CN106589412B - 一种基于微流控技术的聚合物微凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微流控技术的聚合物微凝胶的制备方法，该方法步骤如下：a.将呋喃根和酪胺根改性的明胶分散在辣根过氧化氢酶的磷酸盐缓冲液中，为分散相1；b.将PEG修饰剂分散在双氧水磷酸盐缓冲溶液中，为分散相2；c.将Pico‑Surf™2的氟化油溶液稀释，为连续相；d.将连续相、分散相1和分散相2分别注入微流控芯片中，在微通道中形成W/O单乳液滴；e.将W/O单乳液滴收集到含Pico‑Surf™2的氟化油中，在室温下放置；f.过滤收集液，再用磷酸盐缓冲液充分洗涤固化的明胶微凝胶粒子，转移至磷酸盐缓冲液中，得聚合物微凝胶。本发明制备的微凝胶，粒径在300微米以下，粒径分布均较窄，力学强度可调。

Description

一种基于微流控技术的聚合物微凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及微凝胶的制备领域，具体涉及一种基于微流控技术的聚合物微凝胶的制备方法。
背景技术
聚合物微凝胶是微米尺度、具有三维空间网络结构的凝胶颗粒，通常情况下，因处于合适的溶剂中而呈现一种溶胀的状态，具有良好的生物相容性。微凝胶因其尺寸可以控制在几十到几百微米之间，允许实现氧气、营养、和代谢产物的快速交换，因此，利用微凝胶材料作为细胞培养的载体，有利于更加精准的细胞学研究【Zhang, W. J.; He, X. M.Microencapsulating and Banking Living Cells for Cell-Based Medicine. Journalof Healthcare Engineering 2011, 2, 427-446.】。
对于细胞的培养研究而言，传统的二维平板培养细胞的方法不能真实的反映与模拟细胞生存的真实环境，因此对于其细胞学的研究是不够准确与真实的；微凝胶材料由其独特的特点成为适宜的细胞载体，传统制备微凝胶的方法主要有喷雾干燥法、反相乳液技术、凝聚法、以及剪切破裂法等，然而通过这些常规的方法来制备微凝胶，其尺寸均一性较难控制，并且试剂消耗量高。利用微流控技术制备的微凝胶，其尺寸可以控制在微米尺度，可以实现氧气、营养、生长因子和代谢废物等的快速输送；其粒径均一，单分散性好，该方法稳定、可重现、可以在单位时间内产生大量的细胞包载的微凝胶【Velasco, D.; Tumarkin,E.; Kumacheva, E. Microfluidic Encapsulation of Cells in Polymer Microgels.Small 2012, 8 (11), 1633-1642.】。
微流控技术制备聚合物微凝胶的材料也有很多，主要包括天然高分子和合成高分子两种，其大多数材料均会使用到光交联反应、迈克尔加成反应和PH响应等的方法来实现微凝胶的制备，而这些反应都会对细胞的活性和特性产生不利的影响，其制备过程将对细胞产生不可逆的损伤【Gasperini, L.; Mano, J. F.; Reis, R. L. Natural polymersfor the microencapsulation of cells. J. R. Soc. Interface 2014, 11 (100),20140817.】。因此，在温和条件下实现微凝胶的制备显得尤为重要。
明胶是动物皮肤、骨、肌膜等结缔组织中的胶原的衍生物，具有良好的生物相容性和生物降解性；而通过呋喃根和盐酸酪胺改性的明胶，可以在温和条件下，既可以在辣根过氧化氢酶和双氧水的作用下，发生酶交联反应，又可以与MAL-PEG-MAL发生Diels-Alder（DA）点击化学反应，将这两种反应相结合；可以得到一种双交联网络的水凝胶，使凝胶既具有韧性又具有一定的强度。
发明目的
为了克服现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于微流控技术的聚合物微凝胶的制备方法，该方法利用微流控技术，在温和条件下制备粒径均一、尺寸可控、力学强度不同的Gelatin微凝胶，旨在解决传统微凝胶制备方法中粒径不均一、制备过程细胞有害等难题。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种基于微流控技术的聚合物微凝胶的制备方法，包括以下步骤：
a.将呋喃根和酪胺根改性的明胶（Gelatin/TA-furan）分散在辣根过氧化氢酶（HRP）的磷酸盐缓冲液中，作为分散相1；
b.将PEG修饰剂分散在双氧水的磷酸盐缓冲溶液中，作为分散相2；
c.将Pico-Surf™ 2的氟化油溶液稀释，作为连续相；
d.将连续相、分散相1和分散相2分别注入微流控芯片中，通过调控连续相与分散相的流速比，在微通道中形成油包水（W/O）单乳液滴；
e.将制备好的油包水（W/O）单乳液滴收集到含Pico-Surf™ 2的氟化油中，在室温下放置一段时间后，得到明胶微凝胶粒子；
f.过滤收集液，再用磷酸盐缓冲液充分洗涤固化的明胶微凝胶粒子，转移至磷酸盐缓冲液中，得聚合物微凝胶。
优选的，步骤a中，所述呋喃根和酪胺根改性的明胶的制备方法如下：将1g~3g明胶溶于乙磺酸溶液中，搅拌加热，待明胶溶解后，冷却至室温，加入EDC[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐]0.5g~1.5g，NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）0.3g~0.9g,呋喃甲酸0.14g~0.42g，反应12~36h，再加入EDC1.1g~5.5g，NHS0.35g~1.65g,加入TA0.5g~1.5g,反应12~36h,转移至透析袋中透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的呋喃根和酪胺根改性的明胶。
优选的，步骤a中，所述呋喃根和酪胺根改性的明胶在分散相1中的浓度为15mg/ml~65mg/ml。
优选的，步骤a中，所述辣根过氧化氢酶的含量为160units/mg~480units/mg，辣根过氧化氢酶在辣根过氧化氢酶的磷酸盐缓冲液中的浓度为10units/ml~50units/ml。
优选的，步骤b中，所述PEG修饰剂为MAL-PEG-MAL。
优选的，步骤b中，所述PEG修饰剂的分子量为Mw=2~20kDa，PEG修饰剂在分散相2中的浓度为30 mg/ml~130mg/ml。
优选的，步骤b中，H2O2在双氧水磷酸盐缓冲溶液中的浓度为2.5mmol/L ~12.5mmol/L。
优选的，步骤c中，所述Pico-Surf™ 2的氟化油溶液为Pico-Surf™ 2的氟化油HFE-7500溶液。
优选的，步骤c中，所述的连续相中Pico-Surf™ 2的浓度为0.5wt%~4.5wt%。
优选的，步骤d中，连续相与分散相1、分散相2的流速比为50:1:1~200:1:1。
优选的，步骤e中，所述含Pico-Surf™ 2的氟化油中Pico-Surf™ 2的浓度为0.5wt%~2.5wt%；所述放置的时间为12h~36h。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明使用了微流控技术，在温和的条件下，成功制备出粒径均一、具有不同力学强度的Gelatin微凝胶，并实现了对其尺寸和力学强度的控制。本方法是通过酶交联反应和DA点击化学反应的结合实现凝胶的交联过程，两种反应在温和条件下即可发生，不用借助紫外光和PH等的变化，反应条件温和，有助于用于细胞的培养中。
附图说明
图1为实施例1的微流控装置的示意图。
图2为实施例1制备的Gelatin微凝胶的光学图。
图3为实施例1制备的Gelatin微凝胶的粒径分布图。
图4为实施例2制备的Gelatin微凝胶的光学图。
图5为实施例3制备的Gelatin微凝胶的光学图。
图6为实施例4制备的Gelatin微凝胶的光学图。
图7为实施例5，实施例6，实施例7，实施例8制备的Gelatin凝胶的流变学表征图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
称取2g明胶溶于300ml50Mmol的乙磺酸溶液中，搅拌加热至60℃，待其溶解后，冷却至室温，加入EDC1g，NHS0.6g,呋喃甲酸0.28g，反应24h，再加入EDC3.3g，NHS1g，加入TA(盐酸酪胺)1g。反应24h，转移至透析袋（透析袋截留分子量为14000）透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的Gelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）。
称取2mgHRP(160units/mg)（辣根过氧化氢酶）溶于16mlPBS（磷酸盐缓冲液）中，得到HRP（20units/ml）溶液，再称取30mgGelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）溶于1mlHRP溶液中，在500rpm转速搅拌过夜，得到分散相1；取30wt%的H2O2溶液0.5ml用PBS稀释至1L溶液，得到5mmol/L的H2O2溶液，再称取60mgMAL-PEG-MAL（2kDa）（马来酰亚胺修饰的聚乙二醇）溶于1ml5mmol/L的H2O2溶液中，溶解后得到分散相2；将5 wt% Pico-Surf™ 2的氟化油HFE-7500溶液加氟化油稀释至浓度为0.5wt%，作为连续相。将各相引入到微流控芯片中，其中，两分散相的流速均为0.05ml/h；连续相的流速为3ml/h，即流速比为60：1：1时剪切形成油包水的单乳液滴。将制备好的液滴收集在0.5wt% Pico-Surf™ 2的氟化油溶液中，在室温下放置24h,得到Gelatin微凝胶。过滤收集液，用PBS洗涤5次，转移到PBS中保存，得到聚合物微凝胶。
本实施例的微流控装置图如图1所示；本实施例制备的Gelatin微凝胶的光学图如图2所示；本实施例制备的Gelatin微凝胶的粒径分布图如图3所示。可以看到聚合物微凝胶的粒径分布较窄，平均粒径为258μm。
实施例2
3g明胶溶于300ml50Mmol的乙磺酸溶液中，搅拌加热至60℃，待其溶解后，冷却至室温，加入EDC1.5g，NHS0.9g，呋喃甲酸0.42g，反应36h，再加入EDC1.1g，NHS0.35g，加入TA(盐酸酪胺)0.5g，反应12h，转移至透析袋（透析袋截留分子量为14000）透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的Gelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）。
称取1mgHRP(160units/mg)（辣根过氧化氢酶）溶于16mlPBS（磷酸盐缓冲液）中，得到HRP（10units/ml）溶液，再称取15mgGelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）溶于1mlHRP溶液中，在500rpm转速搅拌过夜，得到分散相1；取30wt%的H2O2溶液0.25ml用PBS稀释至1L溶液，得到2.5mmol/L的H2O2溶液，再称取30mgMAL-PEG-MAL（2kDa）（马来酰亚胺修饰的聚乙二醇）溶于1ml2.5mmol/L的H2O2溶液中，溶解后得到分散相2；将5 wt% Pico-Surf™2的氟化油HFE-7500溶液加氟化油稀释至浓度为0.5wt%，作为连续相。将各相引入到微流控芯片中，其中，两分散相的流速均为0.02ml/h；连续相的流速为1ml/h，即流速比为50：1：1时剪切形成油包水的单乳液滴。将制备好的液滴收集在0.5wt% Pico-Surf™ 2的氟化油溶液中，在室温下放置12h,得到Gelatin微凝胶。过滤收集液，用PBS洗涤5次，转移到PBS中保存，得到聚合物微凝胶。
本实施例制备的Gelatin微凝胶的光学图如图4所示。
实施例3
称取2g明胶溶于300ml50Mmol的乙磺酸溶液中，搅拌加热至60℃，待其溶解后，冷却至室温，加入EDC1g，NHS0.6g，呋喃甲酸0.28g，反应24h，再加入EDC3.3g，NHS1g，加入TA(盐酸酪胺)1g，反应24h，转移至透析袋（透析袋截留分子量为14000）透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的Gelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）。
称取1.5mgHRP(320units/mg)（辣根过氧化氢酶）溶于16mlPBS（磷酸盐缓冲液）中，得到HRP（30units/ml）溶液，再称取40mgGelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）溶于1mlHRP溶液中，在500rpm转速搅拌过夜，得到分散相1；取30wt%的H2O2溶液0.75ml用PBS稀释至1L溶液，得到7.5mmol/L的H2O2溶液，再称取80mgMAL-PEG-MAL（10kDa）（马来酰亚胺修饰的聚乙二醇）溶于1ml7.5mmol/L的H2O2溶液中，溶解后得到分散相2；将5 wt% Pico-Surf™ 2的氟化油HFE-7500溶液加氟化油稀释至浓度为2.5wt%，作为连续相。将各相引入到微流控芯片中，其中，两分散相的流速均为0.04ml/h；连续相的流速为5ml/h，即流速比为125：1：1时剪切形成油包水的单乳液滴。将制备好的液滴收集在1.5wt% Pico-Surf™ 2的氟化油溶液中，在室温下放置24h,得到Gelatin微凝胶。过滤收集液，用PBS洗涤5次，转移到PBS中保存，得到聚合物微凝胶。
本实施例制备的Gelatin微凝胶的光学图如图5所示。
实施例4
将1g明胶溶于300ml50Mmol的乙磺酸溶液中，搅拌加热至60℃，待其溶解后，冷却至室温，加入EDC0.5g，NHS0.3g，呋喃甲酸0.14g，反应12h，再加入EDC5.5g，NHS1.65g，加入TA(盐酸酪胺)1.5g，反应36h，转移至透析袋（透析袋截留分子量为14000）透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的Gelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）。
称取2.5mgHRP(320units/mg)（辣根过氧化氢酶）溶于16mlPBS（磷酸盐缓冲液）中，得到HRP（50units/ml）溶液，再称取65mgGelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）溶于1mlHRP溶液中，在500rpm转速搅拌过夜，得到分散相1；取30wt%的H2O2溶液1.25ml用PBS稀释至1L溶液，得到12.5mmol/L的H2O2溶液，再称取130mgMAL-PEG-MAL（20kDa）（马来酰亚胺修饰的聚乙二醇）溶于1ml12.5mmol/L的H2O2溶液中，溶解后得到分散相2；将5 wt% Pico-Surf™ 2的氟化油HFE-7500溶液加氟化油稀释至浓度为4.5wt%，作为连续相。将各相引入到微流控芯片中，其中，两分散相的流速均为0.02ml/h；连续相的流速为4ml/h，即流速比为200：1：1时剪切形成油包水的单乳液滴。将制备好的液滴收集在2.5wt% Pico-Surf™ 2的氟化油溶液中，在室温下放置36h,得到Gelatin微凝胶。过滤收集液，用PBS洗涤5次，转移到PBS中保存，得到聚合物微凝胶。
本实施例制备的Gelatin微凝胶的光学图如图6所示。
实施例5
称取2g明胶溶于300ml50Mmol的乙磺酸溶液中，搅拌加热至60℃，待其溶解后，冷却至室温，加入EDC1g，NHS0.6g，呋喃甲酸0.28g，反应24h，再加入EDC3.3g，NHS1g，加入TA(盐酸酪胺)1g。反应24h，转移至透析袋（透析袋截留分子量为14000）透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的Gelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）。
称取2mgHRP(160units/mg)（辣根过氧化氢酶）溶于16mlPBS（磷酸盐缓冲液）中，得到HRP（20units/ml）溶液，再称取90mgGelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）溶于3mlHRP溶液中，在500rpm转速搅拌过夜，得到分散相1；取30wt%的H2O2溶液0.5ml用PBS稀释至1L溶液，得到5mmol/L的H2O2溶液，再称取180mgMAL-PEG-MAL（2kDa）（马来酰亚胺修饰的聚乙二醇）溶于3ml5mmol/L的H2O2溶液中，溶解后得到分散相2；将前述两种分散相混合均匀，倒入模具（h=1mm，d=40mm）中，室温放置24h，得到Gelatin水凝胶样品。
实施例6
称取3g明胶溶于300ml50Mmol的乙磺酸溶液中，搅拌加热至60℃，待其溶解后，冷却至室温，加入EDC1.5g，NHS0.9g，呋喃甲酸0.42g，反应36h，再加入EDC1.1g，NHS0.35g，加入TA(盐酸酪胺)0.5g，反应12h，转移至透析袋（透析袋截留分子量为14000）透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的Gelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）。
称取1mgHRP(160units/mg)（辣根过氧化氢酶）溶于16mlPBS（磷酸盐缓冲液）中，得到HRP（10units/ml）溶液，再称取45mgGelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）溶于3mlHRP溶液中，在500rpm转速搅拌过夜，得到分散相1；取30wt%的H2O2溶液0.25ml用PBS稀释至1L溶液，得到2.5mmol/L的H2O2溶液，再称取135mgMAL-PEG-MAL（2kDa）（马来酰亚胺修饰的聚乙二醇）溶于3ml2.5mmol/L的H2O2溶液中，溶解后得到分散相2；将前述两种分散相混合均匀，倒入模具（h=1mm，d=40mm）中，室温放置12h，得到Gelatin水凝胶样品。
实施例7
称取2g明胶溶于300ml50Mmol的乙磺酸溶液中，搅拌加热至60℃，待其溶解后，冷却至室温，加入EDC1g，NHS0.6g，呋喃甲酸0.28g，反应24h，再加入EDC3.3g，NHS1g，加入TA(盐酸酪胺)1g，反应24h，转移至透析袋（透析袋截留分子量为14000）透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的Gelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）。
称取1.5mgHRP(320units/mg)（辣根过氧化氢酶）溶于16mlPBS（磷酸盐缓冲液）中，得到HRP（30units/ml）溶液，再称取120mgGelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）溶于3mlHRP溶液中，在500rpm转速搅拌过夜，得到分散相1；取30wt%的H2O2溶液0.75ml用PBS稀释至1L溶液，得到7.5mmol/L的H2O2溶液，再称取240mgMAL-PEG-MAL（10kDa）（马来酰亚胺修饰的聚乙二醇）溶于3ml7.5mmol/L的H2O2溶液中，溶解后得到分散相2；将前述两种分散相混合均匀，倒入模具（h=1mm，d=40mm）中，室温放置24h，得到Gelatin水凝胶样品。
实施例8
称取1g明胶溶于300ml50Mmol的乙磺酸溶液中，搅拌加热至60℃，待其溶解后，冷却至室温，加入EDC0.5g，NHS0.3g，呋喃甲酸0.14g，反应12h，再加入EDC5.5g，NHS1.65g，加入TA(盐酸酪胺)1.5g，反应36h，转移至透析袋（透析袋截留分子量为14000）透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的Gelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）。
称取2.5mgHRP(320units/mg)（辣根过氧化氢酶）溶于16mlPBS（磷酸盐缓冲液）中，得到HRP（50units/ml）溶液，再称取195mgGelatin/TA-furan（呋喃根和酪胺根改性的明胶）溶于3mlHRP溶液中，在500rpm转速搅拌过夜，得到分散相1；取30wt%的H2O2溶液1.25ml用PBS稀释至1L溶液，得到12.5mmol/L的H2O2溶液，再称取390mgMAL-PEG-MAL（20kDa）（马来酰亚胺修饰的聚乙二醇）溶于3ml12.5mmol/L的H2O2溶液中，溶解后得到分散相2；将前述两种分散相混合均匀，倒入模具（h=1mm，d=40mm）中，室温放置36h，得到Gelatin水凝胶样品。
实施例5，实施例6，实施例7，实施例8制备的Gelatin凝胶的流变学表征如图7所示。从图中我们可以得到，明胶水凝胶的储能模量随着明胶浓度的增加从0.16kPa增至4.31kPa，并且实施例5-8中制备的水凝胶的组分和交联方式与本发明的微凝胶一致，因此它们具有相当的储能模量。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于微流控技术的聚合物微凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将呋喃根和酪胺根改性的明胶分散在辣根过氧化氢酶的磷酸盐缓冲液中，作为分散相1；
b.将PEG修饰剂分散在双氧水的磷酸盐缓冲溶液中，作为分散相2；所述PEG修饰剂为MAL-PEG-MAL；
c.将Pico-Surf™ 2的氟化油溶液用氟化油稀释，作为连续相；
d.将连续相、分散相1和分散相2分别注入微流控芯片中，通过调控连续相与分散相的流速比，在微通道中形成油包水单乳液滴；
e.将制备好的油包水单乳液滴收集到含Pico-Surf™ 2的氟化油中，在室温下放置后，得到明胶微凝胶粒子；
f.过滤收集液，再用磷酸盐缓冲液充分洗涤固化的明胶微凝胶粒子，转移至磷酸盐缓冲液中，得聚合物微凝胶；
步骤a中，所述呋喃根和酪胺根改性的明胶的制备方法如下：将1g~3g明胶溶于乙磺酸溶液中，搅拌加热，待明胶溶解后，冷却至室温，加入EDC0.5g~1.5g，NHS0.3g~0.9g,呋喃甲酸0.14g~0.42g，反应12~36h，再加入EDC1.1g~5.5g，NHS0.35g~1.65g,加入TA0.5g~1.5g,反应12~36h,转移至透析袋中透析，透析后液体通过冷冻干燥，得到干燥的呋喃根和酪胺根改性的明胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述呋喃根和酪胺根改性的明胶在分散相1中的浓度为15mg/ml~65mg/ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述辣根过氧化氢酶的含量为160units/mg~480units/mg，辣根过氧化氢酶在辣根过氧化氢酶的磷酸盐缓冲液中的浓度为10units/ml~50units/ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述PEG修饰剂的分子量为Mw=2~20kDa，PEG修饰剂在分散相2中的浓度为30 mg/ml~130mg/ml。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b中，H2O2在双氧水磷酸盐缓冲溶液中的浓度为2.5mmol/L ~12.5mmol/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c中，所述的连续相中Pico-Surf™ 2的浓度为0.5wt%~4.5wt%。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d中，连续相与分散相1、分散相2的流速比为50:1:1~200:1:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤e中，所述含Pico-Surf™ 2的氟化油中Pico-Surf™ 2的浓度为0.5wt%~2.5wt%；所述放置的时间为12h~36h。
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