CN115068336A - 一种基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，该工艺通过第一毛细管穿过T型三通，第一毛细管一端连接注射器用于输送分散相；连续相第二毛细管经T型三通上方注入，从第三毛细管流出；第一、第三毛细管共同形成共轴流液滴生成结构，生成的液滴通入CaCl2溶液中；包裹有菌体的海藻酸钠微液滴通入不断搅拌中的CaCl2溶液中形成海藻酸钙微胶囊。本发明通过控制微通道结构和连续相、分散相两相流速来控制液滴的生成，分散相在两相交界处通过界面张力和剪切力的作用生成液滴，以微液滴的形式分散于连续相中，生成的液滴通过毛细管通入CaCl2溶液中，形成微胶囊。微胶囊粒径可控、均一度好，而且结构稳定，形态良好。
Description
技术领域
本发明涉及肠道菌群处理的领域，特别涉及一种基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺。
背景技术
在2013年时，菌群移植(FMT)技术就被列入美国临床医学指南以用于治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌感染(CDI)。近年来，随着利用菌群移植治疗菌群失调引起的相关性疾病的临床证据不断增加，这种治疗方式已经成为全球临床医学、微生物学和转化医学的研究热点。
目前临床上常用的菌群移植方式有口服胶囊和菌液(上消化道-鼻肠管,下消化道-结肠镜，灌肠)两种。对于患者而言，相较于需要侵入式置管的菌液，简单便捷舒适度更高的口服胶囊无疑更容易被接受。
然而，不同于置管侵入直达肠道的菌液，口服胶囊会通过消化道，先经过胃部再到达肠道。在口服胶囊停留在胃部的过程中，胃液会对胶囊外壳造成腐蚀，使得胶囊外壳破损，菌群暴露在胃液中，这将导致大量菌群失活，极大程度的影响口服胶囊的治疗效果。
将菌群进行包埋就是该难题的解决方案之一。目前最常用的包埋壁材为海藻酸钠和氯化钙——利用海藻酸钠和氯化钙接触反应生成海藻酸钙包覆菌体形成包埋体。如专利申请202110489741.0公开的具备改善肠道功能的包埋益生菌微囊的制备方法，第一步称取海藻酸钠放入水中同时加入益生菌菌体得到凝胶液，第二步在凝胶液加入橄榄油与白醋后形成胶体液，第三步在胶体液内加入的葡萄糖酸钙溶液制成微囊，第四步将微囊置于真空冷冻干燥机中形成冻干微囊，第五步将步骤四中等到的冻干微粉包装成药剂。该具备改善肠道功能的包埋益生菌微囊的制备方法，选取的原料是海藻酸钠绿色纯天然没有副作用，将益生菌更好的在肠道释放，微囊可以抵抗胃酸和胆盐的侵蚀，并在肠道中释放，有调节肠道菌群的结构，改善肠道的微环境，从而改善了人体肠道功能，达到润肠通便的效果。
现有的利用海藻酸钠壁材进行包埋的工艺现有喷雾干燥法、内源乳化法、外源乳化法等。然而这些工艺都存在有明显的缺陷，它们包埋形成的微球粒径分布广，大小不均一，亦或是包埋工艺会对菌群活性造成影响等。
发明内容
为解决上述问题，本发明的首要目的是提供一种基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，该工艺利用液滴微流控技术可以批量制备粒径可控、均一度好、结构稳定的微液滴，克服现有海藻酸钠包埋的缺陷。
发明人研究发现：液滴微流控是最近兴起的一种利用互不相溶的两相液体产生分散的微液滴进行实验操作的非连续流微流控技术。该技术通过控制微通道结构和两相流速来控制液滴的生成。在固定体积流率的驱动泵的推动下，连续相和分散相分别进入不同的微通道，当两相流体在交界点处相遇后，分散相在界面张力和剪切力的作用下生成液滴，以微液滴的形式分散于连续相中。
由此，利用液滴微流控技术可以批量制备粒径可控、均一度好、结构稳定的微液滴。这些液滴所具有的性质与微胶囊的要求相近，因此，可以利用液滴微流控技术进行菌群包埋。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，该工艺通过第一毛细管穿过T型三通，第一毛细管一端连接注射器用于输送分散相，第一毛细管另一端插入第三毛细管内；连续相第二毛细管经T型三通上方注入，从第三毛细管流出；第一、第三毛细管共同形成共轴流液滴生成结构，生成的液滴通入CaCl2溶液中；包裹有菌体的海藻酸钠微液滴通入不断搅拌中的CaCl2溶液中形成海藻酸钙微胶囊；
其中，连续相为玉米油；分散相包含有肠道菌群液、保护剂和海藻酸钠溶液，连续相流速和分散相流速按照6：1的比例进行控制。
本发明控制微通道结构和连续相、分散相两相流速来控制液滴的生成，在T型三通下，连续相和分散相分别进入不同的微通道，当两相流体在交界点处相遇后，分散相在界面张力和剪切力的作用下生成液滴，以微液滴的形式分散于连续相中，生成的液滴通过毛细管通入CaCl2溶液中，形成微胶囊。这些液滴是在剪切力和界面张力作用下形成的，通过精准控制两相流速，生成的液滴粒径可控、均一度好，而且结构稳定。
进一步，连续相中，还含有2wt.％卵磷脂，卵磷脂作为乳化剂。
进一步，分散相中，肠道菌群液为5*1010cfu/mL的菌悬液，保护剂为5％的蔗糖，海藻酸钠溶液为2-2.5wt.％，其中，菌悬液：海藻酸钠溶液＝1:2。
进一步，CaCl2溶液通过烧杯置于磁力搅拌器上，以200rpm的速度不断搅拌。
更进一步，连续相和分散相均使用5mL注射器、精密注射泵输送，连续相流速Qc为18μL/min，分散相流速Qd为3μL/min。
进一步，在海藻酸钠微液滴全部通入CaCl2溶液中形成微胶囊后再搅拌半小时对微胶囊进行固化。
更进一步，固化后的微胶囊用300目的滤网过滤出微胶囊，并用1％的吐温80溶液洗涤去除油相，即可得到海藻酸钠包埋的肠道菌群微胶囊。
所述第一毛细管，内径100μm，外径360μm。
所述第二毛细管，内径100μm，外径360μm。
所述第三毛细管，内径500μm，外径690μm。
第一毛细管和第二毛细管保持一致，以便于控制连续相和分散相的流速。
本发明通过控制微通道结构和连续相、分散相两相流速来控制液滴的生成，分散相在两相交界处通过界面张力和剪切力的作用生成液滴，以微液滴的形式分散于连续相中，生成的液滴通过毛细管通入CaCl2溶液中，形成微胶囊。微胶囊粒径可控、均一度好，而且结构稳定，形态良好。
且该方法包埋率高，对菌体活性无明显影响。
附图说明
图1为本发明的包埋仪器示意图。
图2为本发明的微胶囊光学显微镜图。
图3为本发明的微胶囊粒径分布图。
图4为本发明的单菌微胶囊死活染色荧光图。
图5为本发明的粪菌微胶囊死活染色荧光图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1所示，本发明所使用的包埋仪器。图中所示，内径100μm，外径360μm的第一毛细管1穿过T型三通2，第一毛细管1一端连接注射器用于输送分散相，第一毛细管1另一端插入内径500μm，外径690μm的第三毛细管4内；连续相经第二毛细管3、T型三通2上方注入，从内径500μm的第三毛细管4流出；两根毛细管1、4共同形成共轴流液滴5生成结构。生成的液滴5通入装有CaCl2溶液的烧杯6中。装有CaCl2溶液的烧杯6置于磁力搅拌器8上，以200rpm的速度不断搅拌，生成凝胶化的液滴7，这些凝胶化的液滴7海藻酸钙微胶囊。
包埋过程：
配置好的连续相和分散相均使用5mL注射器、精密注射泵输送，其中，连续相流速Qc为18μL/min，分散相流速Qd为3μL/min。包裹有菌体的海藻酸钠微液滴通入不断搅拌中的CaCl2溶液中形成海藻酸钙微胶囊。在海藻酸钠微液滴全部通入CaCl2溶液中形成微胶囊后再搅拌半小时对微胶囊进行固化。然后，用300目的滤网过滤出微胶囊，并用1％的吐温80溶液洗涤去除油相，收集微胶囊并置于4℃恒温保藏。
实验流程：
实验目的：
利用液滴微流控技术结合海藻酸钠包埋肠道菌群。
实验材料：
LIVE/DEADTM BacLightTM Bacterial Viability Kit死活荧光染料、玉米油；卵磷脂；海藻酸钠；氯化钙；超纯水、柠檬酸钠。
实验仪器：
Harvard Pump 11Pico Plus Elite注射泵(Harvard Apparatus，Holliston，USA)、磁力搅拌器、粪便分析前处理仪及其耗材。
实验耗材：
弹性石英毛细管(100μm i.d.，360μm o.d.；500μm i.d.，690μm o.d.，永年锐沣色谱器件有限公司，中国河北)；T型三通多端口连接器(IDEX Health&Science，USA)；5mL注射器。
成分配置：
粪菌菌悬液：经粪便分析前处理仪处理提取的菌悬液。
单菌菌悬液：海氏肠球菌TG-056。
分散相：菌液+保护剂+2.5wt.％海藻酸钠的混合溶液(其中，菌液为5*1010的菌悬液，保护剂为5％的蔗糖，菌液：2.5wt.％海藻酸钠溶液＝1:2)。
连续相：2wt.％卵磷脂的玉米油，卵磷脂作为乳化剂。
解囊液：0.2M柠檬酸钠溶液。
氯化钙溶液：1％CaCl2溶液。
实验结果：
单菌包埋：
1.液滴微流控法微胶囊粒径分布。
通过光学显微镜镜检观测，液滴微流控法包埋的微胶囊外观形态良好，球形度高(图2所示)，不会出现畸形微胶囊。且微胶囊粒径分布均一性好，粒径集中在99±1μm范围内，如图3所示。
2.液滴微流控法对包埋活性的影响。
利用LIVE/DEADTM BacLightTM Bacterial Viability Kit死活荧光染料对微胶囊进行染色，再利用荧光显微镜进行镜检观察。
图4显示，微胶囊内几乎无红光，说明微胶囊内部死菌量极少，证明该包埋工艺对微胶囊活性几乎无影响。
3.液滴微流控法包埋率。
将单菌微胶囊利用解囊液解囊后，用LIVE/DEADTM BacLightTM BacterialViability Kit死活荧光染料进行染色，并利用流式细胞仪检测活性。按下列公式计算包埋率：
包埋率＝包埋后总活菌数/包埋前总活菌数
经检测计算得，液滴微流控法包埋率为98％。
粪菌包埋：
1.菌群包埋镜检：利用LIVE/DEADTM BacLightTM Bacterial Viability Kit死活荧光染料对微胶囊进行染色，再利用荧光显微镜进行镜检观察。
图5显示，微胶囊外观形态完整，且内部菌群分布均匀。
2.液滴微流控法包埋率
将粪菌微胶囊利用解囊液解囊后，用LIVE/DEADTM BacLightTM BacterialViability Kit死活荧光染料进行染色，并利用流式细胞仪检测活性。按下列公式计算包埋率：
包埋率＝包埋后总活菌数/包埋前总活菌数
经检测计算得，液滴微流控法包埋率为87％。
实验结果证明，液滴微流控包埋法既能用于包埋单一菌株也能用于包埋粪菌菌群。该技术适用性广，效果优异。包埋微胶囊经显微镜观测及流式细胞仪检测结果表明，液滴微流控法包埋出的微胶囊大小均一，形态良好，且该方法包埋率高，对菌体活性无明显影响。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，其特征在于该工艺通过第一毛细管穿过T型三通，第一毛细管一端连接注射器用于输送分散相，第一毛细管另一端插入第三毛细管内；连续相第二毛细管经T型三通上方注入，从第三毛细管流出；第一、第三毛细管共同形成共轴流液滴生成结构，生成的液滴通入CaCl2溶液中；包裹有菌体的海藻酸钠微液滴通入不断搅拌中的CaCl2溶液中形成海藻酸钙微胶囊；
其中，连续相为玉米油；分散相包含有肠道菌群液、保护剂和海藻酸钠溶液，连续相流速和分散相流速按照6：1的比例进行控制。
2.根据权利要求1所述的基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，其特征在于连续相中，含有2wt.％卵磷脂。
3.根据权利要求1所述的基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，其特征在于分散相中，肠道菌群液为5*1010cfu/mL的菌悬液，保护剂为5％的蔗糖，海藻酸钠溶液为2-2.5wt.％，其中，菌悬液：海藻酸钠溶液＝1:2。
4.根据权利要求1所述的基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，其特征在于CaCl2溶液通过烧杯置于磁力搅拌器上，以200rpm的速度不断搅拌。
5.根据权利要求1所述的基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，其特征在于连续相和分散相均使用5mL注射器、精密注射泵输送，连续相流速Qc为18μL/min，分散相流速Qd为3μL/min。
6.根据权利要求1所述的基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，其特征在于在海藻酸钠微液滴全部通入CaCl2溶液中形成微胶囊后再搅拌半小时对微胶囊进行固化。
7.根据权利要求6所述的基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，其特征在于固化后的微胶囊用300目的滤网过滤出微胶囊，并用1％的吐温80溶液洗涤去除油相，即可得到海藻酸钠包埋的肠道菌群微胶囊。
8.根据权利要求1所述的基于液滴微流控的肠道菌群包埋工艺，其特征在于所述第一毛细管，内径100μm，外径360μm；所述第二毛细管，内径100μm，外径360μm；所述第三毛细管，内径500μm，外径690μm。
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