CN104099288B - 一种新生牛血清的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新生牛血清的生产工艺，包括以下步骤：选取原料血清，入库保存；将原料血清移入融化间进行融化，然后保存；采用纯化水对原料血清包装袋进行清洗后，再采用注射用水清洗，最后在酒精中浸泡消毒；将消毒后的原料血清包装袋进行无菌剪口，粗滤；将粗滤后的血清进行澄清过滤，速冻，保存；将速冻后的血清注入灭菌后的混合罐中，在混合罐中进行搅拌；将搅拌后的血清注入筒式过滤器中进行除菌过滤，除菌过滤后的血清通过过渡罐进入自动灌装线进行分装；将分装后的血清进行抽样检验，对检查合格后的产品进行包装。该工艺能够彻底实现杜绝支原体及病菌的污染，完全满足对牛血清的使用要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种新生牛血清的生产工艺，尤其涉及一种无菌生产工艺。
背景技术
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。它提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。它还能够提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力；有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。牛血清还是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。另外牛血清还起酸碱度缓冲液作用以及提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。
胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。
根据2005版《中华人民共和国药典》第三部附录的要求，胎牛血清的各项质量指标符合以下要求：1、性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。2、蛋白质含量3.5％～5.0％(w/v)3、血红蛋白含量≤0.02％(w/v)4、无菌检验——阴性5、支原体检验——阴性；6、细菌内毒素≤5(EU/ml)；7、牛腹泻病毒——阴性8、大肠杆菌噬菌体——阴性9、支持细胞增殖——(Sp2/0-Ag14)；生长曲线(接种浓度)最大增殖浓度≥2.5×106个/ml；细胞倍增时间≤15h；克隆率≥85％。
在实际生产新生牛血清的过程中，一般工艺很难做到无病菌支原体污染，因为牛血清产品在生产过程中环节众多、繁杂，存在有多个污染漏洞，比如：为了保障产品血清的均一性，以保障细胞培养过程的稳定性和疫苗病毒的产量，必须将多批次的牛血清进行混合。目前的血清混合工艺多是在洁净环境开放条件下完成的，皮肤、唾液气溶胶、呼吸气溶胶、汗渍等人体脱落物以及原料血清外包装携带的包括支原体在内的微生物都有可能在混合过程中进入牛血清。为了保障血清无菌状态，可以采取多级过滤程序，移除掉混合过程中污染的细菌。但是支原体具有形态学可变特性，高压条件下支原体可以通过变形而通过微孔滤膜，因此多级过滤程序并不能防止支原体的污染。
发明内容
本发明解决了背景技术中的不足，提供了一种新生牛血清的生产工艺，该工艺能够彻底实现杜绝支原体及病菌的污染，完全满足对牛血清的使用要求。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种新生牛血清的生产工艺，包括以下步骤：(1)、选取浅黄色、澄清且粘稠的原料血清，其pH值为6.8～8.0，蛋白质含量为3.5％～5.0％，细菌内毒素低于10EU/mL，将原料血清在低于-15℃的条件下进行入库保存；
(2)、将原料血清移入融化间进行融化，融化间温度为18～26℃，待原料血清融化后，采用纯净水对原料血清包装袋进行清洗，然后在-5℃～-2℃的条件下保存；
(3)、采用纯化水对原料血清包装袋进行清洗后，再采用注射用水清洗，最后在酒精中浸泡消毒；
(4)、将消毒后的原料血清包装袋进行无菌剪口，用100目不锈钢网进行粗滤，粗滤后的血清在-5℃～-2℃的条件下保存；
(5)、将粗滤后的血清用0.45μm的滤膜进行澄清过滤，澄清后的血清在低于-15℃的条件下速冻，速冻后的血清在-5℃～-2℃的条件下保存；
(6)、将速冻后的血清注入灭菌后的混合罐中，在混合罐中进行搅拌，搅拌速度为15～20转/min，搅拌时间为60～70min；
(7)、将搅拌后的血清注入筒式过滤器中进行除菌过滤，滤芯孔径为0.1μm，在筒式过滤器中并联装载有3～7根滤芯，除菌过滤后的血清通过过渡罐进入自动灌装线进行分装；
(8)、将分装后的血清进行抽样检验，检验项目包括蛋白质含量测定、血红蛋白含量测定、大肠杆菌噬菌体测定、渗透压摩尔浓度测定、无菌检查、支原体检查、细菌内毒素测定、病毒检查以及支持细胞增殖检查，所述的病毒检查方法包括细胞培养法和免疫荧光抗体检查法；
(9)、对检查合格后的产品进行包装。
步骤(3)中将原料血清包装袋在质量浓度为75％的酒精中浸泡30分钟。
步骤(5)中在澄清过滤前，采用生理盐水进行系统平衡，平衡后的流出物取样进行pH值和细菌内毒素检测，pH值为6.8～8.0，细菌内毒素低于10EU/mL。
本发明提供的新生牛血清的生产工艺与现有技术相比有以下优点：本发明哎步骤(3)中，采用75％浓度的酒精对原料血清包装袋进行浸泡消毒，能够有效地杀死包装袋表面的细菌。本发明在步骤(6)中采用大罐混匀，能够增大血清生产率。现有技术采用单根滤芯过滤，本发明在步骤(7)中采用3-7根滤芯并联过滤，使生产率增大，同时减少滤芯更换频率，从而降低了污染风险。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
本发明提供的新生牛血清的生产工艺，包括以下步骤：(1)、选取浅黄色、澄清且粘稠的原料血清，原料血清采集自出生14小时内未进食的新生牛中，上述原料血清pH值为6.8～8.0，蛋白质含量为3.5％～5.0％，细菌内毒素低于10EU/mL，将原料血清在低于-15℃的条件下进行入库保存。
(2)、将原料血清移入融化间进行融化，融化间的不锈钢多层架先擦洗干净，再用75％酒精清洁消毒，融化间温度为18～26℃，待融化状态为98％左右，实时巡查剔除破漏血袋。采用纯净水对原料血清包装袋进行清洗，然后在-5℃～-2℃的条件下保存。
(3)、采用纯化水对原料血清包装袋进行清洗后，再采用注射用水清洗，最后在质量浓度为75％的酒精中浸泡30分钟消毒。
(4)、将消毒后的原料血清包装袋进行无菌剪口，用100目不锈钢网进行粗滤并存放于收集瓶中，每瓶取样10ml进行细菌内毒素检查。粗滤后的血清在-2℃～2℃的条件下保存。
(5)、将粗滤后的血清用0.45μm的滤膜进行澄清过滤，澄清后的血清在低于-15℃的条件下速冻，待20％冰冻后，血清在-5℃～-2℃的条件下保存。在澄清过滤前，采用生理盐水进行系统平衡，平衡后的流出物取样进行pH值和细菌内毒素检测，pH值为6.8～8.0，细菌内毒素低于10EU/mL。
(6)、将速冻后的血清注入灭菌后的混合罐中，在混合罐中进行搅拌，搅拌速度为15～20转/min，搅拌时间为60～70min。混合罐使用前在线湿热高压灭菌、温度121℃、60分钟、压力0.23Mpa，血清入罐前排放罐体及管道蒸汽冷凝水。
(7)、将搅拌后的血清注入筒式过滤器中进行除菌过滤，滤芯孔径为0.1μm，在筒式过滤器中并联装载有3～7根滤芯，本实施例中装载有5根滤芯，除菌过滤后的血清通过过渡罐进入自动灌装线进行分装；
(8)、将分装后的血清进行抽样检验，检验项目包括：
蛋白质含量测定：应为3.5％～5.0％(W/V)，方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录VIB凯式定氮法)进行。
血红蛋白含量测定：应不高于0.02％。方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录XⅢD新生牛血清检定要求，氰化高铁法或其他适宜的方法测定)进行。
大肠杆菌噬菌体测定：不得有噬菌体污染。方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录XⅢD新生牛血清检定要求，噬斑法和增殖法检测)进行。
渗透压摩尔浓度测定：应为250～400mOsmol/kg。方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录VH)进行。
无菌检查：应无菌生长。方法按《中华人民共和国药典》现行版三部(附录XⅡA)项进行。
支原体检查：原体检查阴性。方法按《中华人民共和国药典》现行版三部(XⅡB直接培养法和DNA荧光染色法)进行。
细菌内毒素测定：应不高于10EU/ml。方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录XⅡE凝胶限度试验)进行。
病毒检查：1)细胞培养法：应符合规定。方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录XⅢD新生牛血清检定要求)进行。
2)免疫荧光抗体检查法：结果应均为阴性。方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录XⅢD新生牛血清检定要求)进行。
支持细胞增殖检查：
1)细胞生长曲线的测定：细胞的最大增殖浓度应不低于1ml含106个细胞。
2)细胞倍增时间的测定：细胞的倍增时间不得超过20小时。
3)克隆率的测定：应不低于70％。
以上方法按《中华人民共和国药典》现行三版(附录XⅢD新生牛血清检定要求)进行。
(9)、对检查合格后的产品进行包装。
Claims (2)
1.一种新生牛血清的生产工艺，其特征在于包括以下步骤：(1)、选取浅黄色、澄清且粘稠的原料血清，其pH值为6.8～8.0，蛋白质含量为3.5％～5.0％，细菌内毒素低于10EU/mL，将原料血清在低于-15℃的条件下进行入库保存；
(2)、将原料血清移入融化间进行融化，融化间温度为18～26℃，待原料血清融化后，采用纯净水对原料血清包装袋进行清洗，然后在-5℃～-2℃的条件下保存；
(3)、采用纯化水对原料血清包装袋进行清洗后，再采用注射用水清洗，最后在酒精中浸泡消毒；
(4)、将消毒后的原料血清包装袋进行无菌剪口，用100目不锈钢网进行粗滤，粗滤后的血清在-5℃～-2℃的条件下保存；
(5)、将粗滤后的血清用0.45μm的滤膜进行澄清过滤，在澄清过滤前，采用生理盐水进行系统平衡，平衡后的流出物取样进行pH值和细菌内毒素检测，pH值为6.8～8.0，细菌内毒素低于10EU/mL；澄清后的血清在低于-15℃的条件下速冻，速冻后的血清在-5℃～-2℃的条件下保存；
(6)、将速冻后的血清注入灭菌后的混合罐中，在混合罐中进行搅拌，搅拌速度为15～20转/min，搅拌时间为60～70min；
(7)、将搅拌后的血清注入筒式过滤器中进行除菌过滤，滤芯孔径为0.1μm，在筒式过滤器中并联装载有3～7根滤芯，除菌过滤后的血清通过过渡罐进入自动灌装线进行分装；
(8)、将分装后的血清进行抽样检验，检验项目包括蛋白质含量测定、血红蛋白含量测定、大肠杆菌噬菌体测定、渗透压摩尔浓度测定、无菌检查、支原体检查、细菌内毒素测定、病毒检查以及支持细胞增殖检查，所述的病毒检查方法包括细胞培养法和免疫荧光抗体检查法；
(9)、对检查合格后的产品进行包装。
2.根据权利要求1所述的新生牛血清的生产工艺，其特征在于：步骤(3)中将原料血清包装袋在质量浓度为75％的酒精中浸泡30分钟。
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