ES2902551T3

ES2902551T3 - Métodos de encapsulación y microcápsulas producidas mediante los mismos

Info

Publication number: ES2902551T3
Application number: ES14792784T
Authority: ES
Inventors: Elzbieta Gorecka; Jaroslaw Dziadek; Wojciech Ambroziak
Original assignee: Proteon Pharmaceuticals SA
Current assignee: Proteon Pharmaceuticals SA
Priority date: 2013-10-28
Filing date: 2014-10-27
Publication date: 2022-03-28
Anticipated expiration: 2034-10-27
Also published as: HUE057189T2; PL405820A1; US10478401B2; WO2015063015A1; US20160279070A1; EP3062820A1; PT3062820T; PL231923B1; EP3062820B1; GB2527335A; GB201410898D0; CA2928967A1

Abstract

Un método para encapsular un material que comprende las etapas de: (a1) proporcionar una solución o suspensión acuosa del material que se va a encapsular, (b1) calentar la solución o suspensión acuosa hasta una temperatura que sea suficiente para permitir la disolución de un primer polímero biocompatible en la solución o suspensión acuosa sin afectar adversamente a las propiedades del material que se va a encapsular, (c1) disolver el primer polímero biocompatible en la solución o suspensión acuosa, o (a2) proporcionar una solución o suspensión acuosa de un primer polímero biocompatible, (b2) calentar la solución o suspensión acuosa del primer polímero biocompatible hasta una temperatura que sea suficiente para permitir la disolución o la suspensión, en la solución acuosa, del material que se va a encapsular sin afectar adversamente a las propiedades de dicho material, (c2) disolver o suspender el material que se va a encapsular en la solución o suspensión acuosa, y (d) desairear la solución o suspensión obtenida en la etapa (c1) o (c2), (e) emulsionar la solución o suspensión obtenida en (d) en un aceite biocompatible que comprende un tensioactivo para crear microgotículas, (f) endurecer las microgotículas mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende iones Zn2+ y un segundo polímero biocompatible a la emulsión obtenida en (e) para formar microcápsulas, caracterizado por que el primer polímero biocompatible es un alginato y el segundo polímero biocompatible es quitosano.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de encapsulación y microcápsulas producidas mediante los mismos

Campo de la Invención

La invención se refiere a métodos de encapsulación, en particular encapsulación de un bacteriófago, a partículas encapsuladas y a sus usos.

Antecedentes de la invención

El alginato reticulado con iones metálicos divalentes se ha usado para la microencapsulación de células, bacterias, fármacos y colorantes durante varias décadas. Los iones calcio divalentes (Ca2+) se usan ampliamente para reticular alginato. Las técnicas de encapsulación más comunes son extrusión y emulsificación / gelificación usando alginato como un material de soporte (Fundueanu 1998, Krasaekoopt 2003, Yu 2008). Dependiendo de la fuente de iones endurecedores usados para reticular el alginato, los métodos de emulsificación / gelificación se dividen adicionalmente en "internos", en los que una sal de calcio insoluble se mezcla con alginato y se solubiliza después de la emulsificación mediante cambio de pH, y "externos", en los que una sal de calcio soluble se añade gota a gota en una emulsión que contiene alginato (Poncelet 1992, Chan 2002b, Chan 2006, Ribeiro 2005, Ching 2008, Song 2013).

Otros iones metálicos divalentes (Zn2+, Sr2+ y Ba2+) se pueden unir a y reticular grupos carboxílicos del alginato de un modo más fuerte y menos selectivo (Gray 1987, Aslani 1996). Sin embargo, el bario y el estroncio no están aprobados para aplicaciones en alimentos y piensos.

Se dice que las microcápsulas reticuladas solamente con iones cinc se agregan y crean grumos de diámetros mucho mayores que los esperados. Por lo tanto, la reticulación se realiza usando combinaciones de iones Zn2+ y Ca2+, o solamente con iones Ca2+ (Chan 2002a).

Gray (1987) describió la microencapsulación de insulina. Los iones cinc se unen a alginato menos selectivamente que los iones calcio, dando como resultado poros menores en las matrices de alginato de cinc. Sin embargo, no se observaba una diferencia significativa entre los iones Zn2+ y Ca2+. Una alta retención de insulina en alginato de cinc se atribuía a la unión de insulina con cinc.

Poncelet (1992) describió una técnica de emulsificación / gelificación interna usando un gel de alginato cálcico para la microencapsulación de bacterias.

Smit (1995) describió la microencapsulación de bacterias para proteger a las bacterias de bacteriófagos usando una técnica de extrusión que usaba calcio y alginato.

Aslani (1996) observó que el cinc se une a alginato menos selectivamente, proporcionando una matriz más densa, de modo que la liberación desde el alginato de cinc se retardaba en comparación con el alginato cálcico. Sin embargo, la principal conclusión era que no existían ventajas particulares en el uso de iones cinc en lugar de iones calcio.

Fundueanu (1998) comparaba técnicas de extrusión y emulsificación de microencapsulación con alginato cálcico.

Chan (2002a) comparaba métodos de reticulación de alginato usando combinaciones de Ca2+, Zn2+ y combinaciones de ambos, concluyendo que una combinación de ambos iones daba los mejores resultados.

Chan (2002b) comparaba la microencapsulación a través de métodos de gelificación externos e internos. Una fuente de calcio interna estaba favorecida, a pesar de que esta proporcionaba poros mayores en las microcápsulas, debido a que la adición de calcio externo hacía que la emulsión se rompiera, dando como resultado que las microcápsulas formaran grumos.

Shu (2002) describió la microencapsulación a través de una técnica de extrusión, usando alginato, iones Ca2+ y quitosano. Los iones calcio y el quitosano se combinaban en una sola solución para el endurecimiento del alginato.

Krasaekoopt (2003) comparaba métodos de microencapsulación de probióticos usando técnicas de extrusión y emulsificación con iones calcio y alginato.

Chan (2006) comparaba la microencapsulación usando métodos de gelificación externa e interna, concluyendo que la gelificación externa daba como resultado microcápsulas con membranas más blandas y poros más pequeños.

Ribeiro (2005) describió un método de emulsificación/gelificación interna para la microencapsulación de hemoglobina, en el que el alginato se reticulaba usando iones calcio y se revestía con quitosano.

Xu (2006) describió un método en el que una solución de alginato se mezclaba con polvo de quitosano y se extruía en una solución de Ca2+, a continuación el quitosano se disolvía mediante el ajuste del pH.

Ching (2008) describió un método en el que se producían microcápsulas a través de gelificación externa; el alginato se reticulaba usando sales de Ca2+ de diferentes solubilidades.

Ma (2008) describió la microencapsulación del bacteriófago de Salmonella Felix O1 en cápsulas de alginato cálcico a través de técnicas de extrusión, que se revestían con quitosano.

Yu (2008) describió la microencapsulación usando una técnica de extrusión. El alginato se extruía en una mezcla de iones calcio y quitosano en un procedimiento de endurecimiento en una sola etapa.

Puapermpoonsiri (2009) describió una técnica de emulsión doble de agua / aceite / agua (w/o/w)/extracción con disolvente, usando PLGA, PVA y gelatina para microencapsular bacteriófagos de S. aureus y P. aeruginosa. Las microcápsulas producidas se criosecaban satisfactoriamente.

Ma (2010) describió la microencapsulación de bacteriófago K de S. aureus en cápsulas de alginato cálcico revestidas con quitosano a través de técnicas de extrusión. La liofilización del producto requería la adición de azúcares, tales como trehalosa.

Song (2013) comparó métodos de emulsificación / gelificación externa e interna para la microencapsulación de probióticos usando una matriz de alginato cálcico revestida con quitosano.

Chen, S. (2013) divulgó bacterias probióticas encapsuladas en microcápsulas de alginato cálcico para una mejora de la supervivencia en el tracto gastrointestinal humano y evaluó las propiedades mucoadhesivas de las microcápsulas de alginato cálcico revestidas con quitosano o quitosano tiolado.

El documento US 2012/0263826 A1 describe productos comestibles que contienen bacterias probióticas encapsuladas que tienen resistencia a condiciones térmicas y ácidas; se describen métodos para la encapsulación de probióticos en los que una mezcla de proteína desnaturalizada y alginato sódico (en una relación de 1:1 a 1:9) con células probióticas activas se combina con un catión divalente, específicamente Ca2+, para iniciar la gelificación en frío del alginato sódico y la proteína para formar una segunda mezcla que a continuación se extruye a través de una abertura de un diámetro menor de 1000 gm para formar cápsulas.

El documento EP 1537860 A1 describe una composición de vacuna y un método de preparación que incluye las etapas de: formar una emulsión de agua en aceite que incluye un alginato en agua, un aceite, un antígeno y al menos uno de (a) un éter de celulosa y al menos un tensioactivo iniónico; y (b) un tensioactivo copolimérico de tres bloques de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno) y al menos un tensioactivo iniónico; seguido por reticulación del alginato en la emulsión con al menos dos cationes seleccionados del grupo que consiste en aluminio, bario, calcio, litio, manganeso, estroncio y cinc, para formar micropartículas de alginato reticuladas; y recoger las micropartículas.

El documento WO 2009/037264 A2 describe composiciones antimicrobianas de bacteriófagos, proteínas fágicas, péptidos antimicrobianos o adaptámeros antimicrobianos para aporte oral, adaptadas para el aporte del principio activo al colon, el íleon distal u otra porción del tracto gastrointestinal distinta del estómago. Las composiciones pueden incluir cuentas de pectina formadas al reticular pectina con cinc o cualquier catión divalente, trivalente o policatiónico; opcionalmente las cuentas de pectina pueden revestirse con un polímero policatiónico, y/o revestirse con cualquier polímero adecuado para el aporte dirigido del ingrediente activo a la parte deseada del tracto gastrointestinal, tales como polímeros de tipo Eudragit®.

Un objetivo de la invención es proporcionar métodos mejorados para la microencapsulación, microcápsulas obtenidas mediante estos métodos mejorados y usos de estas microcápsulas.

Exposición de la Invención

La invención proporciona un método para encapsular un material que comprende las etapas de:

(a1) proporcionar una solución o suspensión acuosa del material que se va a encapsular,

(b1) calentar la solución o suspensión acuosa hasta una temperatura que sea suficiente para permitir la disolución de un primer polímero biocompatible en la solución o suspensión acuosa sin afectar adversamente a las propiedades del material que se va a encapsular,

(c1) disolver el primer polímero biocompatible en la solución o suspensión acuosa,

o

(a2) proporcionar una solución acuosa de un primer polímero biocompatible,

(b2) calentar la solución acuosa del primer polímero biocompatible hasta una temperatura que sea suficiente para permitir la disolución o la suspensión, en la solución acuosa, del material que se va a encapsular sin afectar adversamente a las propiedades de dicho material,

(c2) disolver o suspender el material que se va a encapsular en la solución / suspensión acuosa, y

(d) desairear la solución o suspensión obtenida en la etapa (c1) o (c2),

(e) emulsionar la solución o suspensión obtenida en (d) en un aceite biocompatible que comprende un tensioactivo para crear microgotículas,

(f) endurecer las microgotículas mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende iones Zn2+ y un segundo polímero biocompatible a la emulsión obtenida en (e) para formar microcápsulas, caracterizado por que el primer polímero biocompatible es un alginato y el segundo polímero biocompatible es un quitosano.

La invención proporciona un método para endurecer microgotículas para formar microcápsulas que comprende las etapas de: (a) proporcionar microgotículas en una emulsión que comprende (i) una solución o suspensión acuosa de un material que se va a encapsular y un primer polímero biocompatible, y (ii) un aceite biocompatible que comprende un tensioactivo; y (b) endurecer las microgotículas mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende iones Zn2+ y un segundo polímero biocompatible a la emulsión para formar microcápsulas, caracterizado por que el primer polímero biocompatible es un alginato y el segundo polímero biocompatible es un quitosano. Los presentes inventores describen un método para encapsular un material que comprende endurecer microgotículas para formar cápsulas, caracterizado por (a) proporcionar microgotículas en una emulsión que comprende (i) una solución o suspensión acuosa de un material que se va a encapsular y un primer polímero biocompatible, y (ii) un aceite biocompatible que comprende un tensioactivo; y (b) endurecer las microgotículas mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende iones Zn2+ y un segundo polímero biocompatible a la emulsión para formar microcápsulas.

Las microgotículas se pueden proporcionar en una emulsión mediante las etapas (a) a (e):

(a) proporcionar una solución o suspensión acuosa del material que se va a encapsular,

(b) calentar la solución o suspensión acuosa hasta una temperatura que sea suficiente para permitir la disolución de un primer polímero biocompatible en la solución o suspensión acuosa sin afectar adversamente a las propiedades del material que se va a encapsular,

(c) disolver el primer polímero biocompatible en la solución / suspensión acuosa;

o:

(a) proporcionar una solución acuosa de un primer polímero biocompatible,

(b) calentar la solución acuosa del primer polímero biocompatible hasta una temperatura que sea suficiente para permitir la disolución o suspensión, en la solución acuosa, del material que se va a encapsular sin afectar adversamente a las propiedades de dicho material,

(c) disolver o suspender el material que se va a encapsular en la solución / suspensión acuosa; y

(d) desairear una solución o suspensión obtenida en la etapa (c),

(e) emulsionar la solución o suspensión obtenida en (d) en un aceite biocompatible que comprende un tensioactivo para crear microgotículas.

Los métodos de la invención son ventajosos cuando se comparan con los métodos de la técnica, debido a que el material se encapsula usando una técnica de emulsificación / gelificación externa en la que un primer polímero biocompatible, que es un alginato, se reticula con una solución combinada de iones Zn2+ y un segundo polímero biocompatible, que es un quitosano, en un procedimiento en una sola etapa que proporciona microcápsulas discretas. Los métodos de la invención evitan la pérdida de rendimiento por agregación de microcápsulas y proporcionan microcápsulas que demuestran buena retención del material encapsulado.

Los métodos de la invención pueden comprender además la etapa (g) aislar las microcápsulas del aceite biocompatible. Las microcápsulas se pueden aislar del aceite biocompatible mediante numerosos métodos, por ejemplo mediante centrifugación o dejando que las microcápsulas sedimenten, y retirando el aceite de las microcápsulas, p. ej., mediante decantación o succión. Se puede usar filtración para separar las microcápsulas del aceite.

Sin embargo, los métodos de la invención pueden comprender además la etapa (h) lavar las microcápsulas en agua o una solución acuosa. Soluciones acuosas adecuadas para el uso en la etapa de lavado incluyen solución de cloruro de cinc a bajas concentraciones (por ejemplo, ZnCl²a de 0,008 a 0,012 M, preferiblemente a aproximadamente 0,01 M).

Sin embargo, los métodos según la invención pueden comprender además la etapa (i) secar las microcápsulas.

El secado de las microcápsulas se puede efectuar mediante métodos tales como liofilización, secado al aire, desecación y criosecado. Los expertos en la técnica serán capaces de seleccionar métodos de secado adecuados para secar las microcápsulas sin afectar adversamente a las propiedades del material encapsulado. Para microcápsulas que comprenden tanto bacterias como bacteriófagos, o bacterias solas, el secado se puede conseguir mediante liofilización.

Las microcápsulas obtenidas mediante un método de la invención se pueden formular con excipientes en una composición que comprende material de calidad alimentaria para seres humanos o animales o un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los métodos de la invención son útiles para la encapsulación de una amplia gama de materiales. Por ejemplo, el material que se va a encapsular se puede seleccionar de: una mezcla de bacterias y bacteriófagos, bacterias, bacteriófagos, una proteína, un péptido, una enzima, una sustancia profiláctica, una sustancia terapéuticamente activa, una sustancia farmacológica humana o veterinaria, un tinte, una tinta, una célula vegetal, una célula animal, una célula de levadura, un oligonucleótido, un probiótico, una vitamina, un alimento y un aditivo alimentario, un material que comprende bacterias y bacteriófagos, un material que comprende una o más cepas de bacteriófagos adecuadas para prevenir o combatir infecciones por cepas patógenas de Salmonella, p. ej. S. entérica serovarEnteritidis, y un material que comprende uno o más bacteriófagos seleccionados de PCM F/00069 (cepa 8sent1748), PCM F/00070 (cepa 8sent65) y PCM F/00071 (cepa 3sent1) depositados el 7 de junio de 2011, en the Polish Collection of Microorganisms.

Los bacteriófagos que someten a lisis bacterias patógenas se pueden combinar con bacterias probióticas y encapsularse para proporcionar microcápsulas. Estas microcápsulas son útiles para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección bacteriana, p. ej., en animales, particularmente ganado. Las microcápsulas se pueden administrar oralmente en una composición adecuada. Las microcápsulas se pueden añadir a materiales de piensos, en forma sólida o líquida, para la administración oral.

Un bacteriófago encapsulado es útil para prevenir y combatir infecciones de animales de granja, especialmente aves de corral, infectados con o propensos a cepas patógenas de bacterias sensibles a este bacteriófago. Las cepas patógenas de Salmonella plantean una grave amenaza económica a empresas avícolas comerciales; las aves de corral infectadas que entran en la cadena alimentaria plantean un riesgo a la salud humana. Un bacteriófago encapsulado proporcionado como microcápsulas de la invención descrito en la presente se puede administrar a animales en peligro con alimento o agua, a intervalos de uno a siete días.

En los métodos de la invención, el material que se va a encapsular se puede seleccionar de un material que comprende una o más bacterias probióticas y una o más bacterias probióticas seleccionadas de lactobacilos, bifidobacterias y lactococos.

En los métodos de la invención, un primer polímero biocompatible preferido es alginato sódico.

Según métodos preferidos de la invención, particularmente aquellos para la encapsulación de mezclas de bacterias / bacteriófagos, o bacterias solas, el material que se va a encapsular se proporciona en solución o suspensión y se calienta hasta una temperatura en el intervalo de 38°C a 40°C. El calentamiento de la solución o suspensión ayuda en la disolución del primer polímero biocompatible, que preferiblemente es un alginato, lo más preferiblemente alginato sódico, en la solución o suspensión de material que se va a encapsular.

La disolución del primer material biocompatible en la solución o suspensión acuosa de material que se va a encapsular puede ser apoyada adicionalmente por agitación o remoción mecánicas, preferiblemente usando un mezclador de turbulencia.

La desaireación de la solución o suspensión que comprende material que se va a encapsular se puede realizar al permitir que la solución o suspensión permanezca a temperatura ambiente. Se pueden usar otros métodos de desaireación y estarán dictados por las propiedades del material que se va a encapsular. Se puede usar filtración para la desaireación, pero esta está menos favorecida cuando el material de encapsulación es bacterias / bacteriófagos o bacterias solas, ya que la filtración puede provocar una pérdida de células bacterianas que se han de encapsular.

Se puede usar una amplia variedad de aceites biocompatibles en los métodos de la invención; un aceite biocompatible adecuado se puede seleccionar de un aceite de calidad alimentaria o farmacéutica, un aceite vegetal, aceite de maíz, aceite de girasol, aceite de “canola”, aceite de soja, aceite de palma, aceite de nuez, aceite de colza, aceite de coco, aceite de sésamo y aceite de oliva.

Preferiblemente, el aceite biocompatible comprende un tensioactivo, el uso de un tensioactivo se recomienda cuando se requieren microcápsulas de un tamaño uniforme, debido a que, sin un tensioactivo, las gotículas pueden tender a agregarse. Diversos tensioactivos conocidos en la técnica se pueden usar en los métodos de la invención, tensioactivos preferidos incluyen Tween®80, lecitina, Span®80 y Span®85; en realizaciones particulares de los métodos de la invención, Tween® 80 es un tensioactivo preferido.

La emulsificación se realiza generalmente mediante la agitación mecánica de la solución o suspensión. La emulsificación se puede realizar al remover la solución o suspensión, durante de aproximadamente 17 a aproximadamente 25 minutos, a de aproximadamente 950 a aproximadamente 1050 rpm, a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C. En realizaciones preferidas, la emulsificación se realiza al remover la solución o suspensión durante aproximadamente 20 min a aproximadamente 1000 rpm a temperatura ambiente, lo más preferiblemente en un matraz (de Erlenmeyer) de 250 ml, durante aproximadamente 20 min a aproximadamente 1000 rpm a temperatura ambiente.

Dependiendo del material que se vaya a encapsular, la emulsificación también se puede realizar mediante homogeneización. La homogeneización no se usa generalmente para la encapsulación de bacteriófagos y bacterias, o bacterias solas, ya que puede dar como resultado efectos adversos, tales como pérdida de viabilidad.

El endurecimiento de las microgotículas, esto es, la reticulación del polímero biocompatible, se realiza mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende iones Zn2+, que se puede proporcionar como una solución acuosa que comprende ZnCl². En realizaciones preferidas de los métodos de la invención, la solución acuosa comprende ZnCl²aproximadamente 0,05 M. Los iones Zn2+ se proporcionan en una solución acuosa que comprende un segundo polímero biocompatible, quitosano.

Para obtener microcápsulas discretas, se prefiere que el endurecimiento de las microgotículas se realice mediante la adición gota a gota de microgotículas separadas de aproximadamente 4 a 8 mm de diámetro, lo más preferiblemente mediante la adición gota a gota de microgotículas separadas de aproximadamente 6 mm de diámetro.

Microcápsulas de diámetros menores de 1 mm se pueden aplicar fácilmente como aditivos para alimentos y piensos, sin influir en la textura ni el sabor del alimento ni el pienso. Las microcápsulas de la invención se pueden añadir a agua de bebida para ganado para la administración. El material encapsulado se protege de las condiciones ambientales duras existentes durante el paso a través del tracto gastrointestinal (GI). La encapsulación también protege al material encapsulado de la degradación durante el almacenamiento. La membrana de las microcápsulas de la invención se diseña para proporcionar un tamaño de poro reducido a bajos valores de pH, de modo que el material encapsulado esté flotando libremente dentro del núcleo y de modo que el material encapsulado se libere a pH neutro dentro del intestino. Adicionalmente, las microcápsulas que comprenden alginato y quitosano según la invención protegen al material encapsulado durante las etapas de secado para mantener la integridad y la viabilidad del material encapsulado.

Ventajosamente, los inventores encontraron que mediante la optimización del procedimiento de emulsificación, asegurando una relación de fase continua a discontinua y una velocidad de agitación apropiadas, antes de endurecer con solución de Zn2+ y un segundo polímero biocompatible, un quitosano, era posible producir microcápsulas regulares, dentro de intervalos de tamaño aceptables, sin la formación de agregados de microcápsulas y la pérdida de rendimiento asociada.

Después de la formación de las microcápsulas, las microcápsulas se pueden aislar del exceso de solución emulsionante. Se describen en la técnica numerosos métodos de separación de microcápsulas de la solución emulsionante. Adecuadamente, el aislamiento de las microcápsulas se puede realizar mediante centrifugación y retirada del exceso de solución emulsionante.

Cuando se aíslan, las microcápsulas se pueden someter a una o más etapas de lavado para retirar cualquier solución emulsionante remanente. El lavado de las microcápsulas se puede realizar usando agua, u otra solución acuosa adecuada. La temperatura a la que se realiza la etapa de lavado puede ser seleccionada por los expertos en la técnica dependiendo del material que se haya encapsulado. En métodos preferidos de la invención, particularmente los que implican la encapsulación de bacteriófagos y bacterias, o bacterias solas, el lavado de las microcápsulas se realiza a aproximadamente 4°C.

En los métodos de la invención, los iones Ca2+ no se usan para la reticulación / el endurecimiento de las microcápsulas.

La invención proporciona una microcápsula que comprende material encapsulado, alginato de cinc y quitosano. Las microcápsulas descritas en la presente pueden comprender de 2 a 4% (p/p) de alginato de cinc y de 0,1 a 0,4% de quitosano (p/p).

La invención proporciona una microcápsula que comprende material encapsulado, 3% (p/p) de alginato de cinc y 0,2% (p/p) de quitosano.

El término alginato de cinc se refiere a alginato reticulado con cinc, tal como alginato sódico reticulado con cinc formado al combinar alginato sódico con iones cinc según se describe en la presente.

La invención proporciona una microcápsula caracterizada por que el material encapsulado es bacterias y bacteriófagos.

Así, una microcápsula puede comprender bacterias, bacteriófagos, alginato de cinc y quitosano, comprendiendo preferiblemente de 2 a 4% (p/p) de alginato de cinc y de 0,1 a 0,4% de quitosano (p/p), comprendiendo lo más preferiblemente 3% (p/p) de alginato de cinc y 0,2% (p/p) de quitosano.

Preferiblemente, las microcápsulas de la invención no comprenden alginato cálcico (alginato ligado a iones calcio) o no contienen una mezcla de alginato de cinc y alginato cálcico.

El término alginato cálcico se refiere a alginato reticulado con calcio, tal como el que se puede formar al combinar sal de alginato con iones calcio.

La invención proporciona una microcápsula de la invención para el uso como un medicamento. La invención proporciona microcápsulas de la invención para el uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección bacteriana. La invención proporciona además un alimento o una bebida para seres humanos o animales que comprende microcápsulas obtenidas mediante un método de la invención o que comprende una microcápsula de la invención. La divulgación proporciona además el uso de una microcápsula descrita en la presente en la fabricación de un medicamento.

Adicionalmente, la divulgación proporciona el uso de una microcápsula descrita en la presente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección bacteriana.

Por otra parte, la divulgación proporciona el uso de una microcápsula descrita en la presente en un producto útil en un campo seleccionado de: medicinas humana o veterinaria, productos farmacéuticos, alimentos para seres humanos o animales, agricultura, productos nutracéuticos, probióticos, oligonucleótidos, ingredientes de alimentos o piensos sensibles a la bilis, enzimas, fermentación, fotografía, artes gráficas, impresión, productos textiles, tintes y tratamiento de aguas residuales.

También se proporciona mediante la divulgación un producto que comprende una microcápsula descrita en la presente.

Adicionalmente, la divulgación proporciona los métodos de tratamiento de sujetos humanos o animales que implican la administración de microcápsulas descritas en la presente.

Lista de Figuras:

La Figura 1 muestra una comparación de la eficacia de microencapsulación para diferentes proporciones de iones endurecedores, así como solo iones cinc o calcio.

Figuras 2A, B, C y D: Microcápsulas presentadas en fotografías microscópicas (microscopio estándar, amplificación 480x) se prepararon según el protocolo de encapsulación descrito en el Ejemplo 3 y contienen bacterias de la cepa Lactobacillus casei. Las gotas de aceite visibles permanecían desde la etapa de emulsificación.

La Figura 3 muestra la eficacia de microencapsulación del procedimiento optimizado descrito en el Ejemplo 3. La eficacia se calculó con respecto a la concentración de fago en la mezcla de encapsulación (suma de volúmenes de aceite, alginato y solución endurecedora).

La Figura 4 muestra la prevalencia de partículas con un diámetro dado, que se define como una distribución de probabilidad. La serie gris oscuro indica la densidad de probabilidad. De ahí que la prevalencia de partículas de un tamaño se podría haber comparado con la prevalencia de partículas de otro tamaño (la escala de la izquierda). La escala mencionada presenta solamente proporciones mutuas entre los números de microcápsulas. La información más importante derivada del diagrama era la confirmación de la compatibilidad de los resultados obtenidos con una distribución gaussiana teórica. Por encima de 96% de las microcápsulas producidas estaban dentro de un intervalo de diámetro 400-1000 gm, confirmando la alta reproducibilidad de los métodos de la invención.

La Figura 5 muestra (A) la estabilidad de bacteriófago encapsulado a pH 5,5 en solución 0,05 M de ZnCl²a 4°C los días 1, 10, 20 y 30 de almacenamiento y (B) la estabilidad de bacteriófago no encapsulado libre a pH 5,0 en medio de caldo de LB a pH 5,0 a 4°C los días los días 1,7, 10 y 30 de almacenamiento, en cada caso expresada como el número de unidades formadoras de placas viables por ml.

La Figura 6 muestra la eficacia de bacteriófago encapsulado en una prueba de inhibición del crecimiento bacteriano.

La Figura 7 muestra la estabilidad del bacteriófago en un modelo del tracto gastrointestinal (GI) de pollo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de material para encapsulación - Preparación de suspensión de bacteriófago usando cultivo bacteriano.

1.1: Preparación de medio de LB líquido para recuperación de la cepa bacteriana anfitriona

Se disolvió una cantidad de 2,5 g de caldo de LB (Bio-Shop) en aproximadamente 90 ml de agua corriente. Se añadió una parte alícuota de 20 gl de solución de NaOH 5 M (preparada en agua desionizada) y la solución obtenida se llevó hasta 100 ml usando agua corriente, a continuación se removió para asegurar la disolución del medio de LB. El medio de LB líquido obtenido se dividió para proporcionar un volumen de 20 ml en cada uno de los 5 matraces de Erlenmeyer de 100 ml de capacidad. Los 5 matraces de Erlenmeyer que contenían 20 ml de medio de LB líquido se trataron en autoclave (15 min, 126°C, 1,4 bar) y a continuación de almacenaron a temperatura ambiente.

1.2: Recuperación de la cepa bacteriana anfitriona

Una parte alícuota de 10 gl de solución madre bacteriana en glicerina (solución madre en glicerina al 25%) se transfirieron a 20 ml del medio de LB líquido en un matraz de Erlenmeyer de 100 ml de capacidad preparado según se describe en 1.1. El medio de LB líquido inoculado se cultivó durante la noche (16-18 h) a 37°C en la incubadora (modelo Ecotron, Infors) con batimiento (140 rpm). El cultivo obtenido se usó directamente en las etapas 1.4 o 1.7 posteriores, o se almacenó a 4°C durante hasta 1 semana para uso posterior.

1.3: Preparación de medio M9+ líquido para la recuperación de la cepa de bacteriófago

Una cantidad de 1,13 g de caldo M9 (Bio-Shop) se vertió en un matraz de Erlenmeyer de 200 ml de capacidad y se añadieron 97 ml de agua corriente para disolver el caldo M9. El medio M9 obtenido se trató en autoclave (15 min, 126°C, 1,4 bar) y a continuación se enfrió hasta temperatura ambiente. Los siguientes se añadieron al medio M9 líquido tratado en autoclave: 1 ml de glucosa al 20% (preparada en agua desionizada) y 1 ml de MgSO41 M (preparado en agua desionizada) y 1 ml de CaCl²0,1 M (preparado en agua desionizada), para proporcionar medio M9+ líquido. El medio M9+ se transfirió a un vaso de precipitados de 200 ml de capacidad y se removió usando un agitador magnético (modelo Maxi Direct, Thermo Scientific) durante al menos 1 minuto, a continuación se esterilizó por filtración (filtro de 0,22 gm) y se transfirió a un matraz de Erlenmeyer de 300 ml estéril. El medio M9+ líquido estéril obtenido bien se usó directamente en la etapa 1.4 o bien se almacenó de un modo estéril.

1.4: Recuperación de la cepa de bacteriófago

Una parte alícuota de 200 pl de suspensión bacteriana, obtenida según se describe en 1.2 anteriormente, se distribuyó en 100 ml de medio M9+ líquido (obtenido según se describe en 1.3 anteriormente) en un matraz de Erlenmeyer. El medio M9+ inoculado se cultivó a 37°C en una incubadora (modelo Ecotron, Infors) usando batimiento (140 rpm) hasta que se obtenía una densidad óptica (OD600) de 0,5 a 0,8. Una parte alícuota de 100 pl de solución madre bacteriana en glicerina (solución madre en glicerina al 25%) se añadió al cultivo en M9+ para la amplificación de la cepa de bacteriófago en el cultivo bacteriano. La suspensión bacteriana/fágica se cultivó durante 3 horas a 37°C en la incubadora (modelo Ecotron, Infors) aplicando una opción de batimiento (140 rpm). El cultivo bacteriano/fágico líquido en M9+ obtenido se enfrió hasta 4°C y se almacenó durante la noche (16-18 h). A continuación, la suspensión bacteriana/fágica se esterilizó por filtración (0,22 pm) para retirar células bacterianas y residuo celular de la suspensión de bacteriófagos para obtener una suspensión fágica (libre de bacterias) estéril en medio M9+ líquido. La suspensión fágica estéril en medio M9+ líquido se sometió a una prueba de unidades formadoras de placas (PFU) para determinar el número de fagos que generan placas (zonas claras) específicas sobre un césped bacteriano que crece sobre una placa de agar, a fin de proporcionar el título de PFU/ml. La suspensión fágica estéril en medio M9+ líquido se almacenó de modo estéril a 4°C, o se usó directamente en la etapa 1.8, si las PFU/ml estaban en el intervalo de 1x108 a 1X1011.

1.5: Preparación de medio de LB líquido para amplificación del bacteriófago

Una cantidad de 25 g de caldo de LB (Bio-Shop) se vertió en un vaso de precipitados de al menos 1000 ml de capacidad. Se añadieron aproximadamente 900 ml de agua corriente a los 25 g de caldo de LB. Se añadió una parte alícuota de 200 pl de solución de NaOH 5 M (preparada en agua desionizada) y el volumen se llevó hasta 1000 ml usando agua corriente. El medio de LB líquido se removió usando un agitador magnético (modelo Maxi Direct, Thermo Scientific) durante al menos 1 minuto. El medio de LB líquido (1000 ml) se transfirió a un matraz de Erlenmeyer BD Falcon de 2000 ml (BD BioSciences) y se trató en autoclave (15 min, 126°C, 1,4 bar), a continuación bien se almacenó a TA o bien se usó directamente en 1.7 posteriormente.

1.6: Preparación de medio M9+ líquido para amplificación de bacteriófago

Una cantidad de 11,3 g de caldo M9 (Bio-Shop) se vertió en un matraz de Erlenmeyer BD Falcon de 2000 ml (BD BioSciences) y se añadieron 970 ml de agua corriente al caldo M9 y el M9 líquido se trató en autoclave (15 min, 126°C, 1,4 bar) y a continuación se enfrió hasta temperatura ambiente. Los siguientes se añadieron al medio M9 líquido tratado en autoclave: 10 ml de glucosa al 20% (preparada en agua desionizada) y 10 ml de MgSO41 M (preparado en agua desionizada) y 10 ml de CaCl²0,1 M (preparado en agua desionizada), para proporcionar medio M9+ líquido, que se removió usando un agitador magnético (modelo Maxi Direct, Thermo Scientific) durante al menos 1 minuto. A continuación, el medio M9+ se esterilizó por filtración (filtro de 0,22 pm) y bien se almacenó de modo estéril en una botella de almacenamiento a temperatura ambiente o bien se usó directamente en 1.8 posteriormente.

1.7: Procedimiento de amplificación de bacteriófago - precultivo de cepa bacteriana anfitriona

Un volumen de 2 ml de la suspensión bacteriana obtenida en la etapa 1.2 anterior se inoculó en 1000 ml de medio de LB líquido (obtenido en E anteriormente) en un matraz de Erlenmeyer BD Falcon de 2000 ml (BD BioSciences). El medio de LB líquido inoculado se cultivó a 37°C en una incubadora (modelo Ecotron, Infors) con batimiento (140 rpm) hasta que se obtenía una densidad óptica (OD600) de 0,5 a 0,8. El cultivo en LB líquido se transfirió a 2 x tubos Falcon de centrífuga de 500 ml y se puso en un rotor (4784) de la centrífuga (modelo Rotina 420R, Hettich). Para separar las bacterias del medio de LB líquido, las células bacterianas se nodulizaron mediante centrifugación (20 min, 4000 g, 4°C) y el sobrenadante se decantó manualmente desde cada uno de los tubos Falcon. Las células bacterianas que permanecían en la pella en el fondo de ambos tubos Falcon se usaron directamente en la etapa 1.8.

1.8: Procedimiento de amplificación de bacteriófago para producir una suspensión de la cepa de bacteriófago

Cada una de las pellas de células bacterianas anfitrionas (obtenidas según se describe en 1.7, después de un precultivo en medio M9+ líquido) se suspendieron en 500 ml de medio M9+ líquido que se preparaba según se describe en 1.6 anteriormente. Ambas suspensiones de 500 ml (1000 ml en total) se transfirieron a un matraz de Erlenmeyer de Falcon BD de 2000 ml (BD BioSciences). Para la amplificación del bacteriófago, las suspensiones bacterianas obtenidas se inocularon con fago (en medio de LB líquido, obtenido según se describe anteriormente) y la suspensión bacteriana/fágica se cultivó durante 6 horas a 37°C en una incubadora (modelo Ecotron, Infors) con agitación (140 rpm). El medio M9+ líquido obtenido se refrigeró hasta 4°C y se almacenó durante la noche (16-18 h). Las células bacterianas y el residuo celular se retiraron de la suspensión de bacteriófago mediante esterilización por filtración usando un filtro de 0,22 pm. El título del fago (PFU/ml) en la suspensión de fago esterilizada se midió al realizar una prueba de unidades formadoras de placas (PFU). Para asegurar la calidad, la suspensión fágica en M9+ líquido estéril se sometió a un procedimiento de aislamiento de ADN fágico, al aplicar la prueba de PCR Phage DT-B.

Ejemplo 2: Preparación experimental inicial de microcápsulas que contienen bacteriófago y/o bacterias

En experimentos iniciales, se investigó la influencia de dos variables sobre la eficacia de encapsulación.

2.1: Concentración de alginato sódico

La primera variable investigada era la concentración de alginato sódico. Para conseguir el grado más denso posible de reticulación, se consideró incrementar la concentración de biopolímero de alginato. Sin embargo, por encima de 3% (p/v), las soluciones de alginato alcanzaban una viscosidad que era suficientemente alta para impedir la emulsificación en etapas de procedimiento posteriores. También se rechazaron las concentraciones superiores debido a las dificultades potenciales asociadas con el aumento a escala de la producción de cápsulas hasta una escala semiindustrial y a continuación industrial. La preparación de una solución de polímero muy viscosa requeriría el uso de agitadores mecánicos robustos y una gran cantidad de energía. Como resultado, solo se analizaban soluciones de alginato al 2% y el 3% cuando se optimizaba el procedimiento.

2.2: Se analizó la adición de iones endurecedores a diversas concentraciones y relaciones

Se analizó la adición de iones endurecedores a diversas concentraciones y relaciones. Para cada combinación, basándose en los resultados de la retrovaloración, se usó un exceso de iones calcio o cinc para asegurar la reticulación completa del alginato. Se seleccionaron cationes calcio y cinc para una investigación adicional, pero los cationes calcio y cinc se unían a residuos de ácido algínico con especificidades diferentes. Se investigó la reticulación con estos dos endurecedores seleccionados en diversas proporciones, para determinar si se podía conseguir una mejora significativa en la retención de un material de encapsulación de prueba, un bacteriófago, en microcápsulas.

Los resultados indican claramente que usar una concentración superior de solución de alginato mejoraba la eficacia de retención del fago en microcápsulas. Sin embargo, los resultados obtenidos para las cápsulas reticuladas con mezcla de calcio y cinc eran muy sorprendentes (Figura 1).

Debido a la diferencia en la afinidad de los cationes para residuos de ácido manurónico y glucurónico, se esperaba una mejora significativa en la eficacia del procedimiento. Sin embargo, en la práctica, se observó que el uso de iones endurecedores tanto Ca2+ como Zn2+ simultáneamente reducía la "estrechez" de la membrana para cada proporción de Ca2+ y Zn2+ que se analizaba, varias o incluso varias docenas de veces, en comparación con microcápsulas reticuladas usando un solo tipo de catión. Sin pretender limitarse por una teoría, es posible que los iones Ca2+ y Zn2+ interfieran mutuamente al competir por los mismos residuos carboxílicos, lo que a su vez incrementa la permeabilidad de las membranas de alginato. Debido a las diferencias insignificantes en la eficacia de inmovilización en las fases posteriores del procedimiento de optimización, se consideraba la solución al 3% de alginato sódico reticulado solamente con iones calcio o solamente con iones cinc.

A pesar de la mejora considerable de la eficacia de microencapsulación desde un 10% inicial hasta por encima de 20%, el procedimiento todavía no era técnicamente aceptable. Así, según se analiza, también se usó quitosano. La primera modificación implicaba la preparación de cápsulas con la concentración de iones reticuladores reducida a la mitad y, después de retirar la fase oleosa y el exceso de fase acuosa, el revestimiento con una segunda capa de biopolímero, quitosano.

A pesar del uso de la solución de alginato a una concentración superior, el procedimiento que usaba el protocolo modificado era significativamente menos eficaz cuando se comparaba con el protocolo inicial. Por lo tanto, se desarrolló una modificación de un protocolo propuesto en 2002 por X.Z. Shu de the University of Beijing. La modificación más importante era disolver alginato sódico directamente en la suspensión del material del núcleo. A continuación, la suspensión se emulsionaba, se reticulaba con iones endurecedores y, después de la primera centrifugación, se encapsulaba con quitosano. De nuevo, no se observaba una mejora de la eficacia.

Se deseaba un incremento sustancial en la cuota de material del núcleo en la mezcla de encapsulación global.

El ácido algínico y sus sales solubles producen soluciones de alta viscosidad y habitualmente se preparan en agua desionizada a temperaturas relativamente altas de aproximadamente 60°C. Estas condiciones no se pueden usar con materiales termosensibles. Por ejemplo, la supervivencia del bacteriófago está afectada adversamente a estas temperaturas. Por lo tanto, la siguiente fase de la investigación era determinar la temperatura de incubación más alta posible que proporcionara soluciones con viscosidad apropiada, sin afectar adversamente al título de microorganismos viables. Se encontró que una temperatura de 40°C era adecuada para conseguir viscosidades de alginato manejables y para mantener la viabilidad del bacteriófago.

Teniendo en cuenta los resultados observados cuando se incuba bacteriófago y bacterias a temperaturas elevadas, los métodos de microencapsulación posteriores se modificaron para incluir la etapa de disolución de alginato sódico en la suspensión de material del núcleo, es decir, material que se va a encapsular. Sorprendentemente, se encontró que reticular el alginato simultáneamente con iones endurecedores en presencia de quitosano proporcionaba un procedimiento muy eficaz. Existen diferencias significativas en la velocidad de reacción entre el polímero y los iones y entre los dos polímeros, alginato y quitosano. Los iones calcio o cinc se unen a residuos carboxilo rápidamente, debido a que su pequeño tamaño facilita la penetración de las cadenas de polímero. Se necesita un tiempo adicional para que el quitosano se adhiera al alginato.

Un problema potencial en la unión de los iones endurecedores con quitosano en solución puede surgir de las propiedades quelantes del polímero. En el caso de los iones calcio, la reacción no se produce, pero en el caso de los cationes cinc se forman quelatos muy fuertes y estables. Por lo tanto, podría interferir con la unión de ambos componentes a los residuos carboxílicos de alginato y bloquear definitivamente la formación de microcápsulas. Por otra parte, el resultado final depende de la fuerza de la afinidad de Zn2+ para ambos polímeros, puesto que algunos iones se pueden unir todavía al alginato, pero un exceso puede proporcionar una reticulación más eficaz del segundo revestimiento.

Las cápsulas obtenidas mediante la reticulación de una mezcla de iones calcio y quitosano presentaban un contenido de bacteriófago comparable con las modificaciones del procedimiento previas. Para microcápsulas reticuladas con una mezcla de cationes cinc y quitosano, los resultados de los experimentos efectuados eran muy sorprendentes. Para los tres bacteriófagos analizados, la eficacia de microencapsulación superaba todos los resultados conseguidos previamente a partir de la ruta de optimización completa. En el caso del bacteriófago 3sent1 se obtenía casi 60% de eficacia, para 1st1 alcanzaba 66%, mientras que para 2styp4 era 97% (Figura 3). Por otra parte, repeticiones adicionales del procedimiento daban resultados muy similares, que se confirmaban por los bajos valores de desviación estándar. Esto probaba que el protocolo de microencapsulación optimizado que se describe en el ejemplo 3 era altamente reproducible.

Ejemplo 3: Preparación de microcápsulas que contienen bacteriófagos y/o bacterias

Para preparar material para encapsulación, 30 ml de suspensión fágica/bacteriana (LAB en medio MRS (BTL), fagos en caldo M9 o LB (LabEmpire)) obtenida según el método descrito en el Ejemplo 1 se calentaron y se mantuvieron a 40°C durante 25 minutos en un tubo cónico de 50 ml (Immuniq) en un baño de agua. Se disolvieron 0,9 g de sal sódica de ácido algínico procedente de algas pardas (Sigma) en la suspensión fágica/bacteriana en un tubo cónico, con turbulencia durante 2 minutos. La solución de alginato Na obtenida en el tubo cónico se desaireó al permitir que la solución reposara durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, la solución se dispersó en aceite al verter la solución de alginato Na desde el tubo cónico en 50 ml de aceite vegetal (Kujawski) que contenía 1,2 ml de Tween®80 (POCH o Sigma) en un matraz de Erlenmeyer de 250 ml. La solución de alginato Na residual pegada a las paredes del tubo cónico se eluía con 10 ml de aceite con turbulencia durante 2 minutos y se vertió al matraz de Erlenmeyer de 250 ml.

La emulsificación se realizó en el matraz de Erlenmeyer al remover durante 20 minutos a 1000 rpm a temperatura ambiente usando un agitador magnético (agitador magnético T.ARE, Velp Scientifica; barra de remoción cilíndrica 10x50 mm). La emulsificación en aceite creaba gotículas microdimensionadas del material de polímero de alginato / bacterias / bacteriófago que se va a endurecer, el grado de dispersión determinaba el tamaño de las microcápsulas.

Para endurecer las gotículas para formar microcápsulas, las gotículas se reticularon usando iones cinc y quitosano. Las gotículas de la fase acuosa se endurecieron usando 30 ml de ZnCl²0,05 M (Sigma) con quitosano al 0,2% (p/v) (medio MW, DA 75-85%, Sigma) en ácido acético 1% (v/v) (CH³COOH, ácido acético, 99,5% (POCH)) en H²O desionizada. La solución de iones cinc / quitosano se añadió gota a gota usando un Pipetus y una pipeta desechable con un diámetro externo de 3 mm para crear gotículas separadas de 6 mm de diámetro y evitar crear cadenas de microcápsulas. La emulsión se removió durante 30 minutos a 1000 rpm a temperatura ambiente.

La emulsión se dividió en 2 tubos cónicos, que se pusieron en un rotor; las etapas posteriores se efectuaron en 2 tubos de ensayo cónicos.

Para retirar el exceso de aceite, las microcápsulas obtenidas se separaron mediante centrifugación durante 10 minutos a 2000 rpm (340 RCF) a 4°C usando una centrífuga de cubeta oscilante Hettich, rotor 4784. La fase oleosa se decantó manualmente, de modo que las microcápsulas permanecieran en el fondo de los tubos cónicos. Las microcápsulas se lavaron al batir con 20-30 ml de H²O desionizada, a continuación las microcápsulas se recuperaron mediante centrifugación durante 10 minutos a 2000 rpm (340 RCF) a 4°C), el sobrenadante se decantó manualmente de modo que las microcápsulas permanecieran en el fondo de los tubos cónicos. Las etapas de lavado y recuperación se repitieron, a continuación el sobrenadante se decantó manualmente, permaneciendo las microcápsulas en el fondo de los tubos cónicos.

La Figura 4 muestra la prevalencia de partículas con un diámetro dado, que se define como una distribución de probabilidad. La serie gris oscuro indica la densidad de probabilidad. De ahí que la prevalencia de partículas de un tamaño se podría haber comparado con la prevalencia de partículas de otro tamaño (la escala de la izquierda). La susodicha escala presenta solo proporciones mutuas entre los números de microcápsulas. La información más importante derivada del diagrama era la confirmación de compatibilidad de los resultados obtenidos con una distribución gaussiana teórica. Por encima del 96% de las microcápsulas producidas estaban dentro del intervalo de diámetro 400-1000 pm, confirmando la alta reproducibilidad de los métodos de la invención (Tabla 1).

Tabla 1

Ejemplo 4: Evaluación de la eficacia de encapsulación

Para determinar la eficacia de encapsulación, 400 pl de microcápsulas procedentes de cada lote se transfirieron con una pipeta automática a un tubo cónico separado con 19,6 ml de tampón de fosfato 0,2 M (NaH²PÜ⁴(POCH) Na2HPÜ4 (POCH)). Las microcápsulas se disolvieron al batir en una incubadora con una batidora giratoria (Infors-HT Ecotron, 140 rpm, 37°C). Se elaboraron diluciones en serie de la solución de microcápsulas disueltas usando Tween80 (POCH o Sigma) al 0,1% como un diluyente; las diluciones se sembraron sobre cápsulas de Petri de 60 mm usando una técnica de superposición de agar. La eficacia deseada de microencapsulación era al menos 60%. Se aisló ADN del bacteriófago y se amplificó mediante PCR para confirmar la presencia del bacteriófago de interés en las microcápsulas.

Para determinar la eficacia de la microencapsulación, una parte alícuota de 20 ml de caldo de LB (Lab Empire) en un tubo cónico de 50 ml (Immuniq) se inoculó con un asa (10 pl) de solución madre bacteriana y se cultivó en una incubadora usando una batidora giratoria durante 18 h (Infors-HT Ecotron, 140 rpm, 37°C). Se realizaron diluciones en serie de la suspensión bacteriana usando caldo de LB como un diluyente. Cada pocillo de la columna A y los pocillos B1-3 de una placa de valoración de 96 pocillos (ThermoScientific) se rellenaron con 50 pl de AlamarBlue (Invitrogen). El pocillo B1 se dejó como un control de la pureza del reactivo. El pocillo B2 se rellenó con 100 pl de microcápsulas centrifugadas y 100 pl de caldo de LB como un control de la pureza de las microcápsulas. El pocillo B3 se rellenó con 100 pl de suspensión bacteriana no diluida y 100 pl de caldo de LB como control del crecimiento bacteriano. Una parte alícuota de 100 pl de microcápsulas centrifugadas y una parte alícuota de 100 pl procedentes de cada dilución del cultivo bacteriano se transfirió a los pocillos posteriores de la columna A de una placa de valoración de 96 pocillos (ThermoScientific). La placa de valoración se incubó durante 18 h (Infors-HT Ecotron, 37°C). La presencia de color azul en un pocillo indicaba que el crecimiento bacteriano había sido inhibido por el bacteriófago. La presencia de coloración rosa en un pocillo indicaba que el crecimiento bacteriano se había mantenido. La eficacia de la microencapsulación se determinó como un número lo más bajo posible de partículas fágicas requerido para la lisis de una célula bacteriana.

Ejemplo 5: Microscopía electrónica

El tamaño de poro de las microcápsulas se puede investigar mediante microscopía electrónica.

Ejemplo 6: Almacenamiento

Para el almacenamiento, las microcápsulas se suspendieron en solución de almacenamiento (20 ml de ZnCl²(Sigma) 0,05 M en H²O desionizada), pH 5,5, y se almacenaron durante hasta un mes a 4°C.

Ejemplo 7: Estabilidad del bacteriófago encapsulado durante el almacenamiento

Cada uno de los bacteriófagos 3sent1, 1st1 o 2styp4 encapsulados se suspendió en solución 0,05 M de ZnCl², pH 5,5 a 4°C, que se determinaba experimentalmente que era el tampón de almacenamiento más adecuado para la conservación de la estructura de las microcápsulas. Cada uno los bacteriófagos 3sent1, 1st1 o 2styp4 no encapsulados libres se almacenaron en medio de caldo de LB, pH 5,0 a 4°C. El número de bacteriófagos activos en las microcápsulas se determinó mediante un ensayo de unidades formadoras de placas (PFU) (Tabla 2 y Figura 5) los días 1, 10, 20 y 30 de almacenamiento (Tabla 2 y Figura 5A). La viabilidad del bacteriófago no encapsulado libre se determinó mediante un ensayo de unidades formadoras de placas (PFU) los días 1,7, 14 y 30 de almacenamiento (Figura 5B). Los datos representan la media±SEM procedente de 3 experimentos independientes.

El bacteriófago 1st1 se aisló de muestras proporcionadas por Polish State Sanitary Inspection obtenidas de plantas de tratamiento de aguas residuales en Lodz, Polonia y Tuszyn, Polonia, la cepa anfitriona era S. entérica ser. Typhimurium LT2. El bacteriófago 2styp4 se obtuvo de muestras procedentes de VETLAB (Brudzew, Polonia), que se especializa en el análisis de la contaminación bacteriana de granjas, la cepa anfitriona era S. entérica ser. Typhi ATCC 13311. El aislamiento de los bacteriófagos 1st1 y 2styp4 se describe en el documento WO2013/027146, cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad.

Ejemplo 8: Efecto antibacteriano de bacteriófago encapsulado

Se iniciaron cultivos de Salmonella entérica mediante la inoculación de 3 tubos, que contenía cada uno 30 ml de medio de caldo LB con un número igual de bacilos de Salmonella e incubación hasta una OD⁶⁰⁰de 0,5 a 37°C en condiciones aeróbicas. Posteriormente, se añadieron 2 ml de medio de caldo de LB (control del crecimiento bacteriano), 2 ml de LB complementado con una concentración seleccionada de bacteriófago 1st1 y 2 ml de caldo de LB complementado con la misma concentración de bacteriófago 1 st1 encapsulado para separar los tubos y los tubos se incubaron durante 3 h adicionales. El crecimiento bacteriano en cada tubo se comprobó mediante la determinación de OD⁶⁰⁰en momentos seleccionados (Tabla 3 y Figura 6). Los datos representan la media±SEM procedente de 3 experimentos independientes.

Tabla 3

Ejemplo 9: Estabilidad de bacteriófago encapsulado en un modelo in vitrode tracto digestivo de pollo

Se creó un estimulador del tracto gastrointestinal (GITS) usando una batidora giratoria (120 rpm) con una temperatura de incubación de 42°C.

La primera etapa experimental que simula condiciones en el buche de pollo se realizó como sigue: 12 ml de NaCl 0,1 M se complementaron con 4 ml de 'alimento' (bacteriófago bien libre o bien encapsulado), se valoraron hasta pH 4,5 con un volumen adecuado de solución de NaHCO3 1 M y se incubaron adicionalmente durante 30 minutos. Se muestreó 1 ml de la solución para la determinación del título de bacteriófago y el contenido de simulador se complementó con la adición de 1 ml de NaCl 0,1 M.

La siguiente etapa, que simula el pase del buche al proventrículo, se inició mediante la valoración de la solución hasta pH 4,4 con solución NaHCO3 1 M seguido por 15 min de incubación. Se muestreó 1 ml de la solución para la determinación del título del bacteriófago y el contenido de simulador se complementó con 1 ml de NaCl 0,1 M.

En la siguiente fase, se simularon los procesos observados en la molleja. A este fin, se añadieron al recipiente 2 g de grava (hasta 3 mm de diámetro) y el pH de la solución se valoró hasta pH 2,6 con HCl 1 M seguido por una incubación de 90 min. Después de la incubación, se muestreó 1 ml de la solución para la determinación del título de bacteriófago. Posteriormente, la grava se retiró y el contenido de simulador se complementó con la adición de 1 ml de solución de sales biliares al 3,5% (p/v) y la siguiente etapa del procedimiento que simula el paso desde la molleja hasta el intestino delgado se inició mediante la valoración de la solución hasta pH 6,2 con NaHCO31 M seguido por una incubación de 90 min. Después de esta incubación, se muestreó 1 ml de la solución para la determinación del título del bacteriófago y se añadió 1 ml de NaCl 0,1 M al contenido del simulador.

En la etapa final, el pH de la solución se ajustó hasta pH 6,3 y se incubó durante 15 minutos para reproducir las condiciones del intestino grueso. A continuación, se muestreó 1 ml de la solución para la determinación del título del bacteriófago.

Para cada etapa experimental, se calculó la "velocidad de supervivencia" que representa la fracción de bacteriófago activo que queda en la solución, teniendo en cuenta el volumen del líquido (Figura 7). Los datos representan la media±SEM procedente de 2 experimentos independientes.

Información de Depósitos Biológicos

PCM F/00069 (cepa 8sent1748), PCM F/00070 (cepa 8sent65) y PCM F/00071 (cepa 3sent1) se depositaron con propósitos de patente bajo el Tratado de Budapest el 7 de junio de 2011, en the Polish Collection of Microorganisms, Institute of Immunology and Experimental Therapy, Polish Academy of Sciences, ul Weigla 12, 53-114. Wroclaw, Polonia.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para encapsular un material que comprende las etapas de:

o

(a2) proporcionar una solución o suspensión acuosa de un primer polímero biocompatible,

(b2) calentar la solución o suspensión acuosa del primer polímero biocompatible hasta una temperatura que sea suficiente para permitir la disolución o la suspensión, en la solución acuosa, del material que se va a encapsular sin afectar adversamente a las propiedades de dicho material,

(c2) disolver o suspender el material que se va a encapsular en la solución o suspensión acuosa, y

(d) desairear la solución o suspensión obtenida en la etapa (c1) o (c2),

(f) endurecer las microgotículas mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende iones Zn2+ y un segundo polímero biocompatible a la emulsión obtenida en (e) para formar microcápsulas, caracterizado por que el primer polímero biocompatible es un alginato y el segundo polímero biocompatible es quitosano.

2. Un método para endurecer microgotículas para formar microcápsulas que comprende las etapas de: (a) proporcionar microgotículas en una emulsión que comprende (i) una solución o suspensión acuosa de un material que se va a encapsular y un primer polímero biocompatible, y (ii) un aceite biocompatible que comprende un tensioactivo; y (b) endurecer las microgotículas mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende iones Zn2+ y un segundo polímero biocompatible a la emulsión para formar microcápsulas, caracterizado por que el primer polímero biocompatible es un alginato y el segundo polímero biocompatible es quitosano.

3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además la etapa (g) aislar las microcápsulas del aceite biocompatible, que comprende además opcionalmente la etapa (h) lavar las microcápsulas en agua o una solución acuosa, que comprende además opcionalmente la etapa (i) secar las microcápsulas.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además formular las microcápsulas en una composición que comprende material de calidad alimentaria para seres humanos o animales o excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material que se va a encapsular se selecciona de: una mezcla de bacterias y bacteriófagos, bacterias, bacteriófagos, una proteína, un péptido, una enzima, una sustancia profiláctica, una sustancia terapéuticamente activa, una sustancia farmacológica humana o veterinaria, un tinte, una tinta, una célula vegetal, una célula animal, una célula de levadura, un oligonucleótido, un probiótico, una vitamina y un aditivo alimentario, un material que comprende bacterias y bacteriófagos, un material que comprende una o más cepas de bacteriófagos adecuadas para prevenir o combatir infecciones por cepas patógenas de Salmonella spp, un material que comprende una o más cepas de bacteriófagos adecuadas para prevenir o combatir infecciones por S. entérica serovar Enteritidis y un material que comprende uno o más de PCM F/00069 (cepa 8sent1748), PCM F/00070 (cepa 8sent65) y PCM f/00071 (cepa 3sent1) depositados el 7 de junio de 2011 en the Polish Collection of Microorganisms.

6. Un método según la reivindicación 4, en el que el material que se va a encapsular se selecciona de un material que comprende una o más bacterias probióticas y un material que comprende una o más bacterias probióticas seleccionadas de lactobacilos, bifidobacterias y lactococos.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primer polímero biocompatible es alginato sódico.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material que se va a encapsular se calienta hasta una temperatura en el intervalo de 38°C a 40°C.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el aceite biocompatible se selecciona de: un aceite de calidad alimentaria o farmacéutica, un aceite vegetal, aceite de maíz, aceite de girasol, aceite de colza y aceite de oliva.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el tensioactivo se selecciona de: Tween® 80, lecitina, Span® 80 y Span® 85.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el endurecimiento de las microgotículas se realiza mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende iones Zn2+.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el endurecimiento de las microgotículas se realiza mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende ZnCl²,

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el endurecimiento de las microgotículas se realiza mediante la adición gota a gota de una solución acuosa que comprende ZnCl²aproximadamente 0,05 M.

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el endurecimiento de las microgotículas se realiza mediante la adición gota a gota de microgotículas separadas de aproximadamente 4 a 8 mm de diámetro.

15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el endurecimiento de las microgotículas se realiza mediante la adición gota a gota de microgotículas separadas de aproximadamente 6 mm de diámetro.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que no se usan iones Ca2+ para la reticulación / el endurecimiento de las microcápsulas.

17. Una microcápsula que comprende material encapsulado, alginato de cinc y quitosano.

18. Una microcápsula según la reivindicación 17, que comprende material encapsulado, 3% de alginato de cinc y 0,2% de quitosano.

19. Una microcápsula según la reivindicación 17 o la reivindicación 18, caracterizada por que el material encapsulado es bacterias y bacteriófagos.

20. Una microcápsula según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada por que la microcápsula no contiene una mezcla de alginato de cinc y alginato cálcico.

21. Una microcápsula según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizada por que la microcápsula no comprende alginato cálcico.

22. Una microcápsula según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, para el uso como un medicamento.

23. Una microcápsula según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, para el uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección bacteriana.

24. Un alimento o una bebida para seres humanos o animales que comprende microcápsulas obtenidas mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o que comprende una microcápsula según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23.