CN110464874B - 一种具有神经组织修复活性的聚合物材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有神经组织修复活性的聚合物材料及其制备方法和应用，所述聚合物材料是由单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物与聚乳酸‑羟基乙酸共聚物通过酰胺键连接得到的；所述单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物如式(Ⅰ)所示。该聚合物材料具有良好的生物相容性、可降解性和力学性能；该聚合物材料使PLGA无需负载多种促修复相关因子即可具有神经修复功能，从而使利用该聚合物材料制备得到的支架体系更为简单，有利于后期临床应用与储存，是一种颇具临床应用前景的生物活性材料。

Description

一种具有神经组织修复活性的聚合物材料及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于神经修复技术领域，具体涉及一种聚合物材料及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有神经组织修复活性的聚合物材料及其制备方法和应用。
背景技术
创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)通常是指头部在外部机械应力的作用下，对脑组织产生强烈冲击所造成的组织缺损、神经连接断裂以及相应功能丢失。TBI不仅会造成脑组织的结构缺失，亦能在损伤区域形成不利于神经元恢复的继发性损伤微环境。TBI后脑组织的自我修复能力极其有限，TBI治疗已经成为临床治疗的难点。
目前，TBI后治疗的主要策略包括神经营养因子治疗、干细胞移植治疗和组织工程方法。活性因子具有显著刺激神经系统愈合和发育的作用，但存在半衰期短，体内环境易失活、流动性差，难在体内难达到有效药物浓度的缺点。而干细胞移植治疗则具有细胞来源有限，移植后死亡率较高，且伴随着诱发免疫抵抗的风险。相比而言，神经组织修复工程支架不仅能模拟细胞外基质为细胞黏附、迁移、生长提供空间结构，填补TBI后脑组织物理缺损，还可以通过装载细胞或活性物质促进损伤组织进一步修复。因此，近年来借助神经修复组织工程支架已成为TBI后组织修复备受关注的重要策略。然而，在神经修复支架上负载细胞和活性因子存在移植细胞存活率不高，以及活性因子易失活，局部浓度不足等问题。
颅内组织微环境的稳定性是中枢神经系统发挥正常生理功能的关键，因此组织修复工程支架材料的生物相容性就显得极其重要，但这也使得其材料选择相当有限。常用的组织工程支架材料主要包括天然的和人工合成两大类，其中PLGA是一种使用广泛的人工合成材料，其降解产物是人体细胞代谢产物乳酸和羟基乙酸，具有良好的生物相容性、可降解性和力学性能，现已被FDA批准用于临床，PLGA作为常用的医疗器械已经广泛应用于临床，如组织移植物、手术缝合线、骨组织工程支架和药物递送载体等。但常用神经修复工程支架材料本身缺乏神经修复活性，需通过负载多种促修复相关因子，从而增加了支架体系的复杂性，限制其后期临床应用与储存。
单唾液酸四己糖神经节苷脂是一种含唾液酸的神经鞘脂，可以加速受损神经细胞的修复，促进神经细胞的生长和再生，改善神经传导等，主要用于中枢和周围神经系统病症的修复和治疗，被认为是目前临床上治疗脊髓损伤最有效的药物之一。研究发现，GM1可以维持神经细胞膜上酶的活性，调节Ca2+的浓度，维持细胞内外离子浓度平衡；GM1还可以清除自由基，抑制脂质过氧化，减轻兴奋性氨基酸引起的毒性作用；GM1对于神经元还具有保护、修复和再生的作用，促进多种原因引起的中枢神经系统病变的神经元修复，加速组织重构。目前已经有进口注射水针上市，有效成分为单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(GM1)。GM1在临床上的使用主要通过外周途径注射给药，尽管外源性GM1具有脂溶性可以穿过血脑屏障，但是药代动力学研究证实，注射入体内后的GM1主要通过肝脏摄取，中枢神经系统内含量很少，只有20％左右进入脑、脊髓等部位发挥作用，而且中枢神经系统中GM1含量要在给药后8-16个小时才达高峰，临床上常加大使用频率以维持所需的药物浓度，极大增加了患者的不良反应和副作用。
CN102641281A公开了一种注射用单唾液酸四己糖神经节苷脂钠及其制备方法，主要针对GM1在临床上通过外周途径长时间大剂量反复给药治疗脊髓损伤的问题，该发明制备注射用单唾液酸四己糖神经节苷脂钠微球(包含GM1、明胶和PLGA)，以实现药物持续、稳定释放，解决常规制剂带来的血药浓度波动的问题。
在GM1研究相关的专利中，CN106309410B公开了一种单唾液酸四己糖神经节苷脂钠缓释胶囊及其制备方法；CN104004801B公开了一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法；CN103087120A公开了单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用，上述专利主要集中于GM1的提取、合成和制备等。在PLGA相关的神经修复支架专利中，CN104548203B公开了一种富含胶原蛋白人工神经支架的制备方法，该支架包括支架膜料以及支架膜料包裹的可降解金属丝，所述支架膜料含有胶原蛋白，神经生长因子和PLGA，具有良好的力学性能，生物可降解性和NGF缓释作用；CN109172864A公开了一种雪旺细胞与神经干细胞联合粘连蛋白和壳聚糖涂层的PLGA导管应用于神经修复。
以上现有技术并没有解决神经修复支架上负载细胞和活性因子存在的移植细胞存活率不高、活性因子易失活、局部浓度不足、支架体系过于复杂等问题，也没有解决GM1存在的中枢神经系统内有效含量很少的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种聚合物材料及其制备方法和应用，尤其提供一种具有神经组织修复活性的聚合物材料及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种具有神经组织修复活性的聚合物材料，所述聚合物材料是由单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物通过酰胺键连接得到的；所述单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物如式(Ⅰ)所示：
Figure GDA0003171470470000041
本发明将单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)通过特异性的水解酶鞘糖脂N-去酰基化酶水解其神经酰胺部分的酰胺基团，得到水解产物，该水解产物保留了GM1的亲水性多糖结构，且具有游离的氨基基团，将其与具有活化羧基的PLGA相连，得到了一种新型的聚合物材料。该聚合物材料具有良好的生物相容性、可降解性和力学性能；式(Ⅰ)所示的水解产物与GM1一样具有神经保护作用，还可以减少Aβ淀粉样蛋白的沉积，因此该聚合物材料具有神经修复功能，同时可以有效解决传统外周途径GM1给药药效低的问题；另外，该聚合物材料使PLGA无需负载多种促修复相关因子即可具有神经修复功能，从而使利用聚合物材料制备得到的支架体系更为简单，有利于后期临床应用与储存。研究结果表明：本发明所涉及的聚合物材料及其制备得到的工程支架对原代神经元具有明显的促进作用，并能对损伤后的神经元突起延伸和保护的作用，是一种颇具临床应用前景的生物活性材料。
优选地，所述聚合物材料是由单唾液酸四己糖神经节苷脂水解产物的游离氨基与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的末端羧基通过酰胺键连接得到的。
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量为6.6-10.7kDa，例如6.6kDa、7.0kDa、7.5kDa、8.0kDa、8.5kDa、9.0kDa、10.0kDa或10.7kDa等。
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量特定选择为6.6-10.7kDa，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量是影响本发明所述聚合物材料的降解周期和后期静电纺丝效果的关键因素，只有将数值选择在上述范围内，才能更好地平衡好这两方面的关系。
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸结构单元与羟基乙酸结构单元的摩尔比为(70-80):(20-30)，例如70:30、72:28、74:26、75:25、78:22或80:20等。
通常乳酸结构单元与羟基乙酸结构单元的比例接近时降解较快，且乳酸结构单元的比例增多聚合物材料的刚性增加，因此将摩尔比特定选择在上述范围内才能更好地平衡上述两方面。
第二方面，本发明提供一种如上所述的聚合物材料的制备方法，所述制备方法为：将式(Ⅰ)所示的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物进行酰胺缩合反应，即得所述具有神经组织修复活性的聚合物材料。
在本发明中，所述水解产物的制备方法包括：将溶于缓冲溶液的单唾液酸四己糖神经节苷脂与鞘糖脂N-去酰基化酶(SCDase)混合，进行反应，离心，将上清液冷冻干燥，得到所述水解产物。
优选地，所述缓冲溶液包括浓度为30-40mM的醋酸钠、质量百分含量为0.3-0.5％的牛磺脱氧胆酸水合物和浓度为90-110mM的氯化钙。
所述醋酸钠在缓冲溶液中的浓度可以为30mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM或40mM等。醋酸钠浓度的过高或过低都会降低单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解效率，在上述浓度范围内其水解效率是最好的。
所述牛磺脱氧胆酸水合物在缓冲溶液中的质量百分含量可以为0.3％、0.38％、0.4％、0.42％、0.45％或0.5％等。
所述氯化钙的浓度可以为90mM、92mM、95mM、98mM、100mM、102mM、105mM或110mM等。
优选地，所述缓冲溶液的pH值为5.5-6.0，例如5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0等。
优选地，所述缓冲溶液的pH值用冰醋酸进行调节。
优选地，所述反应的温度为30-40℃，例如30℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、38℃或40℃等。
优选地，所述反应的时间为10-15h，例如10h、11h、12h、13h、14h或15h等。
优选地，所述离心的转速为10000-14000r/min，例如10000r/min、11000r/min、12000r/min、13000r/min或14000r/min等。
优选地，所述离心的时间为3-6min，例如3min、4min、5min或6min等。
在本发明中，所述将式(Ⅰ)所示的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物进行酰胺缩合反应的方法包括如下步骤：
(1)将式(Ⅰ)所示的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂，并加入三丁胺(TBA)和羟基苯并三唑(HOBT)，进行反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)得到的反应液加入预冷蒸馏水，形成胶体状沉淀即所述具有神经组织修复活性的聚合物材料。
优选地，步骤(1)所述有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，步骤(1)所述水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的摩尔比为1:(0.2-0.4)，例如1:0.2、1:0.3或1:0.4等。
优选地，步骤(1)所述所述水解产物与羟基苯并三唑的摩尔比为1:(1.6-2.0)，例如1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2.0等。
优选地，步骤(1)所述所述水解产物与三丁胺的摩尔比为1:(1.2-1.8)，例如1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7或1:1.8等。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为20-30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
优选地，步骤(1)所述反应的时间为1-3h，例如1h、2h或3h等。
优选地，步骤(2)所述预冷蒸馏水的温度为2-8℃，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃等。
优选地，步骤(2)所述形成胶体状沉淀后进行过滤、洗涤和干燥。
第三方面，本发明提供一种具有神经组织修复活性的工程支架，所述工程支架是由如上所述的具有神经组织修复活性的聚合物材料经静电纺丝制备得到的。
第四方面，本发明提供一种如上所述的工程支架的制备方法，所述制备方法为：将聚合物材料溶解于有机溶剂后进行静电纺丝，得到所述具有神经组织修复活性的工程支架。
优选地，所述有机溶剂为氯仿与N,N-二甲基甲酰胺以17:3的质量比混合得到的溶液。
优选地，所述聚合物材料在有机溶剂中的浓度为10-20wt％，例如10wt％、12wt％、15wt％、16wt％、18wt％或20wt％等。
优选地，所述溶解后进行搅拌并使用超声振荡器除去溶液中的气泡。
优选地，所述静电纺丝的电压为15-20kV，例如15kV、16kV、17kV、18kV、19kV或20kV等。
优选地，所述静电纺丝的温度为20-30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
优选地，所述静电纺丝的进样器流速为1-2mL/h，例如1mL/h、1.2mL/h、1.4mL/h、1.5mL/h、1.6mL/h、1.8mL/h或2mL/h等。
优选地，所述静电纺丝的接收装置为直径为10-20cm(例如10cm、12cm、15cm、18cm或20cm等)的圆形滚筒，转速为0-1600rpm，例如0rpm、200rpm、400rpm、800rpm、1200rpm、1400rpm或1600rpm等。
静电纺丝的电压、接收距离、流速和溶液浓度等对纺丝的形成均有重要影响。当溶液浓度过低时不易形成纺丝，浓度过高容易堵塞针头；适当的流速可形成均一、直径较细的纺丝；电压过低不足以引起液滴形成纺丝，接收距离不足纺丝中有机溶剂可能挥发不够而粘连。
优选地，得到所述具有神经组织修复活性的工程支架后对其进行真空干燥24-48h，例如24h、28h、30h、32h、35h、40h或48h等。
作为本发明的优选技术方案，所述工程支架的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将溶于缓冲溶液的单唾液酸四己糖神经节苷脂与鞘糖脂N-去酰基化酶混合，在30-40℃下进行反应10-15h，离心，将上清液冷冻干燥，得到式(Ⅰ)所示的水解产物；
(2)将步骤(1)得到的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于N,N-二甲基甲酰胺，并加入三丁胺和羟基苯并三唑，在20-30℃下进行反应1-3h，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液加入预冷蒸馏水，形成胶体状沉淀即具有神经组织修复活性的聚合物材料，进行过滤、洗涤和干燥；
(4)将步骤(3)得到的聚合物材料溶解于氯仿与N,N-二甲基甲酰胺以17:3的质量比混合得到的溶液中，进行静电纺丝，真空干燥24-48h，得到所述具有神经组织修复活性的工程支架。
第五方面，本发明提供一种如上所述的具有神经组织修复活性的聚合物材料或如上所述的具有神经组织修复活性的工程支架在制备创伤性脑损伤后组织修复药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明将单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)通过特异性的水解酶鞘糖脂N-去酰基化酶水解其神经酰胺部分的酰胺基团，得到水解产物，该水解产物保留了GM1的亲水性多糖结构，且具有游离的氨基基团，将其与具有活化羧基的PLGA相连，得到了一种新型的聚合物材料。该聚合物材料具有良好的生物相容性、可降解性和力学性能；式(Ⅰ)所示的水解产物与GM1一样具有神经保护作用，还可以减少Aβ淀粉样蛋白的沉积，因此该聚合物材料具有神经修复功能，同时可以有效解决传统外周途径GM1给药药效低的问题；另外，该聚合物材料使PLGA无需负载多种促修复相关因子即可具有神经修复功能，从而使利用聚合物材料制备得到的支架体系更为简单，有利于后期临床应用与储存。研究结果表明：本发明所涉及的聚合物材料及其制备得到的工程支架对原代神经元具有明显的促进作用，并能对损伤后的神经元突起延伸和保护的作用，是一种颇具临床应用前景的生物活性材料。
附图说明
图1是GM1标准品溶液的标准曲线图；
图2是PLGA-LysoGM1的合成过程示意图；
图3是PLGA-LysoGM1和PLGA的红外光谱图；
图4是PLGA、LysoGM1和PLGA-LysoGM1的核磁共振氢谱图；
图5是PLGA、LysoGM1和PLGA-LysoGM1的核磁共振碳谱图；
图6是实施例3制得的具有神经组织修复活性的工程支架的扫描电镜图；
图7是实施例4中各组CCK-8吸光度值的统计图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例制备单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的水解产物(用LysoGM1进行表示)并测定其水解效率，其制备方法如下：
(1)称取牛磺脱氧胆酸水合物(TDC)0.08g、氯化钙(CaCl2)10.1g于20mL的35mM醋酸钠缓冲溶液中(pH调节至5.8)；
(2)称取100mg GM1加入到上述缓冲溶液中，充分搅拌溶解；
(3)充分溶解后转移至50mL离心管中，加入15μL鞘糖脂N-去酰基化酶(浓度为5U/mL)，置于恒温(37℃)振荡箱中振荡反应12h；
(4)以12000r/min离心5min，取上清液冷冻干燥保存。
GM1的水解效率通过RP-HPLC进行测定，GM1的最大吸收波长为197nm左右，由于200nm以下干扰较多，因此选择205nm作为其测定波长。
具体步骤为：先将GM1标准品配制成系列浓度梯度，即配制0.05g/mL，0.75g/mL，0.1g/mL，0.15g/mL，0.2g/mL，0.3g/mL的GM1标准品溶液；然后配制0.01mol/L的四丁基硫酸氢钠溶液，并用三乙胺调节pH至6.3，抽滤后做流动相备用；取上述冷冻干燥水解产物制成水解溶液，加入蒸馏水稀释后备用；色谱条件为COSMOSIL 5C8-MS色谱柱，乙腈/四丁基硫酸氢钠(80:20)作为流动相；检测波长：205nm；流速：1.0mL/min；柱温：27℃。通过RP-HPLC检测分析，绘制GM1标准曲线，相同条件下分析水解溶液，可得水解溶液中剩余GM1的量，从而得到水解效率。
GM1标准品溶液的标准曲线如图1所示，其回归方程为y＝5842.7x-3.8918，R2＝0.9991。因此在0.05-0.35g/mL的浓度范围内，GM1的浓度与其峰面积呈良好的线性关系。GM1水解溶液经HPLC分析得到其峰面积约为904.802±0.960mAU，带入标准曲线方程并乘以稀释倍数可得水解液中GM1的浓度约为1.555±0.008g/mL，因此20mL水解液中GM1的的剩余量约为31.10±0.16mg。GM1的使用量为100mg，经计算可得GM1的水解率约为68.9±0.16％。
实施例2
本实施例制备一种具有神经组织修复活性的聚合物材料，用PLGA-LysoGM1进行表示(合成过程示意图如图2所示)，并对其进行红外光谱分析和核磁共振分析。其制备方法如下：
(1)称取实施例1中制备得到的水解产物LysoGM1 50mg，转移至10mL的无水DMF中溶解，再称量1g PLGA固体(数均分子量为8kDa，乳酸结构单元与羟基乙酸结构单元的摩尔比为75:25)，加入后充分搅拌使其完全溶解；
(2)称取10.6mg(羟基苯并三唑)HOBt加入到上述体系，并加入15.3μL三丁胺溶液，室温下剧烈搅拌反应2h，LysoGM1与HOBt、三丁胺、PLGA的摩尔比约为1:1.8:1.5:0.3；
(3)将反应液缓慢滴加到预冷的蒸馏水(温度为4℃)中，由于PLGA-LysoGM1不溶于水形成胶体状沉淀，用蒸馏水反复洗涤除去有机溶剂和多余LysoGM1和GM1；
(4)将得到的PLGA-LysoGM1固体冷冻干燥，置于干燥器中保存，用于后续实验。
对制得的干燥后的PLGA-LysoGM1和PLGA分别进行红外光谱分析，如图3所示：PLGA-LysoGM1的红外图谱中2995cm-1，2945cm-1处的吸收峰为甲基和亚甲基的不对称伸缩振动，1755cm-1处的强吸收峰属于PLGA中酯基基团。对比PLGA的红外图谱，PLGA-LysoGM1在1677cm-1处有一特异性吸收峰，该吸收峰是酰胺I带特征吸收峰，属于C＝O伸缩振动。由于PLGA与LysoGM1是游离羧基和氨基经酰胺缩合而成，因此红外图谱分析证实了PLGA-LysoGM1是通过酰胺基团链接，也证明该聚合物合成成功。
对制得的干燥后的PLGA-LysoGM1、PLGA和LysoGM1分别进行核磁共振氢谱和碳谱分析，将PLGA-LysoGM1、PLGA和LysoGM1分别用氘代氯仿溶解后，使用VARIAN核磁共振波谱仪对样品进行分析。图4为三者的核磁共振氢谱(1H NMR)，与PLGA相比PLGA-lysoGM1分别增加了四个吸收峰，分别为0.8ppm，1.2ppm，1.9ppm和7.9ppm。0.8ppm处的吸收峰表示饱和烃中甲基中的质子；1.2ppm表示饱和烃中亚甲基中的质子；1.9ppm处的吸收峰表示羰基区域中的相邻质子；7.9ppm处的吸收峰表示通过化学合成形成酰胺键的质子。图5为三者的核磁共振碳谱(13C NMR)，与PLGA的核磁共振碳谱(13C NMR)相比，PLGA-lysoGM1增加了5个吸收峰，例如a，f，b，d吸收峰，该吸收峰表明PLGA与含有甲基碳和多个亚甲基的侧链连接，1HNMR与13C NMR分析表明PLGA-lysoGM1合成成功。
实施例3
本实施例制备一种具有神经组织修复活性的工程支架，并对其进行扫描电镜观察。其制备方法如下：
(1)称500mg实施例2制得的PLGA-LysoGM1溶解在氯仿:DMF(85:15质量比)的混合溶液中，浓度为15wt％。在25℃下搅拌24h，使其成为均一的溶液，并使用超声振荡器除去溶液中气泡；
(2)将纺丝溶液吸入注射器，并置于在微量进样器上。将高压直流电源接于注射器针头上，注射器针头型号为22G，内径为0.41mm，将锡箔纸均匀覆盖在圆形滚筒接收器表面(直径15cm)，并将滚筒接收器接地；
(3)设定电压为15kV，进样器的流速为1mL/h，旋转滚筒接收器接收(转速为0r/min)，温度25℃，得到所述工程支架；
(4)将制备的纺丝工程支架放于真空干燥箱中干燥48h，彻底除去有机溶剂后密封保存。
对制得的工程支架进行扫描电镜的观察，如图6所示：PLGA-LysoGM1纤维形态饱满，没有发生纤维融并、粘连以及塌陷等情况，说明静电纺丝条件适宜，纺丝效果较好。
实施例4
本实施例评价实施例3制得的PLGA-LysoGM1静电纺丝工程支架材料对原代神经元的黏附、形态以及神经突起延伸的影响。实验设置对照组、PLGA组、PLGA+GM1组和PLGA-LysoGM1四组，其操作方法为：
(1)分别准备对照组(24孔板，无材料空白孔)、PLGA组(同实施例3静电纺丝步骤，以0r/min接收器转速制备的纯PLGA静电纺丝支架，PLGA同实施例2)、PLGA+GM1组(同实施例3静电纺丝步骤，PLGA与GM1以1:0.3的摩尔比进行物理混合制得电纺前驱液，以0r/min接收器转速制备混合静电纺丝支架，PLGA同实施例2，GM1同实施例1)和PLGA-LysoGM1组(通过实施例3静电纺丝步骤制备的PLGA-LysoGM1支架)四组支架材料；
(2)提取胎鼠大脑皮层原代神经元(使用大约E17-E18期间的胎鼠，水合氯醛麻醉后用灭菌的剪刀迅速暴露子宫，转移至无菌环境中取出胎鼠，迅速剪下胎鼠头部，转移至预冷PBS培养皿中；使用显微镊分离胎鼠头皮，暴露脑组织，并取出放于新的预冷PBS培养皿中；体视显微镜下，将脑组织两个半球分开，使用显微镊除去脑半球基底节部分，分离脑皮层组织表面毛细血管膜；将分离的脑组织用剪刀剪碎后转移到离心管中，加入胰蛋白酶溶液，在37℃下孵育15min；随后加入8-10mL消化终止液，振摇之后静置2min使细胞沉降至管底，小心吸取上层大部分清液，重复3次；加入新鲜消化终止液，轻轻吹打组织团块，使细胞分散；将吹打后的液体过70目细胞筛，转移到新的离心管中；1000g离心5min，并加入10mL新鲜终止液重悬细胞；5％CO2、37℃、100％湿度培养箱中培养，待神经元贴壁后，吸出培养基并加入新鲜NF培养液；每3天半量换液并用于后续实验)；
(3)将步骤(2)中提取、培养的神经元细胞消化，使用细胞计数板计数，吸取适量细胞液加入到事先放入24孔板中的支架材料上，每孔约加入2×105个细胞，5％CO2、37℃、100％湿度培养箱中培养3天、6天后进行测定。使用CCK-8(Cell Counting Kit 8)试剂盒检测(培养3天、6天后弃去原培养液，每孔加入含10％CCK-8溶液的新鲜培养基，5％CO2、37℃、100％湿度培养箱培养4h后用酶联免疫检测仪检测450nm波长处吸光度OD值)。
结果如图7所示，本发明所涉及的工程支架具有良好的生物相容性。相比而言，对照组、PLGA、PLGA+GM1各组之间无显著性差异，而PLGA-LysoGM1组具有最高的细胞活力。共培养3、6天，PLGA-LysoGM1组的CCK-8吸光度均显著高于其他各组。虽然临床和近期研究已证实GM1可以加速受损神经细胞的修复，促进神经细胞的生长和再生，但由于细胞培养与CCK-8测定过程中需要多次换液，GM1易溶于水随着换液而流失，因此PLGA+GM1混合支架难以实现GM1浓度的局部有效维持。而本发明的由PLGA-LysoGM1材料制备得到的支架可有效实现LysoGM1的负载，并发挥其生物学功能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的具有神经组织修复活性的聚合物材料及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (34)

1.一种具有神经组织修复活性的聚合物材料，其特征在于，所述聚合物材料是由单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物通过酰胺键连接得到的；所述单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003171470460000011
2.如权利要求1所述的聚合物材料，其特征在于，所述聚合物材料是由单唾液酸四己糖神经节苷脂水解产物的游离氨基端与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的末端羧基通过酰胺键连接得到的。
3.如权利要求1所述的聚合物材料，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量为6.6-10.7kDa。
4.如权利要求1所述的聚合物材料，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸结构单元与羟基乙酸结构单元的摩尔比为(70-80):(20-30)。
5.如权利要求1所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将式(Ⅰ)所示的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物进行酰胺缩合反应，即得所述具有神经组织修复活性的聚合物材料。
6.如权利要求5所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述水解产物的制备方法包括：将溶于缓冲溶液的单唾液酸四己糖神经节苷脂与鞘糖脂N-去酰基化酶混合，进行反应，离心，将上清液冷冻干燥，得到所述水解产物。
7.如权利要求6所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液包括浓度为30-40mM的醋酸钠、质量百分含量为0.3-0.5％的牛磺脱氧胆酸水合物和浓度为90-110mM的氯化钙。
8.如权利要求6所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH值为5.5-6.0。
9.如权利要求6所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH值用冰醋酸进行调节。
10.如权利要求6所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为30-40℃。
11.如权利要求6所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为10-15h。
12.如权利要求6所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为10000-14000r/min。
13.如权利要求6所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述离心的时间为3-6min。
14.如权利要求5所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述将式(Ⅰ)所示的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物进行酰胺缩合反应的方法包括如下步骤：
(1)将式(Ⅰ)所示的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂，并加入三丁胺和羟基苯并三唑，进行反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)得到的反应液加入预冷蒸馏水，形成胶体状沉淀即所述具有神经组织修复活性的聚合物材料。
15.如权利要求14所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺。
16.如权利要求14所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的摩尔比为1:(0.2-0.4)。
17.如权利要求14所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述所述水解产物与羟基苯并三唑的摩尔比为1:(1.6-2.0)。
18.如权利要求14所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述所述水解产物与三丁胺的摩尔比为1:(1.2-1.8)。
19.如权利要求14所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述反应的温度为20-30℃。
20.如权利要求14所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述反应的时间为1-3h。
21.如权利要求14所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述预冷蒸馏水的温度为2-8℃。
22.如权利要求14所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述形成胶体状沉淀后进行过滤、洗涤和干燥。
23.一种具有神经组织修复活性的工程支架，其特征在于，所述工程支架是由如权利要求1所述的具有神经组织修复活性的聚合物材料经静电纺丝制备得到的。
24.如权利要求23所述的工程支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将聚合物材料溶解于有机溶剂后进行静电纺丝，得到所述具有神经组织修复活性的工程支架。
25.如权利要求24所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为氯仿与N,N-二甲基甲酰胺以17:3的质量比混合得到的溶液。
26.如权利要求24所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述聚合物材料在有机溶剂中的浓度为10-20wt％。
27.如权利要求24所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述溶解后进行搅拌并使用超声振荡器除去溶液中的气泡。
28.如权利要求24所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的电压为15-20kV。
29.如权利要求24所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的温度为20-30℃。
30.如权利要求24所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的进样器流速为1-2mL/h。
31.如权利要求24所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的接收装置为直径为10-20cm的圆形滚筒，转速为0-1600rpm。
32.如权利要求24所述的聚合物材料的制备方法，其特征在于，所述得到具有神经组织修复活性的工程支架后对其进行真空干燥24-48h。
33.如权利要求24所述的工程支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)将溶于缓冲溶液的单唾液酸四己糖神经节苷脂与鞘糖脂N-去酰基化酶混合，在30-40℃下进行反应10-15h，离心，将上清液冷冻干燥，得到式(Ⅰ)所示的水解产物；
(2)将步骤(1)得到的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于N,N-二甲基甲酰胺，并加入三丁胺和羟基苯并三唑，在20-30℃下进行反应1-3h，得到反应液；
(3)将步骤(2)得到的反应液加入预冷蒸馏水，形成胶体状沉淀即具有神经组织修复活性的聚合物材料，进行过滤、洗涤和干燥；
(4)将步骤(3)得到的聚合物材料溶解于氯仿与N,N-二甲基甲酰胺以17:3的质量比混合得到的溶液中，进行静电纺丝，真空干燥24-48h，得到所述具有神经组织修复活性的工程支架。
34.如权利要求1所述的具有神经组织修复活性的聚合物材料或如权利要求23所述的具有神经组织修复活性的工程支架在制备创伤性脑损伤后组织修复药物中的应用。
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