶解的PCL溶液，在注射器上安装21号针头，并将注射器与静电纺丝装置连接，调整针头与静电纺丝装置接收器不锈钢棒之间的位置，使其保持在18～20cm，其中，静电纺丝装置接收器不锈钢棒直径为1.5mm；设置静电纺丝装置的电压为10～12kV、不锈钢棒的转速为20～40rpm/min、微量注射泵的流速为5～7mL/h，按照上述操作，PCL纤维在电场的作用下纺织于不锈钢棒上。
步骤3.3中将粘着PCL纤维的不锈钢棒在酒精中浸泡时间为10～15min。
本发明的有益效果是，NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管，该微球/PCL纳米纤维导管具有大量PCL纳米纤维丝构成，内部为中空结构，不仅可给受损的神经提供一种物理引导作用，而且可保护NGF的生物活性，可控性缓释具有生物活性的神经生长因子，加快神经再生速度，缩短再生神经轴突到达靶肌肉的时间，促进神经运动功能恢复，NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，为临床修复周围神经损伤提供一种新的思路和治疗策略，具有重要的临床意义。
附图说明
图1是本发明NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的截面示意图；
图2(a)是包埋NGF的PLGA微球的扫描电镜形态图；
图2(b)是NGF单壳-多核微球的扫面电镜形态图；
图2(c)是PCL纳米纤维导管的扫面电镜横截面图；
图2(d)是PCL纳米纤维导管扫面电镜横截面的放大图；
图3是NGF/PCL导管和NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管体外缓释动力学结果对比图；
图4(a)是暴露大鼠的坐骨神经图；
图4(b)是PCL纳米纤维导管外观图；
图4(c)是将NGF单壳-多核微球注射入PCL纳米纤维导管图；
图4(d)是NGF单壳-多核微球/纳米纤维导管桥连大鼠15mm坐骨神经缺损图；
图5(a)是术后12周，PCL导管组的腓肠肌萎缩图图5(b)是术后12周，NGF/PCL导管组的腓肠肌萎缩图；
图5(c)是术后12周，NFG单壳-多壳微球/PCL纳米纤维导管组萎缩程度图；
图5(d)是术后12周，自体神经移植组的腓肠肌萎缩图；
图5(e)是术后12周，不同移植组的肌纤维百分比的统计图；
图6(a)是术后12周，PCL导管组的神经再生；
图6(b)是术后12周，NGF/PCL导管组的神经再生；
图6(c)是术后12周，NFG单壳-多壳微球/PCL纳米纤维导管组的神经再生；
图6(d)是术后12周，自体神经移植组的神经再生；
图6(e)是术后12周，各移植组的再生轴突总面积的统计图；
图7(a)为术后不同时间点，复合肌肉动作电位的峰值图；
图7(b)为术后不同时间点，再生神经传导速度图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管，结构如图1所示，包括聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管，聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管的内部均匀填充有包埋NGF的单壳-多核微球，其中，所述聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管的内径为0.7mm，聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管的管厚度为0.6mm。
NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制备包埋NGF的PLGA微球：
步骤1.1、分别将50～100μg NGF、2～4mg肝素与50～100μL PBS溶液充分混合均匀，环境温度控制在4℃条件下，PBS溶液的pH值＝7.4，制备内水相W1，将200～300mg PLGA充分溶解于200～300μL二氯甲烷中，用保鲜膜封闭烧瓶搅拌，防止二氯甲烷挥发，溶解，制备油相；将内水相W1与油相混合并使用超声细胞粉碎仪超声分散，超声细胞粉碎仪的探针头直径为3mm、超声分散时间30～50s、超声分散功率30～40％，震荡形成乳白色的初乳液W1/O，重读上述步骤3次；
步骤1.2、将步骤1.1得到的初乳液W1/O加入20mL外层水相W2中，外层水相W2为水溶液和0.2～0.3mL吐温80组成，初乳液W1/O和外层水相W2震荡，震荡时使用超声细胞粉碎机超声分散，超声细胞粉碎仪的探针头直径为3mm、超声分散时间30～50s、超声分散功率30～40％，形成乳白色的双层终乳液W1/O/W2，重复上述步骤3次；
步骤1.3、将步骤1.2得到的双层终乳液W1/O/W2均匀搅拌充分蒸发有机溶剂二氯甲烷，均匀搅拌时使用磁力搅拌仪，搅拌时间为30～50min，搅拌速度为500rpm/min；待完全固化溶液中包埋NGF的PLGA微球，经过冲洗、滤过、离心、冰冻干燥，将包埋NGF的PLGA微球冷藏，冷藏温度为4℃；
步骤2、制备包埋NGF的单壳-多核微球：
步骤2.1、将壳聚糖粉末充分溶解于冰醋酸水溶液中得到浓度为3～5％w/v的壳聚糖溶液；
步骤2.2、将所述步骤1得到的包埋NGF的PLGA微球充分混合于所述步骤2.1得到的壳聚糖溶液中，搅拌均匀，得到包埋PLGA微球的壳聚糖溶液；
步骤2.3、将3～4mL表面活性剂Span80加入200～300mL液体石蜡油中机械搅拌均匀，将步骤2.2得到的包埋PLGA微球的壳聚糖溶液逐滴地加入液体石蜡油中，机械搅拌，得到水/油乳浊液；
步骤2.4、将5～7％w/v离子交联剂三聚磷酸钠STPP溶液逐滴加入步骤2.3得到的水/油乳浊液，机械搅拌1.5～2h以固化乳浊液中包埋NGF的单壳-多核微球；
步骤2.5、依次使用石油醚、异丙醇以及双蒸水反复清洗乳浊液，得到包埋NGF的单壳-多核微球，冰冻干燥后冷冻储存，储存温度为-20℃；
步骤3、制备聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管：
步骤3.1、将三氯甲烷和甲醇溶液按体积比5:1混合为10～15mL三氯甲烷/甲醇混合液，将3～5g聚乙酸内酯PCL充分溶解于三氯甲烷/甲醇混合液中采用磁力搅拌，搅拌时间为5～7h，室温静置除气后，得到完全溶解的PCL溶液；
步骤3.2、将步骤3.1得到的完全溶解的PCL溶液喷射在静电纺丝装置接收器不锈钢棒上，具体为：使用注射器吸取10～15mL完全溶解的PCL溶液，在注射器上安装21号针头，并将注射器与静电纺丝装置连接，调整针头与静电纺丝装置接收器不锈钢棒之间的位置，使其保持在18～20cm，其中，静电纺丝装置接收器不锈钢棒直径为1.5mm；设置静电纺丝装置的电压为10～12kV、不锈钢棒的转速为20～40rpm/min、微量注射泵的流速为5～7mL/h，按照上述操作，PCL纤维在电场的作用下纺织于不锈钢棒上；
步骤3.3、将粘着PCL纤维的不锈钢棒从静电纺丝装置取下，并在酒精中浸泡10～15min；从不锈钢棒上取下PCL纤维，剪成PCL纤维段，得到PCL纳米纤维神经中空导管，随后进行Co60消毒，备用；
步骤4、制备NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管：
将50mg所述步骤2得到的包埋NGF的单壳-多核微球溶解于2～3mLPBS溶液中，然后注射入所述步骤3得到的聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管内，得到NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管。
实验验证：
(一)扫描电镜检测：
为了评估制备出NGF单壳-多核微球和PCL纳米纤维导管的表面形态特征，对其进行扫描电镜检测；检测方法如下：分别将冰冻干燥的NGF单壳-多核微球和PCL纳米纤维导管粘附在固定装置上，喷金干燥后入镜观察；扫描电镜结果如图2所示，包埋NFG的PLGA微球表面光滑，微球之间分散均匀，无明显的粘连，如图2(a)；NGF单壳-多核微球的表面可以观察到很多隆起的小微球，即包埋NGF的PLGA微球，如图2(b)，这说明NGF单壳-多核微球制备成功；经“静电纺丝”技术制备的PCL纳米纤维导管由大量PCL纳米纤维丝构成，内部为中空结构，如图2(c)；从PCL纳米纤维导管的横截面放大图上看，管壁由束状PCL纳米纤维丝组成，排列相对不规则，纳米纤维丝之间存在大量不规则的孔隙结构，如图2(d)。
(二)缓释动力学检测
为了研究NGF/PCL纳米纤维导管和NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管释放NGF动力学特点，我们对其进行缓释动力学评估。具体操作步骤如下：将导管样本沿纵轴等分为3个节段并溶解于2～4ml PBS溶液中(pH 7.4)；将样本放置于37～37.5℃恒温摇床，匀速摇动(速度：100～120rmp/min)；在预设时间点，将样本从摇床内取出，吸取200～300μl缓释液，冷藏于-20℃冰箱，同时再将200～300μl PBS溶液加入样本继续摇动；最后对不同时间点吸取的缓释液行NGF–ELISA分析。缓释动力学结果如图3所示，NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管和NGF/纳米纤维导管均可持续缓释NGF达12周。NGF/纳米纤维导管缓释NGF分为两个阶段：突释阶段(0～2周)和平台阶段(3～12周)。突释阶段(0～2周)，NGF/纳米纤维导管快速释放NGF，NGF缓释率高达73.5％；平台阶段(3～12周)，NGF/纳米纤维导管缓慢释放NGF，NGF缓释率仅为5.1％。与NGF/纳米纤维导管组相比，NGF单壳-多核微球/纳米纤维导管释放NGF速度更慢。1周后，NGF缓释率仅为26.5％；在随后的缓释时间内(2～12w)，NGF单壳-多核微球/纳米纤维导管缓慢释放NGF，12周后，NGF总缓释率达到72.8％。
(三)实验分组和大鼠15mm坐骨神经缺损模型的构建
实验分组：选择雄性的SD大鼠100只，每只大鼠的体重约200～220g，根据实验需要，将SD大鼠随机分为4个组，具体分组情况如下：①PCL导管组(n＝25)；②NGF/PCL导管组(n＝25)；③NFG单壳-多壳微球/PCL导管组(n＝25)；④自体神经移植组(n＝25)。
大鼠坐骨神经缺损模型构建：将1％(w/v)戊巴比妥钠注入SD大鼠的腹腔内，对其进行麻醉。在大鼠麻醉后，剔除左腿毛发，常规消毒，铺无菌单。使用无菌手术刀切开皮肤，顿性分离皮下浅筋膜和肌肉，使坐骨神经暴露，锐性剪断坐骨神经，构建15mm坐骨神经缺损模型。对于自体神经移植组，是将切除的自体神经翻转180°后再进行缝合。对于PCL导管组，将15mm PCL纳米纤维神经中空导管与坐骨神经断端进行缝合。对于NGF/PCL导管组，将NGF溶液直接注射入PCL导管，然后与坐骨神经断端进行缝合。对于NFG单壳-多壳微球/PCL导管组，将NFG单壳-多壳微球注射入PCL导管，然后与坐骨神经断端进行缝合。最后采用5/0缝线对筋膜和皮肤进行缝合，NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管桥连大鼠15mm坐骨神经缺损模型参考图4(a)～图4(d)。
(四)腓肠肌的形态学分析
在术后12周，我们分别对不同移植组的大鼠患侧的腓肠肌进行了伊红-苏木精染色(HE染色)，计算有效腓肠肌肌纤维面积的百分比，评估不同移植组大鼠患侧的腓肠肌的萎缩程度，以评价再生神经的运动功能恢复情况。具体操作步骤如下所示：在术后12周，分别对各移植组的大鼠进行麻醉，常规消毒，铺无菌单，切取患侧的腓肠肌，立刻放入4％多聚甲醛溶液固定4h，静置过夜，30％蔗糖溶液低温保存5d。将大鼠患侧的腓肠肌切为横切面，腓肠肌横切面的厚度为20μm，依次经过梯度脱水、复水以及染色等步骤HE染色。我们在光学显微镜下对每个HE染色的切片选取不同的视野范围，分别为上面、下面、左侧、右侧、中间，使用软件计算腓肠肌的肌肉面积和视野面积的比值(Percentage of muscle fiber area，Pm)，以评估不同移植组神经再生后的运动功能恢复情况。计算公式如下所示：Pm＝Am/At×100％
在这个计算公式中，Am代表200×视野下腓肠肌的肌纤维所占像素数，At代表200×视野下图片的总像素数。
可以看出，术后12周各移植组的腓肠肌HE染色和统计结果如下：
*p<0.05与PCL导管组比较；#p<0.05与NGF/PCL导管组比较。术后12周对不同移植组的大鼠进行腓肠肌的HE染色，评估不同移植组靶肌肉的恢复情况。PCL导管组的腓肠肌发生严重的萎缩，导致肌纤维的间距增大，细胞核分布不规则，如图5(a)；与PCL导管组相比，NGF/PCL导管组的腓肠肌萎缩程度较轻，肌纤维的间距较小，如图5(b)；与NGF/PCL导管组相比，NFG单壳-多壳微球/PCL纳米纤维导管组和自体神经移植组的腓肠肌萎缩程度轻，腓肠肌的形态相对排列整齐，细胞核分布规则，如图5(c)～如图5(d)。在此基础上，我们对各移植组的腓肠肌横截面积进行统计学分析，结果显示：术后12周，NFG单壳-多壳微球/PCL导管组的肌纤维百分率较PCL导管组和NGF/PCL导管组显著增加(p<0.05，如图5(e))。上述实验结果表明：PCL导管组或者NGF/PCL导管组均可促进靶肌肉的神经再支配，但是逆转靶肌肉萎缩的程度仍然低于自体神经移植组，而NFG单壳-多壳微球/PCL导管组可有效促进靶肌肉的神经再支配，逆转靶肌肉的萎缩，达到接近自体神经移植组的恢复效果。
(五)组织形态学分析
我们对不同移植组的再生神经远端行甲苯胺蓝染色，以评估神经再生情况。术后4周、8周及12周，经大鼠腹主动脉灌注福尔马林(浓度：4％)，切取移植物远端约2毫米处的神经组织，4％多聚甲醛溶液固定4h，树脂包埋，制备半薄切片(厚度：1μm)和超薄切片(厚度：50nm)。半薄切片行甲苯胺蓝染色并放置于光学显微镜下观察，超薄切片行乙酸双氧铀和枸橼酸铅染色并放置于透射电镜下观察。我们分别应用以下指标对神经再生情况进行分析：①单位面积内有髓神经纤维的数量(Mtot)；②再生神经的总面积(Atot)；③神经纤维的平均直径；④神经纤维的有髓程度(轴突直径与神经纤维直径的比值，G–ratio)。
术后12周甲苯胺蓝神经染色以及各时间点的再生轴突面积评估。A：PCL导管组；B：NGF/PCL导管组；C：NGF单壳-多核微球/PCL导管组；D：自体神经移植；E再生总面积。*p<0.05与PCL导管组比较；#p<0.05与NGF/PCL导管组比较。为了评估不同移植组的轴突再生质量，我们对再生轴突进行了甲苯胺蓝神经染色(图6(a)～图6(d))，通过分析上述图片，进一步行再生轴突的组织形态计量学分析，如图6(e)。甲苯胺蓝神经染色结果显示：术后12周，在各神经移植组的远端均可见不同数量、不同密度的再生轴突。我们发现NGF单壳-多核微球/PCL导管组和自体神经移植组的再生轴突数量和密度均高于PCL导管组和NGF/PCL导管组，而NGF单壳-多核微球/PCL导管组和自体神经移植组之间的再生轴突数量和密度并无明显差异。术后不同时间点，NGF单壳-多核微球/PCL导管组的再生轴突总面积显著优于PCL导管组和NGF/PCL导管组(p<0.05)，而NGF单壳-多核微球/PCL导管组和自体神经移植组之间无明显差异(p>0.05)。上述实验结果说明：NGF单壳-多核微球/PCL导管组可有效提高再生轴突的质量，达到接近自体神经移植组的修复效果。
(六)神经电生理检测
术后4周、8周以及12周，我们分别对不同移植组的大鼠进行了神经电生理检测。神经电生理测定的指标包括：复合肌肉动作电位的峰值和神经传导速度。具体操作步骤如下所示：术后4周、8周和12周，分别对各移植组的大鼠进行麻醉，常规消毒，铺无菌单，依次切开皮肤、皮下浅筋膜，钝性分离周围肌肉组织，显露移植物，并放置一个绝缘的胶皮。神经电生理检测电极分为刺激电极和记录电极。在腓肠肌内埋入记录电极，移植物近端神经1厘米处埋入刺激电极，在刺激电极和记录电极之间放置地极。应用BL-420F生物机能实验系统分别记录复合肌肉动作电位的波幅、潜伏期以及神经传导速度，统计相关实验数据，评估神经再生后的功能恢复情况。
术后各时间点的神经电生理检：图7(a)为复合肌肉动作电位的峰值图，图7(b)为再生神经传导速度图。*p<0.05与PCL导管组比较；#p<0.05与NGF/PCL导管组比较。分别在术后4周、8周及12周对不同移植组的大鼠患侧行神经电生理检测，评估不同移植组对靶肌肉功能的恢复情况。神经电生理检测检测结果显示：在不同时间点，NGF单壳-多核微球/PCL导管组的复合肌肉动作电位和神经传导速度均显著高于PCL导管组和NGF/PCL导管组(p<0.05)，NGF单壳-多核微球/PCL导管组与自体神经移植组之间无显著差异(p>0.05)。上述实验结果说明：单纯PCL导管组或者NGF/PCL导管组均可促进靶肌肉的功能恢复，但是恢复效果均显著低于自体神经移植组，而NGF单壳-多核微球/PCL导管组可有效促进靶肌肉的功能恢复，达到接近自体神经移植组的恢复效果。

Claims (9)

1.NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管，其特征在于，包括聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管，聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管的内部均匀填充有包埋NGF的单壳-多核微球，其中，所述聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管的内径为0.7mm，聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管的管厚度为0.6mm。
2.NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制备包埋NGF的PLGA微球：
步骤1.1、分别将50～100μg NGF、2～4mg肝素与50～100μL PBS溶液充分混合均匀，制备内水相W1，将200～300mg PLGA充分溶解于200～300μL二氯甲烷中，搅拌，溶解，制备油相；将内水相W1与油相混合并震荡形成乳白色的初乳液W1/O，重读上述步骤3次；
步骤1.2、将步骤1.1得到的初乳液W1/O加入20mL外层水相W2中，初乳液W1/O和外层水相W2震荡形成乳白色的双层终乳液W1/O/W2，重复上述步骤3次；
步骤1.3、将步骤1.2得到的双层终乳液W1/O/W2均匀搅拌充分蒸发有机溶剂二氯甲烷，完全固化溶液中包埋NGF的PLGA微球，经过冲洗、滤过、离心、冰冻干燥，将包埋NGF的PLGA微球冷藏；
步骤2、制备包埋NGF的单壳-多核微球：
步骤2.1、将壳聚糖粉末充分溶解于冰醋酸水溶液中得到浓度为3～5％w/v的壳聚糖溶液；
步骤2.2、将所述步骤1得到的包埋NGF的PLGA微球充分混合于所述步骤2.1得到的壳聚糖溶液中，搅拌均匀，得到包埋PLGA微球的壳聚糖溶液；
步骤2.3、将3～4mL表面活性剂Span80加入200～300mL液体石蜡油中机械搅拌均匀，将步骤2.2得到的包埋PLGA微球的壳聚糖溶液逐滴地加入液体石蜡油中，机械搅拌，得到水/油乳浊液；
步骤2.4、将5～7％w/v离子交联剂三聚磷酸钠STPP溶液逐滴加入步骤2.3得到的水/油乳浊液，机械搅拌一段时间以固化乳浊液中包埋NGF的单壳-多核微球；
步骤2.5、依次使用石油醚、异丙醇以及双蒸水反复清洗乳浊液，得到包埋NGF的单壳-多核微球，冰冻干燥后冷冻储存；
步骤3、制备聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管：
步骤3.1、将三氯甲烷和甲醇溶液按体积比5:1混合为10～15mL三氯甲烷/甲醇混合液，将3～5g聚乙酸内酯PCL充分溶解于三氯甲烷/甲醇混合液中搅拌静置除气后，得到完全溶解的PCL溶液；
步骤3.2、将步骤3.1得到的完全溶解的PCL溶液喷射在静电纺丝装置接收器不锈钢棒上；
步骤3.3、将粘着PCL纤维的不锈钢棒从静电纺丝装置取下，并在酒精中浸泡；从不锈钢棒上取下PCL纤维，剪成PCL纤维段，得到PCL纳米纤维神经中空导管，随后进行Co60消毒，备用；
步骤4、制备NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管：
将50mg所述步骤2得到的包埋NGF的单壳-多核微球溶解于2～3mLPBS溶液中，然后注射入所述步骤3得到的聚乙酸内酯PCL纳米纤维神经中空导管内，得到NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管。
3.根据权利要求2所述的NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，其特征在于，所述步骤1.1中将50～100μg NGF、2～4mg肝素与50～100μL PBS溶液充分混合均匀的环境温度控制在4℃条件下，PBS溶液的pH值＝7.4；
将200～300mg PLGA充分溶解于200～300μL二氯甲烷中搅拌时用保鲜膜封闭烧瓶，防止二氯甲烷挥发；
将内水相W1与油相混合并震荡时使用超声细胞粉碎仪超声分散，超声细胞粉碎仪的探针头直径为3mm、超声分散时间30～50s、超声分散功率30～40％。
4.根据权利要求2所述的NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，其特征在于，所述步骤1.2中外层水相W2为水溶液和0.2～0.3mL吐温80组成，将初乳液W1/O和外层水相W2震荡时使用超声细胞粉碎机超声分散，超声细胞粉碎仪的探针头直径为3mm、超声分散时间30～50s、超声分散功率30～40％。
5.根据权利要求2所述的NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，其特征在于，所述步骤1.3中将步骤1.2得到的双层终乳液W1/O/W2均匀搅拌时使用磁力搅拌仪，搅拌时间为30～50min，搅拌速度为500rpm/min；
将包埋NGF的PLGA微球冷藏时的冷藏温度为4℃。
6.根据权利要求2所述的NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，其特征在于，所述步骤2.4中机械搅拌水/油乳浊液的搅拌时间为1.5～2h；
所述步骤2.5中将包埋NGF的单壳-多核微球冷冻储存的储存温度为-20℃。
7.根据权利要求2所述的NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，其特征在于，所述步骤3.1中将聚乙酸内酯PCL充分溶解于三氯甲烷/甲醇混合液中搅拌时采用磁力搅拌，搅拌时间为5～7h，静置时温度为室温。
8.根据权利要求2所述的NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，其特征在于，所述步骤3.2具体如下：
使用注射器吸取10～15mL完全溶解的PCL溶液，在注射器上安装21号针头，并将注射器与静电纺丝装置连接，调整针头与静电纺丝装置接收器不锈钢棒之间的位置，使其保持在18～20cm，其中，静电纺丝装置接收器不锈钢棒直径为1.5mm；设置静电纺丝装置的电压为10～12kV、不锈钢棒的转速为20～40rpm/min、微量注射泵的流速为5～7mL/h，按照上述操作，PCL纤维在电场的作用下纺织于不锈钢棒上。
9.根据权利要求2所述的NGF单壳-多核微球/PCL纳米纤维导管的制备方法，其特征在于，所述步骤3.3中将粘着PCL纤维的不锈钢棒在酒精中浸泡时间为10min。
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