CN101757651A - 一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，该方法是将至少含一种生物材料及稳定剂的组成物质封装、冻干、粉碎成冻干粉，在-10～40℃下进行20～40KGy的钴⁶⁰伽马射线的辐照。与现有技术相比，本发明具有在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持生物材料的功能和结构等优点。

Description

一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法

技术领域

本发明涉及动物纤维蛋白原，尤其是涉及一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法。

背景技术

现有蛋白制品的病毒灭活/去除方法有其局限性，如S/D法(有机溶剂/表面活性剂法)只对包膜病毒有效，因而导致蛋白制品的应用仍有一定的风险。有研究报道静脉注射免疫球蛋白(IVIG)产品可能传播丙肝病毒，输注血浆蛋白制品可能传播人类细小病毒B19。因此寻找一种能灭活所有病毒，且对蛋白制品活性影响较小、操作方便的方法，将有助于提高蛋白制品应用的安全性，

1γ射线灭活病原体的机理

大量实验证实γ射线辐照对各种微生物均有杀灭作用，包括有包膜和无包膜病毒及所有的基因型物质。电离辐射对生物大分子的损伤既有能量传递的直接作用，也有通过水的辐解反应大量产生自由基的间接作用，这两者之间除时间上有先后之分外，在损伤的类型与机理等方面也存在一定差异。直接作用：离子射线的直接作用主要是光子存储能量到“靶结构”上，这些能量的转移主要导致分子的外部电子从分子上移位而破坏共价键。间接作用：间接作用主要是射线作用于水分子、氧分子或其它的分子，形成高活性的自由基和活性氧，自由基和活性氧使病原体核酸断裂。目前认为，传染因子的基因物质比蛋白生物制品更容易受到γ-射线的损伤，这主要是由于两者物理特征(大小和密度)和化学结构的不同。生物大分子对射线辐照的敏感性与其本身质量大小有关，实际上，几十年前人们就通过γ-射线灭活病毒所需的剂量来估计病毒基因组的大小，一般情况下灭活微生物所需的剂量与微生物的核酸大小成反比。

2γ射线辐照消毒和灭菌的优点

与传统的消毒灭菌方法相比较，γ射线辐照有其独特的优点：①不使物品升温，适用于忌热物品的消毒，除某些塑料、活细胞及其制剂外，许多医用物品都可用它进行消毒灭菌；②穿透力强。射线可穿透被照物品的各个部位，一般不受物品包装、形态的限制；③被照物品不会产生感生放射性，辐照后无残留毒性；④方法简便；⑤省能，尤其适于大规模工业化处理。

3γ射线辐照灭活蛋白制品中的病毒

一般情况下，20-50kGy剂量的γ射线辐照几乎能灭活所有的病毒，但灭活病毒的同时，辐照剂量越大，对蛋白制品成分的损伤也越大，如何在灭活病毒的同时又保留蛋白有效成分、不破坏蛋白成分的活性，这将是γ射线辐照应用于蛋白制品病毒灭活的关键。有文献报道自由基对蛋白质的损伤主要表现在一级结构上的肽键断裂、氨基酸组成变化和空间构象的β折叠的含量减少，紧密的结构趋于松散，无规则卷曲明显增加。但也有实验表明将白蛋白浓缩液经水溶液稀释后用γ射线辐照，下列条件可减少蛋白成分损伤：①白蛋白含量高；②加入辛酸钠；③低照射剂量率；④缺氧状态。加入抗氧化剂或自由基清除剂，或者利用一种手段使辐照过程中产生最小量的活性氧都可减少γ射线对蛋白成分的损伤。冻干状态下的蛋白制品由于所含水分少，经电离辐射后所产生自由基少，对蛋白制品的损伤也会减弱。

综上所述，γ射线是一种有效灭活生物蛋白制品中病毒的方法。尽管对某些蛋白制品生物活性有不同程度的影响，但如果能研制出效果好的蛋白保护剂，γ-射线辐照技术将可用于蛋白制品的病毒灭活处理，蛋白制品的临床应用安全系数也会得到明显提高。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持生物材料的功能和结构的动物纤维蛋白原病毒灭活方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，该方法是将至少含一种生物材料及稳定剂的组成物质封装、冻干、粉碎成冻干粉，在-10～40℃下进行20～40KGy的钴⁶⁰伽马射线的辐照。

所述的组成物质中的生物材料为蛋白质，包括但不限于哺乳动物的血液蛋白组分：凝血因子，包括维生素K依赖性蛋白，及非维生素K依赖性蛋白；白蛋白；脂蛋白；补体蛋白；球蛋白；典型的血液蛋白组分包括因子I(纤维蛋白原)，因子II(凝血酶原)因子III(组织因子)，因子V(促凝血球蛋白原)，因子VI(促凝血球蛋白)，因子VIII(抗血友病因子B)，因子X(Stuart-Prower因子)，因子XI(血浆凝血激酶前质)，因子XII(Hageman因子)，因子XIII(转谷氨酰胺酶)，von Willebrands因子，(vFW))，因子Ia，因子IIa，因子IIIa，因子Va，因子Via，因子VIIa，因子VIIIa，因子IXa，因子Xa，因子XIa，因子XIIa，因子XIIIa，同时还包括血红细胞中的蛋白。

所述的维生素K依赖性蛋白包括因子VII或因子IX，所述的非维生素K依赖性蛋白包括因子VIII或von Willebrands因子，所述的脂蛋白包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，所述的球蛋白包括免疫球蛋白IgA，IgM，IgG及IgE，所述的血红细胞中的蛋白包括血红蛋白和各种生长因子，及这些蛋白的衍生物。

所述的组成物质中的生物材料为蛋白质，包括但不限于从哺乳动物血液以外组织提取物，包括糖苷酶，硫酸酯酶，尿激酶，胶原或上述混合物。

所述的组成物质中的生物材料为蛋白质，包括但不限于细胞培养所获得的蛋白质或多肽。

所述的稳定剂为L-精氨酸盐酸盐，枸橼酸三钠和氯化钠；所述的生物材料为从哺乳动物体内提取的纤维蛋白原复合物，哺乳动物包括人、牛、马、猪和羊。

所述的组成物质的制剂配比以重量克/100ml计为：

蛋白质：        0.1～20g％

L-精氨酸盐酸盐：0.1～10g％

氯化钠：        0.01～10g％

枸橼酸钠：      0.01～5g％。

所述的组成物质的制剂配比以重量克/100ml计为：

蛋白质：        3～15g％

L-精氨酸盐酸盐：0.5～2g％

氯化钠：        0.3～1g％

枸橼酸钠：      1～3g％。

所述的组成物质中残留水份含量为0.5～15g％；所述的冻干粉的直径为5～100微米

所述的组成物质中残留水份含量为0.5～5g％。

与现有技术相比，本发明采用至少含一种生物材料及稳定剂的组成物质；该组成物质可以承受20-40KGy的钴⁶⁰伽玛射线的辐照制备抗辐照的动物源纤维蛋白原，本发明中生物材料及稳定剂的组成物质可以承受20-40KGy的钴⁶⁰伽玛射线的辐照；在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物(包括除□病毒以外的病毒，细菌，支原体，霉菌等)的同时，维持该生物材料的功能和结构。

附图说明

图1为实施例3中SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，纤维蛋白原复合物粗提，纯化；测定纯化后纤维蛋白复合物的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀。最终溶液含有蛋白质：8.6％、氯化钠：2.3％、L-精氨酸盐酸盐：3％、枸橼酸三钠：2.4％；封装，冻干；微生物限量测定细菌总数于100CFU/瓶(7ml西林瓶)。然后，在室温下，进行总剂量为25KGy的钴⁶⁰伽玛射线辐照。以实现最终灭菌灭病毒。

实施例2

采用无菌采血法经过心脏穿刺获取无菌猪血20L，在洁净车间(洁净度为10000级保护下的100级)内，离心法4000rpm得到9L血浆，在2℃，pH值7.0条件下，加入1∶9的冷酒精，4000rpm离心，收集沉淀；将沉淀等分为两份。

第一份加入溶解液，溶解后液体的组成成分如下：蛋白质：8.6％、氯化钠：2.3％、L-精氨酸盐酸盐：3％、枸橼酸三钠：2.4％；第二份加入溶解液，溶解后液体的组成成分如下：蛋白质：8.6％，维生素C：200mM，氯化钠：2.3％，枸橼酸三钠：2.4％。

将上述两部分液体取样，各自分成3等分，每等分分别加入约～10⁷qfu/ml的猪细小病毒(PPV)，分装到西林瓶，1ml/瓶，粉碎后，再次冷冻干燥，使冻干粉的水分含量≤1％。送辐照中心在-10-40℃条件下进行钴60伽马射线辐照，辐照剂量为分别为5，10，15，20，25，30，35，40KGy.采用Reed-muench TCID₅₀法测定辐照前后病毒滴度降低(Total Reduction Factor TRF)情况，实验数据如下：

结果表明，与抗坏血酸相比较，采用精氨酸盐酸作为保护剂，在25-30KGy的辐照剂量下，PPV的TRF降低了近5.0，而抗坏血酸组仅仅降低了2-3.5.从而说明，松力保护剂较抗坏血酸组更加有效地增强了辐照的灭病毒作用。

实施例3

根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，纤维蛋白原复合物粗提，纯化；测定纯化后纤维蛋白复合物的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀。最终溶液含有蛋白质：8.6％、氯化钠：2.3％、L-精氨酸盐酸盐：3％、枸橼酸三钠：2.4％；封装，冻干；微生物限量测定细菌总数于100CFU/瓶(7ml西林瓶)。然后，在室温下，进行总剂量为25KGy的钴⁶⁰伽玛射线辐照。以实现最终灭菌灭病毒。

随机抽取两组批号进行稳定性测试。测定指标见实施例1.从每一批号中：分别取120套置于冷冻箱中(为期3年)、120套置于37℃及75％相对湿度的烘箱中(为期6个月)、120套置于25℃空调房中(为期6个月)作为测试样本。在此之前，已进行过基线时间测试，且测试结果均合格.在为期3年的实时测试过程中，前半年内每月选取10套样品进行检测，此后，每一年选取10套样品进行检测，检测结果记录在表中。进行加速测试中，前半年内每月选取10套样品进行测试，在满1年储存期时再进行测试.

检测结果均符合实施例1的要求。因此，本次抽样稳定性测试结果为合格。

实施例4

一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，该方法是将从牛体内提取的纤维蛋白原复合物加入稳定剂搅拌均匀，得到溶液含有蛋白质0.1g％、L-精氨酸盐酸盐10g％、氯化钠10g％、枸橼酸钠5g％，封装、冻干、残留水份含量为0.5g％，然后粉碎成直径为5微米冻干粉，在-10℃下进行20KGy的钴⁶⁰伽马射线的辐照。

实施例5

一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，该方法是将从羊体内提取的纤维蛋白原复合物加入稳定剂搅拌均匀，得到溶液含有蛋白质20g％、L-精氨酸盐酸盐0.1g％、氯化钠0.01g％、枸橼酸钠0.01g％，封装、冻干、残留水份含量为15g％，然后粉碎成直径为100微米冻干粉，在40℃下进行40KGy的钴⁶⁰伽马射线的辐照。

实施例6

一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，该方法是将从马体内提取的纤维蛋白原复合物加入稳定剂搅拌均匀，得到溶液含有蛋白质3g％、L-精氨酸盐酸盐2g％、氯化钠1g％、枸橼酸钠3g％，封装、冻干、残留水份含量为5g％，然后粉碎成直径为20微米冻干粉，在20℃下进行30KGy的钴⁶⁰伽马射线的辐照。

实施例7

一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，该方法是将从马体内提取的纤维蛋白原复合物加入稳定剂搅拌均匀，得到溶液含有蛋白质15g％、L-精氨酸盐酸盐0.5g％、氯化钠0.3g％、枸橼酸钠1g％，封装、冻干、残留水份含量为1g％，然后粉碎成直径为60微米冻干粉，在25℃下进行25KGy的钴⁶⁰伽马射线的辐照。

Claims (10)

1.一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，该方法是将至少含一种生物材料及稳定剂的组成物质封装、冻干、粉碎成冻干粉，在-10～40℃下进行20～40KGy的钴⁶⁰伽马射线的辐照。

2.根据权利要求1所述的一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，所述的组成物质中的生物材料为蛋白质，包括但不限于哺乳动物的血液蛋白组分：凝血因子，包括维生素K依赖性蛋白，及非维生素K依赖性蛋白；白蛋白；脂蛋白；补体蛋白；球蛋白；典型的血液蛋白组分包括因子I(纤维蛋白原)，因子II(凝血酶原)因子III(组织因子)，因子V(促凝血球蛋白原)，因子VI(促凝血球蛋白)，因子VIII(抗血友病因子B)，因子X(Stuart-Prower因子)，因子XI(血浆凝血激酶前质)，因子XII(Hageman因子)，因子XIII(转谷氨酰胺酶)，von Willebrands因子，(vFW))，因子Ia，因子IIa，因子IIIa，因子Va，因子Via，因子VIIa，因子VIIIa，因子IXa，因子Xa，因子XIa，因子XIIa，因子XIIIa，同时还包括血红细胞中的蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，所述的维生素K依赖性蛋白包括因子VII或因子IX，所述的非维生素K依赖性蛋白包括因子VIII或von Willebrands因子，所述的脂蛋白包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，所述的球蛋白包括免疫球蛋白IgA，IgM，IgG及IgE，所述的血红细胞中的蛋白包括血红蛋白和各种生长因子，及这些蛋白的衍生物。

4.根据权利要求1所述的一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，所述的组成物质中的生物材料为蛋白质，包括但不限于从哺乳动物血液以外组织提取物，包括糖苷酶，硫酸酯酶，尿激酶，胶原或上述混合物。

5.根据权利要求1所述的一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，所述的组成物质中的生物材料为蛋白质，包括但不限于细胞培养所获得的蛋白质或多肽。

6.根据权利要求1所述的一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，所述的稳定剂为L-精氨酸盐酸盐，枸橼酸三钠和氯化钠；所述的生物材料为从哺乳动物体内提取的纤维蛋白原复合物，哺乳动物包括人、牛、马、猪和羊。

7.根据权利要求1所述的一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，所述的组成物质的制剂配比以重量克/100ml计为：

蛋白质：                    0.1～20g％

L-精氨酸盐酸盐：            0.1～10g％

氯化钠：                    0.01～10g％

枸橼酸钠：                  0.01～5g％。

8.根据权利要求7所述的一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，所述的组成物质的制剂配比以重量克/100ml计为：

蛋白质：                    3～15g％

L-精氨酸盐酸盐：            0.5～2g％

氯化钠：                    0.3～1g％

枸橼酸钠：                  1～3g％。

9.根据权利要求1所述的一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，所述的组成物质中残留水份含量为0.5～15g％；所述的冻干粉的直径为5～100微米

10.根据权利要求5所述的一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，其特征在于，所述的组成物质中残留水份含量为0.5～5g％。

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