CN103371857A

CN103371857A - 复合型生物套管及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103371857A
Application number: CN2012101065998A
Authority: CN
Inventors: 魏世成; 任晓帅; 成艳
Original assignee: Beijing 3H Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing 3H Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2012-04-12
Filing date: 2012-04-12
Publication date: 2013-10-30

Abstract

本发明提供一种复合型生物套管及其制备方法和应用。本发明的复合型生物套管包括中空的生物导管和在所述生物导管的内壁上的缓释微囊层。通过将甲壳胺的纺丝原液从中空喷丝孔的皮层挤出来制备所述中空的生物导管，然后将包含有缓释微囊的液体注入到所述中空的生物导管的内腔、干燥，即可得到在所述生物导管的内壁上存在缓释微囊层的复合型生物套管。本发明的复合型生物套管适用于周围神经小间隙套接缝合，套管内壁缓释微囊为受损神经持续提供促神经生长物质，有利于提高周围神经损伤的修复效果。

Description

复合型生物套管及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种复合型生物套管及其制备方法。更具体地，涉及一种适用于周围神经小间隙套接缝合且能够在损伤局部为受损神经提供持续的促神经生长物质的复合型生物套管及其制备方法和应用。

背景技术

临床上对周围神经离断伤的常规治疗方法是神经外膜缝合或神经束膜缝合术。Cajal等人证明近断端神经纤维是选择性地长入神经远断端，而不会长入其它组织，这就是周围神经再生的趋向性(也称为选择性再生理论)。

基于以上理论有人提出新的修复周围神经方法：小间隙套接缝合技术。即用管型材料将离断的近远端周围神经套接缝合，套接缝合时在两神经断端之间形成相对封闭的神经再生室，有利于内源性神经营养因子发挥作用，为神经再生提供有利的微环境，促进神经轴突的生长，提高神经再生的效率，减少神经轴突逃逸，降低缝合口处神经瘤的形成。例如专利文献CN01134542.X和CN011363314.2报道了以甲壳胺或海藻酸钠为主要原料制成的人工生物套管；专利文献US4534349A采用聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乙交酯-丙交酯)、聚酯酰胺等合成聚合物及其共聚、共混物制备神经修复导管；专利文献WO9844020A1和WO9844021A1报道了含磷酸酯基团的合成聚合物用于制作神经生长的导管。

但是，由于缺乏有效的促神经生长药物支持，诸如上述神经导管的神经缝合技术虽然有了很大的提高，但临床周围神经修复效果仍不能让人满意。此外，有些上述公开的神经导管存在制备困难、或者在可吸收性和组织相容性方面存在缺陷，从而为未能在临床上取得实际应用。

目前采用手术中损伤点局部喷洒促神经生长药物、术后口服促神经生长药物的方式。前者虽为局部给药，但药物短期内即代谢，难以发挥促神经生长效果；后者全身口服给药，局部浓度较低，并容易引起不良反应和并发症。局部缓释给药是周围神经损伤修复的较理想给药方式。有研究应用微量泵向损伤局部泵入促神经生长药物，但是这项技术需要特制微量泵植入损伤局部，操作复杂、费用较高，很难达到普及应用。

此外，专利文献CN03134541.7报道了一种用于修复周围神经缺损的组织工程化周围神经，其中生物导管内添加了神经胶质细胞或可向神经胶质细胞分化的肝细胞作为种子细胞、和缓释促神经生长物质等。但是，该发明主要用于周围神经缺损的修复，而不是用于周围神经小间隙套接缝合。而且该专利在神经导管中注入神经胶质细胞和多种神经营养因子，其目的是为套接缺损提供支架材料、营养因子和细胞学支撑，由于充填多种物质，该修复周围神经缺损的组织工程化周围神经构造复杂，而且由于其制造和保存的条件要求严格，使得其至今未能批量用于临床应用。此外，相关实验也证实这种应用于神经缺损的人工神经仍不能很好的解决再生神经轴突有效通过神经缺损的问题，故目前仍无法达到自体神经移植的修复效果，故临床极少应用。

发明内容

鉴于现有技术中存在的缺陷，本发明通过将小间隙套接缝合技术与药物缓释技术有效结合，即在套接缝合所形成的小间隙内添加促神经生长缓释物质，由此既可以完成周围神经损伤的修复，同时其中的局部缓释系统又可以为神经再生提供长期的刺激因子和营养物质，极大地提高了周围神经的修复效果。

因此，本发明所要解决的技术问题是提供一种既可用于周围神经小间隙套接缝合，同时又可实现促神经生长物质局部长期持久释放的复合型生物套管。

进一步地，本发明所要求解决的技术问题是提供一种制备所述复合型生物套管的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下的技术方案：

根据本发明的一种实施方式，提供一种复合型生物套管，其包括中空的生物导管和在所述中空的生物导管内壁上存在的缓释微囊层。

优选地，所述复合型生物套管的内径为0.5mm～10mm。

优选地，所述复合型生物套管的长度大于或等于3mm。

优选地，所述复合型生物套管的管壁厚度0.1～2mm。

优选地，所述缓释微囊层为含有促进神经生长物质的缓释微囊层。

优选地，所述促进神经生长物质是选自神经生长因子和脑源性神经生长因子中的至少一种。

优选地，所述中空的生物导管为由生物可降解材料制成的中空的生物导管。

优选地，所述中空的生物导管为甲壳胺制备得到的中空的生物导管。

根据本发明另一个实施方式，提供一种复合型生物套管的制备方法，包括：

将生物可降解材料溶解于溶剂中，形成生物可降解材料的无泡纺丝原液；

从中空喷丝孔中挤出该纺丝原液，获得中空的生物导管；

通过复乳法制备包含神经生长因子的缓释微球的液体；以及

将包含上述缓释微球的液体注入到所述中空的生物导管的内腔，且干燥，获得在所述中空的生物导管的内壁上具有微囊层的复合型生物套管。

优选地，所述缓释微球为含有促进神经生长物质的缓释微球。

根据本发明的复合型生物套管在中空的生物导管的内壁上具有缓释微囊层，当将此复合型生物套管应用于小间隙套接修复周围神经的时，术后套管内壁缓释微囊还能为受损神经长期提供促神经生长物质，有利于提高周围神经损伤修复效果。

附图说明

图1是根据本发明的一种实施方式的复合型生物套管的截面示意图；

图2是根据本发明的实施方式所制备的缓释微球的扫描电镜图；

图3是根据本发明的实施方式的缓释微球的累积释放曲线图；

附图符号说明：

1-复合型生物套管

2-中空的生物导管

3-缓释微囊层

具体实施方式

为了更好地了解本发明实施方式的优点，下文将结合优选的实施方式以及实施例对本发明的技术方案进行说明，但是本发明的保护范围并不受这些具体实施方式和实施例的限制。

根据本发明的一个实施方式，提供一种复合型生物套管，其包括中空的生物导管和在该中空的生物导管的内壁上存在的缓释微囊层。

通过在根据本发明的复合型生物套管的中空的生物导管内壁上存在缓释微囊层，当将此复合型生物套管应用于小间隙套接修复周围神经时，术后套管内壁上的缓释微囊能够为受损神经长期提供促神经生长物质，有利于提高周围神经损伤的修复效果。

根据本发明的优选实施方式，所述复合型生物套管的内径为0.5mm～10mm。进一步优选为1mm～8m，甚至优选为1.5mm～7mm。例如，所述复合型生物套管的内径可以为2mm、3mm、4mm、5mm或6mm。

根据本发明的述复合型生物套管的长度是根据实际使用的需要来确定的。一般优选所述复合型生物套管的长度为3mm～20cm。例如，所述复合型生物套管的长度可以选择为3.5mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、2cm、5cm、7cm、10cm、15cm、18cm或者20cm。

根据本发明的另一个优选实施方式，所述复合型生物套管的管壁厚度小于等于2mm。进一步优选其管壁厚度为0.1～2mm。甚至优选其管壁厚度为0.15～1.5mm；更优选其管壁厚度为0.15～1.0mm；最优选其管壁厚度为0.15～0.85mm。

根据本发明的优选实施方式，所述复合型生物套管中的缓释微囊层是含有促进神经生长物质的缓释微囊层。优选地，所述促进神经生长的物质是选自神经生长因子、脑源性神经生长因子、睫状神经生长因子、神经营养素-3、胰岛素样生长因子、胶状细胞源性神经营养因子中的至少一种。

根据本发明的另一个优选实施方式，所述中空的生物导管为由生物降解材料制成的中空的生物导管。优选地，所述生物降解材料是选自甲壳胺、几丁质、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸中的至少一种。甚至优选地，所述中空的生物导管为甲壳胺制备得到的中空的生物导管。最优选地，由甲壳胺制备的中空的生物导管的脱乙酰度为27％，在0.9％的氯化钠水溶液中无溶解，在湿态下穿针无脆裂。

根据本发明的另一个实施方式，提供一种复合型生物套管的制备方法，该方法包括：

从中空喷丝孔中挤出该纺丝原液，获得中空的生物导管；

通过复乳法制备包含神经生长因子的缓释微球的液体；以及将包含上述缓释微球的液体注入到所述中空的生物导管的内腔，且在真空低温下干燥，获得在所述中空的生物导管的内壁上具有微囊层的复合型生物套管。

根据本发明的优选实施方式，所述促进神经生长的物质是选自神经生长因子、脑源性神经生长因子、睫状神经生长因子、神经营养素-3、胰岛素样生长因子、胶状细胞源性神经营养因子等中的至少一种。

根据本发明进一步优选的实施方式，所述生物降解材料是选自甲壳胺、几丁质、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸中的至少一种。更优选地，所述生物可降解材料是甲壳胺。优选所述溶剂是稀醋酸水溶液，例如醋酸重量含量为2％～10％的稀醋酸水溶液，例如优选为2重量％、4重量％和5重量％的稀醋酸水溶液。

根据本发明进一步优选的实施方式，根据本发明方法制备的复合型生物套管的内径为0.5mm～10mm，长度为3mm～20cm，以及管壁厚度为0.1～2mm。

根据本发明进一步优选的实施方式，所述干燥步骤是在4～10℃条件下，真空冷冻干燥机上冷冻干燥。

通过根据上述的本发明方法可以制备出本发明的复合型生物套管。该制备方法通过简单的挤出纺丝溶液来获得中空的生物导管，以及灌注包含上述缓释微球的液体到所述中空的生物导管的内腔且干燥等工艺步骤，即可得到本发明的复合型生物套管。该制备方法工艺简单、成本低廉，易于推广临床应用。此外，根据本发明方法制备的复合型生物套管可以应用于小间隙套接修复周围神经，手术后套管内壁缓释微囊还能为受损神经长期提供促神经生长物质，有利于提高周围神经损伤的修复效果。

下面结合附图来进一步说明本发明的复合型生物套管的结构。

如图1所示，图1是本发明的一种复合型生物套管的截面示意图。图中，1代表复合型生物套管；2代表中空的生物导管；3代表缓释微囊层。复合型生物套管1包括中空的生物导管2和缓释微囊层3。当将此复合型生物套管1应用于小间隙套接修复周围神经的时，术后套管内壁缓释微囊还能为受损神经长期提供促神经生长物质，有利于提高周围神经损伤修复效果。

复合型生物套管1的形状为管状，优选为规则的圆柱形管状，由于一般的复合型生物套管1均为较为柔软的材料制成，因此，即使圆柱形管状的有些变形也是可以接受的。

下面结合具体的实施例来描述本发明的复合型生物套管及其具体的制备方法。

实施例1：复合型生物套管的制备

1.制备中空的生物导管

将市售脱乙酰度为82％、重均分子量为37.7万的甲壳胺(购买自上海佳和生物科技有限公司)按4％浓度(W/W，重量比)溶解于2％(重量比)的稀醋酸水溶液中，得到高粘度溶液。抽真空脱泡12小时得到无泡纺丝原液。将纺丝原液以0.6MPa(兆帕)的空气压力从釜中压出，经纺丝计量泵计量，从中空喷丝孔的皮层挤出，与此同时，以0.2MPa的空气压力将5％NaOH(W/W)水溶液(作为凝固剂)从中空喷丝孔的芯层挤出。纺丝原液挤出后直接进入5％NaOH(W/W)水溶液凝固浴，在外界和芯层凝固剂的同时作用下甲壳胺得以析出凝固。然后，经导辊引出后牵伸1.25倍，得到连续的甲壳胺中空管，管内径0.95mm，管壁厚度0.15mm。将甲壳胺中空管用水洗涤至pH＝7，用甲醇脱水后置于40℃、5％醋酸酐-甲醇溶液(V/V，体积比)中，50分钟后取出，用甲醇洗涤。然后置于1％稀醋酸水溶液中浸洗，风干，再以75％乙醇洗涤，洗涤后浸泡于75％乙醇中消毒备用。其中，所得甲壳质中空导管的脱乙酰度为27％，在生理盐水(质量分数为0.9％的NaCl水溶液)中无溶解，湿态下穿针无脆裂。

2.制备缓释微球及其性能测试

2.1复乳法制备对照PLGA微球

采用W/O/W复乳溶剂挥发法制备缓释微球。将50μL的表面活性剂聚乙二醇400溶于100μL的去离子水中得到内水相(W1)；将50mg的PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid，聚乳酸-羟基乙酸共聚物)溶于3mL二氯甲烷中得到油相(O)；外水相(W2)为1.5％的聚乙烯醇溶液30ml；将W1倒入O中，超声处理30秒得到初乳(W1/O)，将初乳倒入W2中，在悬臂式搅拌机上以1000转/分钟搅拌6分钟，得到W1/O/W2复乳。将复乳在室温(～25℃)下于悬臂式搅拌机以500转/分钟搅拌4小时挥发残余有机溶剂，通过13800转/分钟离心收集微球，并用去离子水洗涤3次，密封放在零下20℃冰箱中，真空冷冻干燥机上冷冻干燥，得到空白缓释微球，置于4℃下保存。

2.2复乳法制备NGF-β-PLGA缓释微球

采用W/O/W复乳溶剂挥发法制备缓释微球。将10μg的NGF-β、5mg的牛血清白蛋白以及50μL的表面活性剂聚乙二醇400溶于100μL的去离子水中得到内水相(W1)；100mg的PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到油相(O)；外水相(W2)为1.5％的聚乙烯醇溶液；将W1倒入O中，超声处理30秒得到初乳(W1/O)，将初乳倒入W2中，在悬臂式搅拌机上以1000转/分钟搅拌6分钟，得到W1/O/W2复乳，将复乳倒入400mL的10％去离子水氯化钠溶液中，室温下磁力搅拌机上搅拌4小时挥发残余有机溶剂，通过13800转/分钟离心收集微球，并用去离子水洗涤5次，真空冷冻干燥机上冷冻干燥48小时，得到NGF-β-PLGA缓释微球，置于4℃的温度下保存。

2.3缓释微球的性能测试

2.3.1缓释微球的形态和粒径

取少量制备的NGF-β-PLGA缓释微球，在扫描电子显微镜中观察缓释微球微观结构，具体参见说明书附图2。

2.3.2缓释微球的载药量和包封率

NGF-β-PLGA缓释微球的载药量和包封率的测量

取10mg NGF-β-PLGA缓释微球溶于0.5mL的乙酸乙酯中，然后加入2mL的去离子水，在振荡器上充分混匀，静置，取下清液，萃取乙酸乙酯中的NGF-β，重复3次，用ELISA法在490nm波长下测定所得NGF-β溶液的吸光度，以空白微球降解液作为空白对照，代入标准曲线，计算NGF-β的含量。

多次重复测量结果显示：本实例制备的缓释微球中NGF-β的平均含量为0.0047％，包封率均值为18.2％。

2.3.3缓释微球的体外释放的测定

准确称取20mg缓释微球置于透析袋中，密闭封口，然后置于60mL作为降解介质的PBS缓冲液(pH 7.4)，放入37℃的恒温振荡水浴摇床中，以150转/分钟的速度进行振摇，分别在2、4、8、12、24小时及2、4、7、10、14、21和28天时，分别取出2mL放入-20℃冰箱冷冻保存，其余补充等量的新鲜PBS液后放回缓释装置中。最后采用ELISA法测定NGF-β质量浓度，计算每次取样时释放的NGF-β总量，并绘制微球累积释放曲线。微球累积释放曲线参见说明书附图3。

本发明中NGF-β释放周期在2周左右，这与小间隙套接缝合技术修复周围神经再生规律相符合，能够长期为神经再生提供良好的营养物质支持。

2.3.4微球中NGF-β活性的检测

通过对PCI2细胞突起的计数来检测NGF的活性。将生长良好的PCI2细胞接种于预先经鼠尾胶原包被的6孔培养板中，接种密度为2×10⁴/cm²，每孔加入2mL含体积分数为10％马血清和体积分数为5％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、体积分数为5％CO₂及饱和湿度条件下培养3h后随机分组，分为NGF组(阳性对照组)、不含NGF的空白微球组(阴性对照组)、含NGF缓释微球组(实验组)，分别以50pg/L的NGF、空白微球的缓释液、含NGF缓释微球组的缓释液(所有微球缓释液均用0.22μm滤器过滤除菌)各2mL替换原细胞培养液，继续培养48小时后，在显微镜上随机选取视野，计数100个细胞，并计算每组中细胞最长突起长度大于胞体直径的细胞(即阳性细胞)的比例，阳性细胞比例(％)＝阳性细胞数/计数细胞数，每组实验重复3次。

培养结果显示：NGF组(阳性对照组)和含NGF缓释微球组(实验组)细胞生长情况类似，较不含NGF的空白微球组(阴性对照组)，培养的细胞密度较大、数量较多，细胞突起长度较长。NGF组(阳性对照组)、不含NGF的空白微球组(阴性对照组)、含NGF缓释微球组(实验组)阳性细胞比率分别为：57.3％、29.6％、54.2％。结果表明缓释微球能够达到充分释放功能，并能保证NGF的生物学活性。

3.复合型生物套管的制备

将上述新鲜制备的缓释微球置于去离子水中(缓释微球与去离子水重量比为1∶100)，制成缓释微球混悬液，将配制好的混悬液注入到所述中空的生物导管的内腔，然后将此导管置于真空冷冻干燥机上冷冻干燥24小时，使得微球贴于中空管内壁，从而获得在所述中空的生物导管的内壁上具有微囊层的复合型生物套管。

实施例2：复合型生物套管小间隙套接修复动物周围神经缺损

选用SPF级健康雄性SD大鼠30只(220～250g)，随机分为A、B、C、D、E组，采用戊巴比妥钠(2ml/kg(毫升/千克)，腹腔注射)麻醉，无菌条件下暴露右侧坐骨神经。

A组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断胫神经，用10-0显微缝线膜缝合；

B组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断胫神经，用10-0尼龙线2针外膜缝合。缝合后缝合点局部喷洒含神经生长因子、神经营养因子混合液2ml；

C组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断胫神经，用10-0尼龙线2针单纯套管小间隙套接缝合；

D组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断胫神经，用10-0尼龙线2针单纯套管小间隙套接缝合，用微量注射器向套接间隙内注入含神经生长因子、神经营养因子混合液50ul(微升)；

E组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断胫神经，用10-0尼龙线2针复合套管小间隙套接缝合。

观察项目及检测方法：

1)一般情况观察：大鼠一般情况、手术侧患肢活动情况及溃疡情况。

2)术后12周分别进行：

a.大鼠胫神经功能评分：应用墨迹法测量大鼠胫神经功能评分。

评分公式为：

胫神经功能指数＝-37.2×足印长度因子+104.4足印宽度因子+中间足趾宽度因子。

b.电生理测量；结果采用spss11.0软件进行单因素方差分析，进行组间比较。

c.双侧神经取材，锇酸染色，有髓神经纤维组织学观察及计数。结果统计处理：单位视野有髓神经纤维计数结果采用SPSS11.0进行单因素方差分析，进行组间比较。

d.胫神经支配肌肉组织学观察。

观察以及检测的实验结果如下：

1)一般情况：所有实验大鼠均手术顺利，无一只死亡，所有大鼠患肢均无出现足部溃疡。

2)大鼠胫神经功能评分：平均值E组＞C组＞D组＞B组＞A组(值越高代表功能恢复越好)其中A、B、C、D组之间没有统计学差异，E组与其他四组均有统计学差异。

3)电生理结果：E组神经传导速度明显高于其他A、B、C、D 4组，差异具有统计学意义，其他四组之间没有统计学差异。

4)锇酸染色：E组有髓神经纤维较其他四组均一，且髓鞘厚度也较厚，其他四组之间无明显差异。有髓神经纤维计数E组明显高于其他四组，差异具有统计学意义。

5)肌肉组织学观察，各组伤侧肌肉均较健侧肌肉有一定程度的萎缩，肌纤维直径均一度也较正常差，但各组之间无明显差异。

利用本发明的复合型生物套管应用于小间隙套接修复周围神经的时，不会出现溃疡，电生理结构优异，并且有髓神经纤维较均一，且髓鞘厚度也较厚，有髓神经纤维计数高。

Claims

1.一种复合型生物套管，包括中空的生物导管和在所述中空的生物导管的内壁上的缓释微囊层。

2.根据权利要求1所述的复合型生物套管，其特征在于，所述复合型生物套管的内径为0.5mm～10mm。

3.根据权利要求1或2所述的复合型生物套管，其特征在于，所述复合型生物套管的长度3mm～20cm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的复合型生物套管，其特征在于，所述复合型生物套管的管壁厚度为0.1～2mm。

5.根据权利要求1所述的复合型生物套管，其特征在于，所述缓释微囊层为含有促进神经生长的物质的缓释微囊层。

6.根据权利要求5所述的复合型生物套管，其特征在于，所述促进神经生长的物质是选自神经生长因子和脑源性神经生长因子中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的复合型生物套管，其特征在于，所述中空的生物导管为由生物降解材料制成的中空的生物导管。

8.根据权利要求7所述的复合型生物套管，其特征在于，所述生物降解材料是选自甲壳胺、几丁质、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的复合型生物套管，其特征在于，所述生物可降解材料是甲壳胺，其中由甲壳胺制成的中空的生物导管的脱乙酰度为27％，在0.9％的氯化钠水溶液中无溶解，在湿态下穿针无脆裂。

10.一种制备复合型生物套管的方法，包括如下步骤：

从中空喷丝孔中挤出该纺丝原液，获得中空的生物导管；

通过复乳法制备包含神经生长因子的缓释微球的液体；以及将包含上述缓释微球的液体注入到所述中空的生物导管的内腔，并且干燥，获得在所述中空的生物导管的内壁上具有微囊层的复合型生物套管。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述促进神经生长的物质是选自神经生长因子和脑源性神经生长因子中的至少一种。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物降解材料是选自甲壳胺、几丁质、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸中的至少一种。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物可降解材料是甲壳胺，且所述溶剂是醋酸的水溶液。

14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，制备的复合型生物套管的内径为0.5mm 10mm，长度为3mm～20cm，以及管壁厚度为0.1～2mm。

15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述干燥在4～10℃条件下，真空冷冻干燥机上冷冻干燥。

16.权利要求1-9中任一项所述的复合型生物套管用于周围神经小间隙套接缝合且在损伤局部为受损神经提供长期促神经生长物质中的应用。