CN105705172B - 用于组织再生的亲水性静电纺生物复合支架材料及其制法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种用于组织再生的亲水性静电纺生物复合支架材料及其制法与应用,所述的生物复合材料是由纤维蛋白原、L‑精氨酸或其盐酸盐的水溶液与P(LLA‑CL)溶液共混,采用静电纺技术制备而得到的。该生物复合支架材料的平衡接触角达55℃以下,具有亲水性,在修复机体组织缺损中具有良好应用前景。
Description
技术领域
本发明是关于一种用于组织再生的亲水性静电纺生物复合支架材料及其制法与应用,具体地说,是关于一种以纤维蛋白原、L-精氨酸(盐酸盐)和聚乳酸-聚己内酯(P(LLA~CL))为原料,采用静电纺技术制备的具有亲水性的生物复合支架材料,及其制备方法与其在修复机体组织缺损中的应用,属于医用健康领域。
背景技术
组织工程学是利用工程学和生命科学的原理和方法研究生物有机体的组织器官或其功能替代物的新兴交叉学科。其基本原理和方法是在体外或体内使细胞吸附于生物相容性良好、并可被机体逐步吸收的合成聚合物和/或天然聚合物(如,细胞外基质)制成的支架上,形成细胞-生物材料复合物,该复合物在体内特定的解剖位置发挥相应的功能,支架降解吸收,同时,宿主自身细胞增生繁殖,分泌新的细胞外基质,最终形成新的与原解剖位置功能和形态相适应的组织、器官,从而达到修复组织外形和功能重建的目的。特定的组织细胞、支架和细胞外基质为组织工程的三要素。支架起中心作用,其不仅为特定的组织细胞提供结构支撑,而且还起到模板作用,引导组织再生和控制组织结构。
动物(包括人类)组织的细胞外间质是纳米级的纤维状蛋白、多糖和蛋白多糖的复合体,可由纳米纤维结构来仿制。随着纳米时代的到来,关于纳米纤维的报道快速增加。纳米纤维的制备方法可分为化学法、物理法和电力法。化学法是根据分子自组装的原理,使具有一定结构的小分子,组装成纤维状大分子而得到。物理法是利用L-聚乳酸特有的溶液凝胶性能,在达到液-液相平衡,冷冻干燥除去溶剂后制得。用化学法难以得到大批量产品,物理法还只限于制备L-聚乳酸纳米纤维。电力法是在高压静电场下使高分子溶液带电,并在向低电场喷射过程中成丝,该方法是利用了静电纺技术。理论上如果聚合物有合适的溶液体系,都能用静电纺技术制成纳米纤维,且可批量生产。
1934年,Formhals(美国第1975504号专利)首次报道了静电纺技术的专利。但是,静电纺丝用于组织修复的研究仅仅是近十余年的事情,因此,人们对静电纺丝的设计、制备,对在体内外分子-细胞水平与细胞之间相互作用的了解还比较肤浅。鲜有静电纺丝成功应用于临床的报道。
用于静电纺丝制备的合成聚合物可以是可降解的脂肪族聚酯,比如聚乳酸(PLA),聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)及它们的共聚或共混物。这些传统的材料在静电纺条件下可以方便地制备直径在几十至几百纳米的聚合物超细纤维,与天然细胞外基质的主要成分胶原蛋白十分类似,具有如下独到的优势:(1)可以最大程度仿生体内的ECM结构;(2)具有较高的孔隙率和极大的比表面积,有利于细胞的粘附、分化、增殖和分泌ECMs等;(3)通过调节溶液浓度、电纺参数等可以很好控制静电纺丝的厚度、三维结构和力学性能,以便于细胞长入、养分吸收和代谢产物排出。(4)可以用单一或二种以上的聚合物简捷地制备静电纺丝。
相关研究发现,单纯的合成聚合物静电纺丝存在下列缺陷:(1)与天然聚合物不同,缺乏细胞识别的位点,因而细胞难以粘附;(2)天生具有疏水特性,因此,静电纺丝的亲水性很差,如,聚己内酯(PCL)的水接触角为109~120°,聚乳酸-聚己内酯(PLLA-CL)的为109~133°,严重影响细胞的粘附和后续的细胞活动;(3)PLA和PGA的降解产物是相对较强的酸(乳酸或乙醇酸),一旦这些降解产物在植入周边积累下来,在几个月或几年后就会发现有一个滞后的炎症反应出现。因此,尽管合成聚合物静电纺丝的多孔性比传统方法(如空气发泡法、冷冻干燥法等)高1~2个数量级,有很高的比表面积,但是低下的亲水性导致大多数孔隙空虚,三维结构不能有效地利用。
为解决上述问题,迫切需要开发新的具有生物活性和功能的静电纺丝。所谓生物活性指生物活性物质通过物理的方式(如混合)或者化学的方式(比如共价固定)结合而形成的材料,该材料的结构或功能在体外或(和)体内能够对活细胞起到积极的效应,促进细胞-支架间的相互作用,比如增殖、迁移、维护正常细胞的形态和功能等。这就涉及到所用材料内在的生物化学特性。最为理想的是天然聚合物,比如蛋白质(胶原,丝素蛋白、明胶、弹力蛋白)、多糖(几丁糖、透明质酸)等。近年来,血液来源的纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)越来越引起人们的重视。但是,天然聚合物经过静电纺处理后,最大的问题在于:1)机械强度低下,植入体内后降解速度过快,因此,往往需要进行后处理。比如,戊二醛蒸汽或紫外线照射交联,最终使制品在水中或体内膨润但不降解;甲醛处理使纤维无规卷曲向β折叠转变,提高结晶程度,缩小孔隙率使其成为更为致密的结构;或者对多糖类天然生物聚合物(如几丁糖、纤维素等)通过碱处理以提高机械强度和延长降解时间。2)经过上述后处理,天然聚合物的机械强度明显提高,但是,所带来的最大问题是降解速度减慢甚至不能降解。作为支架材料,其主要功能是作为临时性的过渡,以辅助自身与创伤愈合有关的蛋白质吸附和细胞粘附,通过细胞长入,分泌自身的细胞外基质,达到组织重塑的目的。因此,降解速度的减慢或者丧失,将严重影响随后的组织再生过程。
复合静电纺丝的产生,为克服上述单纯合成聚合物和天然聚合物静电纺丝的缺点,并保留各自的优点带来了新的思路。该类静电纺丝简便且经济地改变支架材料的表面性质。在理论上具有如下优点:物理方面,提高新的复合支架材料的亲水性,并改善机械强度;生物方面,生物分子结合到合成聚合物中后,可以促进细胞与材料表面的识别,还可以促进或控制众多细胞生理活动,比如粘附,扩展、激活、迁移、增殖和分化等。
研究结果表明,尽管与单纯合成或天然聚合物制备的静电纺丝相比较,合成-天然聚合物的物理学和生物学性质有所改进,但是与临床应用要求距离甚远。原因之一是合成聚合物如聚乳酸-聚己内酯(P(LLA-CL))、PLC或PCL与天然生物聚合物(如胶原蛋白、弹力蛋白、壳聚糖等)制成的静电纺丝与水溶液接触后,往往会导致复合支架材料皱缩,皱缩比例可达原面积的20~50%不等。该表征的改变,直接影响到静电纺丝的孔隙率、降解速度以及湿润性等。至今为止,尚未见有关该类生物复合支架材料临床应用的成功报道。
CN101780292A公开了一种以Fg为基础的三维多孔纳米支架及其制备方法,所述的三维多孔纳米支架是由Fg以及聚乳酸/聚己内酯共聚物制成,所述Fg、聚乳酸/聚己内酯的质量比为1:5~12:5。
Fg是相对分子量为34万的生物大分子,由3对α、β、γ肽链组成,通过3个二硫键将其亚基连接为一个整体。Fg从血浆中提取,因而具有良好的组织相容性。同时,在机体内通过纤溶酶作用降解,降解产物不再参与血液凝固,并最终会被机体组织所清除;其生物学功能主要为:1)止血作用。在生理条件下,Fg转变为纤维蛋白,形成血凝块,达到止血作用。2)作为细胞的支架载体:纤维蛋白基支架材料可传递细胞至不同缺陷或缺损部位。例如人平滑肌细胞在血凝块表面和内部均可增殖良好;同样,纤维蛋白胶可使正常人源性角质细胞和成纤维细胞均获得很好的增殖结果。3)纤维蛋白以活性方式作为细胞因子与肽的传递载体。一些生长因子,如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)能与纤维蛋白结合,而且结合性很强,同时会从血凝块缓慢扩散;胰岛素样生长因子1、转化生长因子β能够在聚合过程中直接包埋在纤维蛋白支架中,保护这些生长因子在体内外免于变性和被蛋白酶降解。在纤维蛋白的Aα572~575位和95~98位上分别含有RGDS和RGDF活性肽,细胞通过整合素介导而与之作用并引发信号转导细胞;另外,纤维蛋白还能与抗生素、止痛药等连接,在使用纤维蛋白来止血与组织封闭时,可以在1~2周内对局部感染与疼痛进行控制,这正是纤维蛋白凝块的降解周期,在这段时间内,纤维蛋白可以以活性及有效的方式保留许多生物活性物质,将其局部定位,促进组织修复。
进一步的研究表明,当P(LLA-CL)与Fg的比分别为10:0、8:2和0:10时,制成的静电纺丝,接触角分别为110°、95°和65°。何创龙(参见:何创龙,Chuanglong He,《Fg/聚乳酸-聚己内酯杂合纳米纤维支架的制备及在软组织工程的潜在应用》。“Fabrication offibrinogen/P(LLA-CL)hybridnanofibrous scaffold for potential soft tissueengineering applications”,《生物医用材料研究杂志A》(Journal of biomedicalmaterials research A)97A(3):339-347(2011))也得到类似的研究结果。现代生物材料科学认为,当材料的水接触角大于65°,该材料的表面湿润性即为疏水性。
大量的研究证明,无论是支架材料的降解还是宿主组织的再生,固体材料表面湿润性,是调节两个过程平衡的重要因素。在材料表面化学中,一个很常见的现象是水会湿润某些表面,在另一些表面不形成湿润而出现液滴,并且具有有限的“接触角”。这种固体表面湿润现象,已经吸引材料科学家进行几乎三个世纪的研究。固体材料表面湿润性通常采用水接触角进行衡量。液滴与聚合物接触时间对接触角的测定值影响很大,在液滴与聚合物表面刚接触形成的接触角为起始接触角,10~20分钟内该接触角会迅速降低,到接触角不再随时间变化达到定值时称为平衡接触角。当固体表面与水的平衡接触角大于65°,称为疏水性表面,大于150°时,称为超疏水表面;而固体表面与水的平衡接触角小于55°时为亲水表面,小于5°,则称为超亲水表面。可以认为,P(LLA-CL)与一定比例的Fg共混后,所得到的静电纺丝表面的细胞识别位点得到大幅度提高,但是,水接触角从单纯P(LLA-CL)的110°降低到65°,仍然属于疏水性材料。正如前述,材料的疏水性将阻碍体内外的降解,蛋白的吸附和细胞的粘附,影响细胞特别是毛细血管的长入,氧气、营养物质、抗体和免疫细胞以及有关的抗菌物质得不到有效补给,酸性代谢产物不能及时顺利排除,微生物(如皮肤或者血源的细菌)在局部集聚又得不到有效抑制和清除,感染的发生率可以高达20~30%。而组织再生速度的减慢或丧失,以及局部感染的发生,是导致组织缺损疾病修复后复发(如疝气修复后复发、盆底脏器脱垂修复后复发,等)的主要原因。因此,如何有效地提高静电纺丝的亲水性,是亟待解决的关键问题。
综上所述,尽管早在1934年,就公开了静电纺技术的原理专利;近十几年由于组织工程在的蓬勃兴起,静电纺丝生物复合支架材料也越来越受到重视,从理论的角度看,其网状结构与机体结缔组织十分类似,应具有十分诱人的应用前景。但是,直到今天,尚无静电纺丝生物复合支架材料成功应用于临床的报道。究其原因,与人们对该类结构材料的认识肤浅有极大关系。需要面对的难题主要是:1)如何提高合成聚合物的蛋白和细胞识别位点;2)如何改进材料的表面特性,特别是湿润性;3)如何有效地降低静电纺丝生物复合支架材料与水溶液接触后,常见的皱缩现象;4)如何有效地预防高达20~30%的细菌感染,和居高不下的复发率。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种在体外或体内能够有效促进创伤愈合蛋白质吸附、再生修复细胞粘附的静电纺丝复合支架材料;该类材料能够有效地预防细菌生物膜的形成,以保证在体内特定的解剖位置发挥相应的功能;具有合适降解速度和再生能力,在生物支架降解吸收的同时,宿主自身细胞增生繁殖,分泌新的细胞外基质,最终形成新的与原解剖位置功能和形态相适应的组织、器官,从而达到修复组织外形和功能重建的目的。
本发明的另一目的在于提供所述的静电纺丝复合支架材料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述的静电纺丝复合支架材料的应用,特别是其在用作或用于制备修复机体组织缺损的材料中的应用。
为保证实现上述目的,所提供的支架材料必须具有良好的亲水性。因而,材料表面的水接触角应该小于55°,最好在5°以下。并且,支架材料在体内降解过程中必须具有足够的机械强度,以防止组织缺损部位相应组织器官的脱垂、脱出、扩张和断裂。此外,该支架材料与水溶液或者组织液接触后,不会产生皱缩,总体积皱缩率不能高于20%。
一方面,本发明提供了一种亲水性静电纺生物复合支架材料,其是由纤维蛋白原(Fg)、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液与P(LLA-CL)溶液共混,采用静电纺技术制备而得到的。
发明人惊喜地发现,根据P(LLA-CL)与Fg、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液的质量比例不同,共混后制成的静电纺丝,平衡接触角可以从单纯P(LLA-CL)的110°和P(LLA-CL)/Fg的65°以上,降低到55°以下,具有明显亲水性,还可以进一步降低到5°以下,具有超亲水性。
本发明所提供的由Fg、L-精氨酸的水溶液与P(LLA-CL)溶液共混,采用静电纺技术制备而得到的亲水性静电纺生物复合支架材料,其与水溶液接触后,总体积皱缩率不大于20%;孔隙率不低于30%。
根据本发明的具体实施方案,本发明的亲水性静电纺生物复合支架材料中,所述Fg是来源于哺乳动物的Fg。所述哺乳动物包括但不限于人、猪、牛、羊或马等。
根据本发明的具体实施方案,本发明的亲水性静电纺生物复合支架材料中,所述Fg、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液中,Fg与L-精氨酸或其盐酸盐的质量比为1.2:1~12.5:1。
根据本发明的具体实施方案,本发明的静电纺亲水性生物复合支架材料中,所述P(LLA-CL)中聚乳酸和聚己内酯的质量比为20:80~95:5。本发明中对P(LLA-CL)的其他性能无特定要求,符合相关行业标准要求即可。
根据本发明的具体实施方案,本发明的亲水性静电纺生物复合支架材料中,所述Fg、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液,其中的溶剂可以选自纯水、注射用水、各种盐溶液(包括但不限于:氯化钠溶液、氯化钾溶液,等)、各种缓冲液(包括但不限于:磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液,D-Hank’s液,等)、各种细胞培养基(包括但不限于:DMEM培养基,1640培养基,MEM培养基,等)等中的一种或多种。即,本发明的Fg、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液可以是Fg、L-精氨酸或其盐酸盐溶于纯水、注射用水、各种盐溶液、各种缓冲液、各种细胞培养基等溶剂中而得到的水溶液。
根据本发明的具体实施方案,本发明的亲水性静电纺生物复合支架材料中,所述的P(LLA-CL)溶液中的溶剂可以为各种有机溶剂,例如可以是选自六氟异丙醇、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、氯仿或丙酮等中的一种或者多种。
根据本发明的具体实施方案,本发明的亲水性静电纺生物复合支架材料中,Fg、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液与P(LLA-CL)溶液共混后,其中Fg:P(LLA-CL)的质量比为0.2:1~2.1:1。
根据本发明的具体实施方案,本发明的亲水性静电纺生物复合支架材料中,所述的Fg、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液中,还可进一步加载有各种抗菌物质,所述抗菌物质包括但不限于青霉素类(青霉素、氨苄西林、羧苄西林等)、头孢菌素类(头孢氨苄、头孢呋辛钠,头孢曲松,头孢匹罗,等)、碳青酶烯类(如硫霉素等)、氨基糖甙类(庆大霉素、链霉素、卡那霉素,等)、四环素类(如四环素、金霉素,等)、大环内脂类(如红霉素、阿奇霉素,等)、糖甙类(如万古霉素,等)、磺胺类(如磺胺嘧啶,甲氧苄啶,等)、喹诺酮类(如吡哌酸,环丙沙星,等)、硝咪唑类(如甲硝唑,替硝唑等)、林克胺类(如林可霉素,克林霉素,等),以及磷霉素、氯霉素、对粘菌素B、杆菌肽中的一种或多种。更具体地,这些抗菌物质的添加量,最好在该支架材料植入体内后15分钟内,所述抗菌物质的释放量不低于总加载量的30%。
根据本发明的具体实施方案,本发明的亲水性静电纺生物复合支架材料的形状可以根据需要而定,例如可以为膜状,优选其厚度为10~1500微米,更优选50~500微米。也可以为管状,优选管壁厚度为1~1500微米,更优选50~500微米,内直径2~200毫米。也可以为柱状,优选其直径2~20毫米。
另一方面,本发明还提供了所述的亲水性静电纺生物复合支架材料的制备方法,该方法包括:
将Fg、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液与P(LLA-CL)溶液共混,所得溶液采用静电纺技术进行静电纺制备得到生物复合支架材料。
根据本发明的具体实施方案,本发明的制备方法中,所述的静电纺技术可以参照所属领域的现有技术进行。本发明中优选控制静电纺丝机参数设置为:电纺距离10~30cm、静电纺丝电压15~70kV、溶液流速2~400ml/h。
根据本发明的具体实施方案,本发明的制备方法中,还可进一步包括采用15~35KGy电离辐射对所制得的生物复合支架材料进行灭菌的过程。
更具体操作时,可以是将Fg、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液与P(LLA-CL)溶液的共混溶液加载到静电纺机内,以直径1~20mm的杆状(制备管状材料)或可移动平面(制备膜状材料)作为收集装置。静电纺丝机参数设置为:电纺距离10~30cm、静电纺丝电压15~70kV、溶液流速2~400ml/h。电纺结束后,自收集装置上将静电纺复合材料完整取下,按照不同产品的规格要求,进行裁剪、定型、包装、灭菌(除菌)等后处理后,置2~8℃保存。
另一方面,本发明还提供了所述的亲水性静电纺生物复合支架材料的应用,具体是其在用作或用于制备修复机体组织缺损的材料中的应用。
本发明的生物复合支架材料具有亲水性或超亲水性,这种亲水的静电纺丝植入体内后,具有如下优势:
(1)生物复合支架材料的表面湿润性得以极大改善,从疏水性改变为(超)亲水性;有效地克服了生物复合支架材料与水溶液接触后常见的皱缩现象,该现象对生物复合支架材料的孔隙率、亲水性和降解再生速度均会产生很大的影响。
(2)传统的单纯天然聚合物作为再生材料临床失败的重要原因之一是细菌感染率20~30%,导致植入部位严重的炎症反应,创伤修复细胞长入迟缓,局部氧气和营养物质供应缺乏,代谢产物排出障碍,组织重塑过程受到极大影响,从而使得局部缺损组织修复不良而复发。采用本发明制备的静电纺丝生物复合支架材料的细菌感染率低于1%。其主要原因是:①细菌一般为疏水表面,因此难以粘附于亲水的材料表面;②进一步,由于本发明的复合支架材料的(超)亲水性,加载的抗菌物质在15分钟内,释放30%以上;在植入局部形成高浓度的抗菌屏障;③由于具有合适的降解和再生速率,有利于诸如毛细血管的长入、免疫细胞和抗体的局部聚集及代谢产物的及时清除,有利于局部有效地清除病原微生物,降低感染率。
(3)由于采用Fg作为电纺原料之一,网状结构克服了单纯合成聚合物缺乏细胞识别位点的缺点;Fg是创伤起始蛋白,具有吸引结合创伤修复因子(如血小板来源的生长因子PDGF、血管内皮细胞生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF),募集创伤修复细胞(如成纤维细胞、血管内皮细胞),对合成聚合物的降解、毛细血管的长入、局部组织的重塑均具有积极的作用。
根据本发明的具体实施方案,本发明所述的生物复合支架材料可根据其具体应用情况具有不同的形状尺寸。例如,当所述的生物复合支架材料为膜状时,通常可用于制备治疗脑膜、腹部缺损(如腹股沟疝、脐疝、切口疝等)、盆底器官脱垂、心房、室间隔、心包膜缺损、肌腱或韧带等断裂、或实质性器官(如肝脏、脾脏、肾脏、胰脏等)器官破裂的修复材料。当所述的生物复合支架材料为管状时,通常可用于制备管状器官缺损的修补材料;所述的管状器官包括神经导管、食道、气管、胃、肠道、胆道、输尿管、膀胱、阴道、动静脉等中的一种或多种。当所述的生物复合支架材料为柱状时,通常可用于制备韧带、跟腱或软骨等的断裂或缺损时的修补材料。
在本发明的具体实施方案中,本发明采用(超)亲水性的上述静电纺丝,成功地制备出软组织补片(如盆底补片、疝补片、脑膜补片、胸膜补片、创伤创面敷料、腹部补片、小口径动脉和跟腱),管状结构支架(如动脉支架、静脉外支撑,气管支架,食管支架,膀胱、输尿管和尿道支架,等)以及韧带、肌腱等,有关骨、软骨、心脏瓣膜的诱生支架材料正在研发过程中,并进行了相应的动物试验或人体试验,相关试验表明,本发明的生物复合支架材料植入个体体内后,能取得以下技术效果:1)植入体内后1~2周内,植入物周围可见嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞浸润;4周时,植入物周围有巨噬细胞和淋巴细胞;可见胶原纤维;16周,材料完全被新生组织替代,组织反应好。2)植入后1周内,植入物的机械强度持续降低;2周时,达到拐点,并随着时间的推移,机械强度逐渐增加。3)所有动物试验中,植入局部细菌感染率低于1%,在15例盆底修补的临床试验中,无一例补片感染病例发生;临床观察4个月,无一例盆底器官脱垂复发。4)加载的抗菌物质在15分钟内释放加载量的30%以上,因而在局部形成高浓度的抗菌屏障,有效地阻止了细菌膜的形成。
附图说明
图1为本发明的实施例1的静电纺生物复合支架材料的表面湿润性测试数据图表。
图2为本发明的实施例3中静电纺生物复合支架材料修补后2周(图片A)、2月(图片B)、4月(图片C)和6月(图片D)的观察结果。图中星号标记植入物部位,HE染色。标尺100μm。
图3为本发明的实施例4中重塑前后的犬颈总动脉和相应的组织切片观察结果。其中,图片A:术后2周;图片B:术后12周;图片C:正常动脉。上图:actin;中图:胶原蛋白;下图:糖蛋白。图中星号标示血管腔面。
图4为本发明实施例6中术后52周韧带移植物植入处行组织学检查结果,显示与正常韧带组织无明显区别。
图5为本发明实施例7中术后半年显微镜下新生食管观察结果。显示新生的食管壁厚度与原位的相同;显微镜下新生食管标本腔面有完整的复层鳞状上皮,其下为疏松结缔组织构成的粘膜下层和骨骼肌和平滑肌混合组成的肌层,外膜为含有较大的血管、淋巴管和神经疏松结缔组织。
图6为本发明实施例8中术后6个月膀胱组织观察结果。显示新生膀胱的结构和容量与正常完全相同,并具有正常的收缩功能,修补区有完整的膀胱粘膜层、肌层和外膜。
图7为本发明实施例9中术后6个月脑膜组织学观察结果。显微镜下可见不规则的致密结缔组织,方向不一的粗大的胶原纤维彼此交织成致密的板层结构,纤维之间含少量基质和成纤维细胞。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解,现结合实施例及附图进一步详细说明本发明,但本发明并不因此而受到任何限制。在下列实施例中,除非另有指明,所述的份按重量计。
所有实施例中,各原始材料均可商购获得,除特别注明外,所用Fg为猪血源;P(LLA-CL)中聚乳酸和聚己内酯的质量比为70:30。
实施例1
将本实施例样品分为三组:
1)单纯P(LLA-CL)组:用100ml六氟异丙醇溶解P(LLA-CL)6g;
2)P(LLA-CL)+Fg组:用20ml的生理盐水溶解Fg,为溶液1;用80ml六氟异丙醇溶解P(LLA-CL)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混。使得100ml共混溶液中Fg 4g、P(LLA-CL)6g;
3)P(LLA-CL)+Fg+保护剂组:用20ml的生理盐水溶解Fg、L-精氨酸盐酸盐,为溶液1;用80ml六氟异丙醇溶解P(LLA-CL),为溶液2;将溶液1与溶液2共混。使得100ml共混溶液中Fg 4g、L-精氨酸盐酸盐1g、P(LLA-CL)6g;采用静电纺制备生物复合支架材料。静电纺机参数设置为:电纺距离15cm,静电丝电压15KV,溶液流速2ml/h,注射器横移速度10cm/min。静电纺膜厚度约为200微米。
测定上述三组样品的起始接触角和平衡接触角,利用躺滴法在OCA20视频光学接触角测量仪测定各静电纺膜水的接触角随时间变化,采用动态连续跟踪测量模式,以1次/s的速度采集样品的接触角数据。测定结果见图1。如图1所示,单纯P(LLA-CL)组电纺膜的起始和平衡接触角均为118±1.2°;P(LLA-CL)+Fg组的起始接触接触角为102±0.8°,平衡接触角为82±1.2°,平衡时间在10分钟内;P(LLA-CL)+Fg+L-精氨酸盐酸盐组起始接触角为73±0.2°,平衡接触角﹤5°,平衡时间在2分钟内。
另,经检测,上述P(LLA-CL)+Fg+保护剂组样品与水溶液接触后,总体积皱缩率10%~15%;孔隙率大于40%。
实施例2
用20ml的生理盐水溶解不同重量的牛血源Fg和L-精氨酸盐酸盐1g,为溶液1,溶液中Fg/L-精氨酸盐酸盐比值如表1所示;用80ml六氟异丙醇溶解P(LLA-CL)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混;共分13个组。分别采用日本KATO TECH公司的静电纺机制备静电纺膜。静电纺机参数设置为:电纺距离15cm,静电丝电压15KV,溶液流速2ml/h,注射器横移速度10cm/min。静电纺膜厚度约为200微米。
采用德国OCA20视频光学接触角测量仪测定各组静电纺膜的平衡接触角。结果见表1。
表1:100ml静电纺液体中溶质含量与静电纺膜平衡接触角的量效关系
从表1中可以看出,随着静电纺液中L-精氨酸盐酸/纤原比值的逐渐增高,静电纺膜的平衡接触角改变分三个阶段,从0.07提高到0.13,由55±1.2°逐步减低到5°以下;从0.2到0.5,保持在5°以下;而从0.55到1.66,接触角又逐渐增高,最终超过55±0.7°,变为疏水性。
实施例3
用20ml的生理盐水溶解Fg 4g、L-精氨酸盐酸盐1g,为溶液1;用80ml六氟异丙醇溶解P(LLA-CL)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混。使得100ml共混溶液中Fg 4g、L-精氨酸盐酸盐1g、P(LLA-CL)6g;采用静电纺制备生物复合支架材料。静电纺机参数设置为:电纺距离15cm,静电丝电压15KV,溶液流速2ml/h,注射器横移速度10cm/min。静电纺膜厚度为200~400微米。
所制备得到的静电纺膜作为生物复合支架材料,其厚度在200~400微米,水接触角﹤5°,机械强度15~20MPa。所得到的材料经过电子束25KGy灭菌后,用作猪腹部缺损补片。
取迷你猪(体重20~30公斤)30只,以腹部中线为界,于腹部两侧分别作6cm x 8cm的腹部缺损,切除真皮以下的全部肌肉和腱膜,保留腹膜。一侧缺损用前述的静电纺生物复合支架材料修补;分别于术后1周、2周、1月、2月、4月和6月,麻醉动物后,对缺损修补部位进行大体、组织学观察,每个时间点5只动物。观察发现,术后1周,局部为急性炎症反应,植入物周围可见嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞浸润;第2周,仍然为急性炎性反应,植入物降解明显,机械强度降到最低点,1~4个月,以组织增生为主,植入物植入部位组织机械强度逐渐增强,植入物在4个月完全消失;6个月,局部为新生的肌肉组织和筋膜组织所代替;机械强度恢复到正常时的90%以上。相关结果可参见图2。
实施例4
用20ml的生理盐水溶解Fg 2g、L-精氨酸盐酸盐0.4g,为溶液1;用80ml六氟异丙醇溶解P(LLA-CL)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混。使得100ml共混溶液中Fg 2g、L-精氨酸盐酸盐0.4g、P(LLA-CL)6g;将共混液加载于注射器中,末端连接钝口18G针头,以直径5mm的不锈钢金属杆作为收集装置。将注射器放置在固定架上固定后,进行静电纺。静电纺参数设置为:电纺距离15cm、静电纺丝电压15kV、溶液流速2ml/h、接受装置转动速率500/min、注射器横移速度10cm/min。电纺结束后,自金属杆上完整取下电纺管状支架,修剪两端后置于干燥器内干燥备用。所得到的材料经过电子束25KGy灭菌后,用作置换犬颈外动脉。
取30~35公斤重杂种犬30只。分别取其前肢浅表静脉3~5厘米长,获取静脉内皮细胞进行体外扩增。将犬自身内皮细胞高密度种植于上述管状动脉生物复合支架材料内表面,为实验组;相同管状动脉生物复合支架材料,不接种内皮细胞的为对照组。使用实验组和对照组管状支架材料分别置换两侧颈总动脉。分别于术后1周、3周、1月、2月、4月和6月,麻醉动物后,获取置换部位动脉样品进行大体和组织学观察,每一个时间点5只动物。结果显示:对照组30条动脉替代物中,通畅率为:1周4/5、3周2/5,1月内以后全部阻塞;实验组30条,除1周内4/5、3周4/5、1月5/5、2月5/5、4月5/5、6月5/5。其中,实验组通畅的血管植入物内膜全部保持完整,平滑肌细胞于2周内出现,4个月内形成与正常动脉壁类似的中膜结构和外膜结构,相关结果参见图3。
实施例5
用20ml的D-Hank’s液溶解Fg 2.5g、L-精氨酸盐酸盐1g,为溶液1;用80ml的六氟异丙醇溶解P(LLA-CL)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混。使得100ml共混溶液中Fg 2.5g、L-精氨酸盐酸盐1g、P(LLA-CL)6g,所得溶液进行静电纺,静电纺机参数设置为:电纺距离15cm,静电丝电压70KV,湿度﹤20%。静电纺膜厚度为250~300微米,水接触角﹤5°,拉伸强度10~20MPa。
所得到的材料经过电子束25KGy灭菌后,用作盆底补片。
选定临床盆底器官脱垂患者30名,年龄45~80岁,POP-Q分级及MRI分级为阴道前壁II-VI级。随机将患者分入实验组和对照组,各为15例;实验组采用生物复合支架材料,对照组采用聚丙烯修补材料。经过阴道入路,将植入物分别植入阴道前壁。术后1周,1月,3月和6月随访。随访结果表明,术后1月、3月和6月,30例实验组和对照组患者POP-Q评级均为0-I级;经介入超声印压系统对阴道前壁软硬度进行定量测定,术后3个月和术后6个月,实验组阴道前壁的硬度参量值为120±8.2KPa和60±5.8(KPa),对照组为250±16KPa和360±30.4KPa。
实施例6
用20ml注射用水液溶解Fg 2.5g、L-精氨酸0.5g为溶液1;用80ml的六氟异丙醇溶解P(LLA-CL)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混。使得100ml共混溶液中Fg 2.5g、L-精氨酸盐酸盐0.5g、P(LLA-CL)6g,所得溶液进行静电纺,静电纺机参数设置为:电纺距离15cm,静电丝电压70KV,湿度﹤20%,溶液流速2ml/h,注射器横移速度10cm/min。静电纺膜厚度为250~300微米,水接触角﹤5°,拉伸强度10~20MPa。将所得到的膜状材料裁剪长方形或正方形,经蜷曲3~4层后,形成直径为3~5mm圆柱体,长度3~10cm,所得到的材料经过电子束25KGy灭菌后,用作犬跟腱和前十字交叉韧带的置换。
取比格犬6只,体重20~30公斤,全麻,将一侧后肢跟腱切断,直径3mm的圆柱体支架材料与跟腱两端段行端端吻合;观察发现,术后2周内,犬手术肢体不能着地,单后腿行走,术后3~4周,手术肢体开始着地,跛行;术后2月,6只实验犬均行走自如,术后6月,手术侧跟腱直径与对侧无区别。
6只成年比格犬,体重15~20公斤,进行单侧后肢前十字交叉韧带(ACL)置换术。全麻。屈膝位。于手术侧ACL的双侧止点切断韧带。在ACL两端止点处的股骨和胫骨上钻直径4.5mm的骨隧道。将直径为4mm的上述圆柱体生物复合支架材料徒手施加压力后植入关节内,关节内生物复合支架材料长约10mm。所有螺钉均位于骨块的髌前侧,使骨块的皮质骨面紧贴骨隧道壁。术后不限制活动。所有动物术后8周时步态无明显异常;术后52周,将动物处死后,进行大体和组织学观察。发现重建物的强度、刚度、应力与对照侧ACL的比值有逐渐增加的趋势,分别为对照侧的46%、70%和85%。组织学检查发现实验侧与对照侧的组织学表现无显著性差异。相关结果参见图4。
实施例7
用20ml的D-Hank’s液溶解Fg 1.2g、L-精氨酸1g,为溶液1;用80ml的三氯甲烷溶解P(LLA-CL。聚乳酸和聚己内酯的质量比为95:5)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混。使得100ml共混溶液中Fg 1.2g、L-精氨酸1g、P(LLA-CL)6g,所得溶液进行静电纺,将共混液加载于注射器中,末端连接钝口18G针头,以直径20mm的不锈钢金属杆作为收集装置。将注射器放置在固定架上固定,进行静电纺丝。静电纺丝机参数设置为:电纺距离15cm、静电纺丝电压15kV、溶液流速2ml/h、接受装置转动速率500/min、注射器横移速度10cm/min。电纺结束后,自金属杆上完整取下电纺管状支架,修剪两端后置于干燥器内干燥备用。壁厚为200~300微米,内径为20mm长6~8cm的管状生物复合支架材料,水接触角:30~40°,机械强度10~15MPa,所得到的材料经过电子束25KGy灭菌后,用作比格犬食管的置换。
比格犬6只,体重15~25公斤,全麻,经右后外侧切口第四肋间入胸,游离并切除胸段食管约8cm长,将6cm长管状支架材料原位植入,端端吻合以重建食管。胸膜包裹支架材料,逐层关胸。术后引流、抗感染;术后2周进普食;术后半年活杀进行大体和病理观察:胃镜下可见食管粘膜完整光滑,色泽与原位的相同,管腔通畅;大体标本可见为均匀一致的白色肌性管道,质地柔软。新生的食管壁厚度与原位的相同;显微镜下新生食管标本腔面有完整的复层鳞状上皮,其下为疏松结缔组织构成的粘膜下层和骨骼肌和平滑肌混合组成的肌层,外膜为含有较大的血管、淋巴管和神经疏松结缔组织,相关结果参见图5。
实施例8
用20ml的D-Hank’s液溶解Fg 8g、L-精氨酸盐酸盐1g,为溶液1;用80ml的六氟异丙醇溶解P(LLA-CL。聚乳酸和聚己内酯的质量比为20:80。)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混。使得100ml共混溶液中Fg 8g、L-精氨酸盐酸盐1g、P(LLA-CL)6g。所得溶液进行静电纺,静电纺机参数设置为:电纺距离15cm,静电丝电压70KV,湿度﹤20%,制成壁厚为200~300微米的膜状生物复合支架材料,水接触角30~40°,机械强度10~15MPa,经过电子束25KGy灭菌后,用作新西兰大白兔膀胱缺损的修补。
新西兰大白兔3只,体重1.5~2.5公斤,全麻,经腹腔入路,将膀胱前壁切除约40%,用上述静电纺生物复合支架材料修补,术后6个月新生膀胱的结构和容量与正常完全相同,并具有正常的收缩功能,修补区有完整的膀胱粘膜层、肌层和外膜。相关结果参见图6。
实施例9
用20ml的D-Hank’s液溶解Fg1.6g、L-精氨酸盐酸盐0.5g为溶液1;用80ml的六氟异丙醇溶解P(LLA-CL)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混。使得100ml共混溶液中Fg1.6g、L-精氨酸盐酸盐0.5g、P(LLA-CL)6g,所得溶液进行静电纺,制成壁厚为300~400微米膜状生物复合支架材料,平衡接触角20°,机械强度15~20MPa,所得到的材料经过电子束25KGy灭菌后,用作新西兰大白兔脑膜缺损的修补。
取体重2~3公斤的新西兰大白兔5只,全麻后,无菌条件下暴露颅骨。冠状缝的后中线两侧,用高速电钻各制备直径1.2cm的骨窗1个。暴露硬脑膜。右侧为实验组,剪除0.8X0.8cm的自体硬脑膜,取前述生物复合支架材料,在手术显微镜下用丝线缝合修补。左侧硬脑膜不予处理,作为正常对照。术后常规抗感染。术后6个月将动物麻醉后处死,进行手术部位大体和组织学观察。所有动物局部无红肿,无脑脊液瘘,切口愈合良好。大体观察,右侧手术部位内层光滑,外层较粗糙,其纤维走向以弓状、放射状、纵行和斜行纤维为主,可以看到血管网分布。显微镜下可见不规则的致密结缔组织,方向不一的粗大的胶原纤维彼此交织成致密的板层结构,纤维之间含少量基质和成纤维细胞,相关结果参见图7。
实施例10
用20ml的生理盐水溶解Fg 2.5g、L-精氨酸盐酸盐1g和庆大霉素53.4万单位,为溶液1;用80ml六氟异丙醇溶解P(LLA-CL)6g,为溶液2;将溶液1与溶液2共混。采用日本KATOTECH公司的静电纺机制备静电纺膜。静电纺机参数设置为:电纺距离15cm,静电丝电压15KV,溶液流速2ml/h,注射器横移速度10cm/min。所得静电纺膜中庆大霉素的含量为:6万U/g或者101.6U/cm2。按照2000版《中华人民共和国药典》附录XD释放度法操作,以测定庆大霉素的体外释放。分别取辐照前、后的静电纺膜各3片,精密裁取6g,以pH7.2的PBS为释放介质,置32℃水浴内,分别于0.25、0.5、1、12、24、48、96小时,各组取溶液5ml,按照衍生化反应操作进行。在波长356nm处测定吸光度。根据标准曲线方程,分别计算每片静电纺样品在不同时间的释放量,从而计算出个时间的累积释放百分率。结果见表2。
表2:庆大霉素体外释放测定结果
从表2可见,辐照前、后庆大霉素在15分钟内快速释放达高峰,而后缓慢释放,持续到第5天(120h)。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (26)
1.一种亲水性静电纺生物复合支架材料,其是由纤维蛋白原、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液与P(LLA-CL)溶液共混,采用静电纺技术制备而得到的;其中,所述纤维蛋白原与L-精氨酸或其盐酸盐的质量比为1.2:1~12.5:1;
所述纤维蛋白原、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液,其中的溶剂选自纯水、注射用水、盐溶液、缓冲液中的一种或多种;所述盐溶液选自氯化钠溶液、氯化钾溶液;所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、D-Hank’s液。
2.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其中,所述纤维蛋白原是来源于哺乳动物的纤维蛋白原。
3.根据权利要求2所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其中,所述哺乳动物为人、猪、牛、羊或马。
4.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其中,所述P(LLA-CL)中聚乳酸和聚己内酯的质量比为20:80~95:5。
5.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其中,所述的P(LLA-CL)溶液中的溶剂选自六氟异丙醇、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、氯仿或丙酮中的一种或者多种。
6.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其中,所述纤维蛋白原、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液与P(LLA-CL)溶液共混后,其中纤维蛋白原:P(LLA-CL)的质量比为0.2:1~2.1:1。
7.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其平衡接触角小于55°。
8.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其与水溶液接触后,总体积皱缩率不大于20%;孔隙率不低于30%。
9.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其中,所述的纤维蛋白原、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液中,还进一步加载有抗菌物质,所述抗菌物质选自青霉素类、头孢菌素类、碳青酶烯类、氨基糖甙类、四环素类、大环内脂类、糖甙类、磺胺类、喹诺酮类、硝咪唑类、林克胺类、磷霉素、氯霉素、对粘菌素B、杆菌肽中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其中,所述青霉素类选自青霉素、氨苄西林、羧苄西林;所述头孢菌素类选自头孢氨苄、头孢呋辛钠、头孢曲松、头孢匹罗;所述碳青酶烯类为硫霉素;所述氨基糖甙类选自庆大霉素、链霉素、卡那霉素;所述四环素类选自四环素、金霉素;所述大环内脂类选自红霉素、阿奇霉素;所述糖甙类为万古霉素;所述磺胺类选自磺胺嘧啶、甲氧苄啶;所述喹诺酮类选自吡哌酸、环丙沙星;所述硝咪唑类选自甲硝唑、替硝唑;所述林克胺类选自林可霉素、克林霉素。
11.根据权利要求9或10所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,其中,在该支架材料植入体内后15分钟内,所述抗菌物质的释放量不低于总加载量的30%。
12.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,该生物复合支架材料为膜状。
13.根据权利要求11所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,该生物复合支架材料的厚度为10~1500微米。
14.根据权利要求13所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,该生物复合支架材料的厚度为50~500微米。
15.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,该生物复合支架材料为管状。
16.根据权利要求15所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,该生物复合支架材料的厚度为1~1500微米。
17.根据权利要求16所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,该生物复合支架材料的厚度为50~500微米,内直径2~200毫米。
18.根据权利要求1所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,该生物复合支架材料为柱状。
19.根据权利要求18所述的亲水性静电纺生物复合支架材料,该生物复合支架材料的直径2~20毫米。
20.权利要求1~19任一项所述的亲水性静电纺生物复合支架材料的制备方法,该方法包括:
将纤维蛋白原、L-精氨酸或其盐酸盐的水溶液与P(LLA-CL)溶液共混,所得溶液采用静电纺技术进行静电纺制备得到生物复合支架材料。
21.根据权利要求20所述的方法,其中,静电纺技术中控制静电纺丝机参数设置为:电纺距离 10~30cm、静电纺丝电压 15~70kV、溶液流速 2~400ml/h。
22.根据权利要求20所述的方法,该方法还包括采用15~35KGy电离辐射对所制得的生物复合支架材料进行灭菌的过程。
23.权利要求1~19任一项所述的亲水性静电纺生物复合支架材料在用于制备修复机体组织缺损的材料中的应用。
24.根据权利要求23所述的应用,其中,所述生物复合支架材料为膜状时,其是用于制备治疗脑膜、腹部缺损、盆底器官脱垂、心房、室间隔、心包膜缺损、肌腱或韧带断裂、或实质性器官器官破裂的修复材料。
25.根据权利要求23所述的应用,其中,所述生物复合支架材料为管状时,其是用于制备管状器官缺损的修补材料;所述的管状器官包括神经导管、食道、气管、胃、肠道、胆道、输尿管、膀胱、阴道、动静脉中的一种或多种。
26.根据权利要求23所述的应用,其中,所述生物复合支架材料为柱状时,其是用于制备韧带、跟腱或软骨的断裂或缺损时的修补材料。
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