CN101759766B

CN101759766B - 一种动物源可凝固蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN101759766B
Application number: CN200810202981.2A
Authority: CN
Inventors: 何红兵
Original assignee: SONGLI BIOTECHNOLOGY CO Ltd SHANGHAI
Current assignee: SONGLI BIOTECHNOLOGY CO Ltd SHANGHAI
Priority date: 2008-11-19
Filing date: 2008-11-19
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2028-11-19
Also published as: CN101759766A

Abstract

本发明涉及一种动物源可凝固蛋白的制备方法，该方法是将至少含一种生物材料及稳定剂的组成物质冻干、粉碎成冻干粉、封装，在100℃下进行30分钟病毒灭活。与现有技术相比，本发明具有在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持生物材料的功能和结构等优点。

Description

一种动物源可凝固蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及动物纤维蛋白原，尤其是涉及一种动物源可凝固蛋白的制备方法。

背景技术

现有蛋白制品的病毒灭活/去除方法有其局限性，目前常用的病毒灭活方法有：巴氏灭活法、干热法、有机溶剂/去污剂法、低pH孵放等。有研究报道静脉注射免疫球蛋白(IVIG)产品可能传播丙肝病毒，输注血浆蛋白制品可能传播人类细小病毒B19。因此寻找一种能灭活所有病毒，且对蛋白制品活性影响较小、操作方便的方法，将有助于提高蛋白制品应用的安全性，随着血液制品的广泛应用，血液传播疾病的预防日益受到重视。为加强现有制品的病毒安全性，有必要增加一些有效的病毒灭活方式。其中巴氏灭活法最早与低温乙醇法结合用于对白蛋白的处理，并沿用至今，经此法处理的白蛋白是公认的安全制剂。干热法最早用于冻干的凝血因子制剂的病毒灭活，此外纳米膜过滤、亚甲蓝光敏法、压力循环法、亚胺法、交联碘淀粉法等的应用和效果都有报道。有机溶剂/去污剂被许多厂家用于灭活脂包膜病毒，对非脂包膜病毒没有作用。热处理能有效灭活冻干制品中的非脂包膜病毒，且已应用于凝血因子制剂的病毒灭活。其方式有80℃ 72h、100℃ 30min。本发明通过对纤维蛋白原热处理前后制品的理化性质进行分析，希望确定一种简便易行的处理方法，可用于二次病毒灭活。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持生物材料的功能和结构的动物源可凝固蛋白的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种动物源可凝固蛋白的制备方法，其特征在于，该方法是将至少含一种生物材料及稳定剂的组成物质冻干、粉碎成冻干粉、封装，在100℃下进行30分钟病毒灭活。

所述的组成物质中的生物材料为蛋白质，包括但不限于哺乳动物的血液蛋白组分：凝血因子，包括维生素K依赖性蛋白，及非维生素K依赖性蛋白；白蛋白；脂蛋白；补体蛋白；球蛋白；典型的血液蛋白组分包括因子I(纤维蛋白原)，因子II(凝血酶原)因子III(组织因子)，因子V(促凝血球蛋白原)，因子VI(促凝血球蛋白)，因子VIII(抗血友病因子B)，因子X(Stuart-Prower因子)，因子XI(血浆凝血激酶前质)，因子XII(Hageman因子)，因子XIII(转谷氨酰胺酶)，von Willebrands因子，(vFW))，因子Ia，因子IIa，因子IIIa，因子Va，因子Via，因子VIIa，因子VIIIa，因子IXa，因子Xa，因子XIa，因子XIIa，因子XIIIa，同时还包括血红细胞中的蛋白。

所述的维生素K依赖性蛋白包括因子VII或因子IX，所述的非维生素K依赖性蛋白包括因子VIII或von Willebrands因子，所述的脂蛋白包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，所述的球蛋白包括免疫球蛋白IgA，IgM，IgG及IgE，所述的血红细胞中的蛋白包括血红蛋白和各种生长因子，及这些蛋白的衍生物。

所述的组成物质中的生物材料为蛋白质，包括但不限于从哺乳动物血液以外组织提取物，包括糖苷酶，硫酸酯酶，尿激酶，胶原或上述混合物。

所述的组成物质中的生物材料为蛋白质，包括但不限于细胞培养所获得的蛋白质或多肽。

所述的稳定剂为L-精氨酸盐酸盐，枸橼酸三钠和氯化钠；所述的生物材料为从哺乳动物体内提取的纤维蛋白原复合物，哺乳动物包括人、牛、马、猪和羊。

所述的组成物质的制剂配比以重量克/100ml计为：

蛋白质： 0.1～20g％

L-精氨酸盐酸盐： 0.1～10g％

氯化钠： 0.01～10g％

枸橼酸钠： 0.01～5g％。

所述的组成物质的制剂配比以重量克/100ml计为：

蛋白质： 3～15g％

L-精氨酸盐酸盐： 0.5～2g％

氯化钠： 0.3～1g％

枸橼酸钠： 1～3g％。

所述的组成物质中残留水份含量为0.5～15％；所述的冻干粉的直径为5～100微米

所述的组成物质中残留水份含量为0.5～5％。

与现有技术相比，本发明采用至少含一种生物材料及稳定剂的组成物质；该组成物质可以制备抗辐照的动物源纤维蛋白原，本发明中生物材料及稳定剂的组成物质可以100℃，30分钟病毒灭活；在保证有效地杀灭可能污染的有膜和无膜病毒的同时，维持该生物材料的功能和结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，纤维蛋白原复合物粗提，纯化；测定纯化后纤维蛋白复合物的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀。最终溶液含有蛋白质：8.6％、氯化钠：2.3％、L-精氨酸盐酸盐：3％、枸橼酸三钠：2.4％；冻干、封装；微生物限量测定细菌总数小于300CFU/克。然后，100℃，30分钟病毒灭活。

实施例2

采用无菌采血法经过心脏穿刺获取无菌猪血20L，在洁净车间(洁净度为10000级保护下的100级)内，离心法4000rpm得到9L血浆，在2℃，pH值7.0条件下，加入1：9的冷酒精，4000rpm离心，收集沉淀；将沉淀等分为两份。

第一份加入溶解液，溶解后液体的组成成分如下：蛋白质：8.6％、氯化钠：2.3％、L-精氨酸盐酸盐：3％、枸橼酸三钠：2.4％；第二份加入溶解液，溶解后液体的组成成分如下：蛋白质：8.6％，维生素C：200mM，氯化钠：2.3％，枸橼酸三钠：2.4％。

将上述两部分液体取样，各自分成3等分，每等分分别加入约～10⁷qfu/ml的猪细小病毒(PPV)，分装到西林瓶，1ml/瓶，粉碎后，再次冷冻干燥，使冻干粉的水分含量≤1％100℃，30分钟病毒灭活，采用Reed-muench TCID₅₀法测定辐照前后病毒滴度降低(Total Reduction Factor TRF)情况，实验数据如下：

结果表明，与抗坏血酸相比较，采用L-精氨酸盐酸、氯化钠和柠檬酸钠作为保护剂，在100℃，30分钟的条件下，PPV的TRF降低了近4.5-5.0，而抗坏血酸组仅仅降低了2—3.从而说明，L-精氨酸盐酸、氯化钠和柠檬酸钠较抗坏血酸组更加有效地增强了辐照的灭病毒作用。

实施例3

根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，纤维蛋白原复合物粗提，纯化；测定纯化后纤维蛋白复合物的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀。最终溶液含有蛋白质：8.6％、氯化钠：2.3％、L-精氨酸盐酸盐：3％、枸橼酸三钠：2.4％；冻干，封装；微生物限量测定细菌总数小于300CFU/克。然后，100℃，30分钟病毒灭活

随机抽取两组批号进行稳定性测试。测定指标见实施例1.从每一批号中：分别取120套置于冷冻箱中(为期3年)、120套置于37℃及75％相对湿度的烘箱中(为期6个月)、120套置于25℃空调房中(为期6个月)作为测试样本。在此之前，已进行过基线时间测试，且测试结果均合格.在为期3年的实时测试过程中，前半年内每月选取10套样品进行检测，此后，每一年选取10套样品进行检测，检测结果记录在表中。进行加速测试中，前半年内每月选取10套样品进行测试，在满1年储存期时再进行测试.

检测结果均符合实施例1的要求。因此，稳定性测试结果为合格。

实施例4

一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，该方法是将从牛体内提取的纤维蛋白原复合物加入稳定剂搅拌均匀，得到溶液含有蛋白质0.1g％、L-精氨酸盐酸盐10g％、氯化钠10g％、枸橼酸钠5g％，封装、冻干、残留水份含量为0.5％，100℃，30分钟病毒灭活。

实施例5

一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，该方法是将从羊体内提取的纤维蛋白原复合物加入稳定剂搅拌均匀，得到溶液含有蛋白质20g％、L-精氨酸盐酸盐0.1g％、氯化钠0.01g％、枸橼酸钠0.01g％，冻干、封装、残留水份含量为15％，100℃，30分钟病毒灭活。

实施例6

一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，该方法是将从马体内提取的纤维蛋白原复合物加入稳定剂搅拌均匀，得到溶液含有蛋白质3g％、L-精氨酸盐酸盐2g％、氯化钠1g％、枸橼酸钠3g％，封装、冻干、残留水份含量为5％，100℃，30分钟病毒灭活。

实施例7

一种动物纤维蛋白原病毒灭活方法，该方法是将从马体内提取的纤维蛋白原复合物加入稳定剂搅拌均匀，得到溶液含有蛋白质15g％、L-精氨酸盐酸盐0.5g％、氯化钠0.3g％、枸橼酸钠1g％，封装、冻干、残留水份含量为1％，100℃，30分钟病毒灭活。

Claims

1.一种动物源可凝固蛋白的制备方法，其特征在于，该方法是将至少含一种生物材料及稳定剂的组成物质冻干、粉碎成冻干粉、封装，在100℃下进行30分钟病毒灭活；

所述的稳定剂为L-精氨酸盐酸盐，枸橼酸钠和氯化钠；所述的生物材料为从哺乳动物体内提取的纤维蛋白原复合物，哺乳动物包括人、牛、马、猪和羊；

所述的组成物质的制剂配比以重量克/100ml计为：

2.根据权利要求1所述的一种动物源可凝固蛋白的制备方法，其特征在于，所述的组成物质的制剂配比以重量克/100ml计为：

3.根据权利要求1所述的一种动物源可凝固蛋白的制备方法，其特征在于，所述的组成物质中残留水份含量为0.5～15％；所述的冻干粉的直径为5～100微米。

4.根据权利要求3所述的一种动物源可凝固蛋白的制备方法，其特征在于，所述的组成物质中残留水份含量为0.5～5％。