CN114403290B - 一种噬菌体微胶囊及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种噬菌体微胶囊及其制备方法，该噬菌体微胶囊主要由以下组成制备而成：噬菌体芯材、保护剂和壁材，其中，所述壁材包括海藻酸钠、明胶、卡拉胶、麦芽糊精、壳聚糖、羟甲基纤维素中的一种或多种；所述保护剂包括两性淀粉、海藻糖、脱脂乳、碳酸钙、蔗糖、麦芽糊精中的一种或多种。该制备方法包括以下步骤：将壁材和保护剂按照比例分别加入到噬菌体发酵液中，充分混匀，得到噬菌体胶液；通过锐孔法将噬菌体胶液挤入到固化剂溶液中，静止固化，得到湿胶囊；将湿胶囊用洗涤液进行洗涤；将洗涤后的湿胶囊浸泡在包膜材料溶液中进行覆膜处理后，得到噬菌体微胶囊。该噬菌体微胶囊具有良好耐酸性和保存稳定性，缓释率高，提高噬菌体存活率。

Description

一种噬菌体微胶囊及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物制剂技术领域，尤其涉及一种噬菌体微胶囊及其制备方法。
背景技术
噬菌体是一类细菌病毒，烈性噬菌体能够快速裂解细菌导致宿主菌死亡，起到快速杀菌的效果。噬菌体在宿主细胞中生长繁殖，能够引起致病菌的裂解，降低致病菌的密度，从而减少或避免致病菌感染或发病的机会，达到治疗和预防疾病的目的，即噬菌体疗法。此疗法已广泛应用于兽医、农业和食品微生物学等领域。国内养殖业尤其是养鸡业常常受到畜禽肠道腹泻病的困扰，此病主要是由大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物引起。随着耐药性细菌的大量出现，用具有专一性强、不易产生抗性等优点的相关噬菌体来治疗细菌疾病受到重视。利用噬菌体疗法可以降低羊羔、仔猪和雏鸡患大肠杆菌肠道疾病的机率。因此，噬菌体疗法正逐渐成为国际研究的热点。但是由于噬菌体存在脱离宿主后难以存活，因此噬菌体产品需要解决其长时间存储中其活性稳定的问题。
微胶囊技术是一种保护技术，它是利用天然的或合成的高分子材料，将一些具有反应活性、敏感性的物质包裹起来，形成微小颗粒。被包裹在微胶囊内部的物质称为芯材，包裹在微胶囊外部的材料称为壳材(或壁材)。微胶囊技术也可以说是一种保护技术，能依靠囊壁的屏蔽作用起到保护芯材的作用。采用微胶囊技术制得的产品有良好的功能性和贮存稳定性，使用方便，可以解决传统工艺中所不能解决的众多问题。
但目前噬菌体微胶囊技术方面的研究较少，技术成熟度较低。如专利申请号为202011015633.1的专利公开了一株耐高温沙门氏菌噬菌体RDP-SA-18056及其微胶囊的制备工艺，其微胶囊的制备工艺是对噬菌体发酵液进行离心、过滤后，向噬菌体液体中加入载体并搅拌均匀后进行低温喷雾干燥：将过滤除菌后的噬菌体液体加入载体并搅拌均匀，载体为：8％多空淀粉，2％聚乙烯吡咯烷酮，1％乳糖，0.5％改性壳聚糖，0.2％维生素C；然后进行温喷雾干燥，参数：进风口温度150℃，出风口温度75℃。申请号为201911098168.x的专利公开了一种奇异变形杆菌噬菌体的生产工艺，其噬菌体制剂的制备方法也是对噬菌体发酵液进行离心、过滤后，向噬菌体液体中加入载体并搅拌均匀后进行低温喷雾干燥，载体成分为：3％可溶性淀粉，3％聚乙烯吡咯烷酮，3％乳糖，2％海藻糖，0.2％磷酸氢二钠，0.3％磷酸二氢钠，0.1％维生素C和0.5％变性壳聚糖；均为质量比。该专利中公开，在37℃条件下，采用本发明工艺所得的噬菌体粉在储存180天后，其效价由初始11.96Log(pfu/g)下降到10.31Log(pfu/g)，而采用真空冷冻干燥的噬菌体粉，其效价由初始11.63Log(pfu/g)下降到8.16Log(pfu/g)，在37℃条件下，低温喷雾干燥生产的噬菌体粉稳定性较好。
但是，上述包埋噬菌体微胶囊仍存在许多不成熟之处，有些关键问题还有待解决，如如何提高噬菌体的包封率、保存效率，难以实现控制释放等缺点。因此，现有技术还有待提高。
发明内容
针对噬菌体进入胃肠道后损失较大、保存时间短的问题，本发明提供一种噬菌体微胶囊及其制备方法，该噬菌体微胶囊通过锐孔法对噬菌体进行微囊化包埋，形成一种噬菌体芯材外包被壁材层和包膜层的稳定噬菌体微胶囊，其确保微胶囊具有良好耐酸性、肠溶性以及保存稳定性，有效保护芯材中的噬菌体，提高其存活率，有效延长其保存时间。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本申请提供一种噬菌体微胶囊，其主要由以下组成制备而成：噬菌体芯材、保护剂和壁材，所述壁材包括海藻酸钠、明胶、卡拉胶、麦芽糊精、壳聚糖、羟甲基纤维素中的一种或多种；所述保护剂包括两性淀粉、海藻糖、脱脂乳、碳酸钙、蔗糖、麦芽糊精中的一种或多种。
所述的芯材为一株噬菌体或者由多株噬菌体组成的噬菌体组合物，如大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、副溶血弧菌噬菌体等，这些噬菌体可特异性地作用于对应的大肠杆菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等宿主病原菌，高效解决由这些病原菌导致的细菌性疾病。
优选地，所述噬菌体微胶囊中，所述保护剂为海藻糖和碳酸钙。
优选地，所述噬菌体微胶囊中，所述壁材为海藻酸钠和明胶。
优选地，所述噬菌体微胶囊主要由以下成分制备而成：100ml噬菌体发酵液、5～10g海藻糖、1.5～2.5g碳酸钙、0.1～1mL的20％浓度的明胶、1.9～2.5g海藻酸钠。
优选地，所述噬菌体微胶囊还包括固化剂，固化剂采用质量百分浓度为1.5％～2.5％的氯化钙溶液。
优选地，所述噬菌体微胶囊还包括用于包覆在壁材外的包膜材料，包膜材料选用壳聚糖溶液。
优选地，所述噬菌体微胶囊中，壁材和保护剂占芯材的质量百分含量的8.0％～14％。
第二方面，本发明还提供上述噬菌体微胶囊的制备方法，其包括以下步骤：
A、将壁材和保护剂按照比例分别加入到噬菌体发酵液中，充分混匀，得到噬菌体胶液；
B、通过锐孔法将噬菌体胶液挤入到固化剂溶液中，初始缓慢搅拌，后期静止固化，得到湿胶囊；
C、将湿胶囊用洗涤液进行洗涤；洗涤后的湿胶囊置于4℃冰箱一晚；
D、将洗涤后的湿胶囊浸泡在包膜溶液中进行覆膜处理后，得到噬菌体微胶囊。可选地，覆膜时间为40min-120min。
覆膜完成后取出湿胶囊装于自封袋或离心管，密封保存。上述制备过程在常温下进行即可。
优选地，所述噬菌体微胶囊的制备方法中，所述步骤A的具体步骤为：取5～10g海藻糖、1.5～2.5g碳酸钙加入到100mL噬菌体发酵液中后，再向其中添加0.1～1mL的20％质量体积百分浓度的明胶液，在磁力搅拌器上搅拌均匀后，再取1.9～2.5g海藻酸钠加入到噬菌体与保护剂混合液中，磁力搅拌器上充分搅拌均匀。
先向噬菌体发酵液中添加海藻糖、碳酸钙等保护剂，再加明胶，最后加入海藻酸钠可保障保护剂充分保护噬菌体，而最后添加的壁材海藻酸钠可以尽可能多的包裹住噬菌体及其保护剂，起到更大的保护效果。
其中，所述20％(w/v)的质量体积百分浓度的明胶的配置为：将20g明胶加入到80mL无菌水配制成明胶液。
优选地，所述噬菌体微胶囊的制备方法中，洗涤剂为质量百分浓度为0.7％～0.9％的氯化钠溶液；包膜材料溶液采用质量百分浓度为0.2％～0.3％的壳聚糖醋酸溶液；所述固化剂采用质量百分浓度为1.5％～2.5％的氯化钙溶液。
优选地，所述包膜材料制备方法为：取相应质量的壳聚糖粉末，加入到900mL0.5％(w/v)醋酸溶液溶解，用4M的NaOH调节pH＝5.0，定容至1000mL，得到0.2％～0.3％的壳聚糖醋酸溶液。
优选地，固化时间为30min以上，湿微囊用0.7％～0.9％浓度氯化钠洗涤液洗涤3次以上。优选地，包膜时间为60min以上。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的微胶囊以海藻酸钠、明胶作为主要壁材，分别以大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、副溶血弧菌噬菌体为芯材，并以海藻糖、碳酸钙等作为保护剂，采用壳聚糖作为主要包膜材料；采用锐孔法，将噬菌体发酵液与胶液混匀制成微胶囊，能减少其受外界环境因素(如热、氧等)、胃液和消化道上端的胆盐环境的影响，并达到常温储藏和运输要求，有效提高该产品到达肠道释放的活性噬菌体的数量。本发明制备的噬菌体微胶囊的包埋率高，可达80％以上，经胃酸处理120min后，活菌数可保留30％以上，具有较好的耐酸性，且肠溶效果好，在肠液处理120min后，噬菌体的释放率在80％左右。
2、本发明制备方法所制备的微胶囊粒径大小均匀，表面光滑无缝隙，具有良好的耐酸性和肠溶性，充分提高肠道内噬菌体存活数，使噬菌体效价稳定。
附图说明
图1本发明的方法制备的微胶囊外观图；
其中，A为本发明实施例1和实施例4制备的微胶囊外观图，B为实施例2制备的微胶囊外观图；C为实施例3制备的微胶囊外观图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实验材料的准备：
噬菌体发酵液的制备：取存放于-80℃冰箱分离纯化好的大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、副溶血弧菌噬菌体噬菌体原液，分别与其宿主菌先以体积比1:1混合接种于相应液体营养肉汤，37℃，170rpm摇床培养5h，离心过滤检测噬菌体效价，效价在1.00×108pfu/mL～3.00×109pfu/mL左右；然后按相应MOI进行噬菌体大量扩增，制备足量噬菌体，制得不同噬菌体效价分别在2.00×109pfu/mL～2.00×1011pfu/mL之间，以备后续实验之需。
一、噬菌体微胶囊的制备方法的摸索
1、噬菌体微胶囊的制备方法的初步摸索
(1)实验方法：
按照前述方法分别制备大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、副溶血弧菌噬菌体发酵液，分别设置为四组，分别进行如下的实验。
对于每种噬菌体发酵液，分别设置7个实验组，通过以下不同的包埋方法制备噬菌体微胶囊，方法具体如下：
实验组1：向100mL噬菌体发酵液中加入5g海藻糖、2.5g碳酸钙、2g海藻酸钠进行包埋搅拌30min，利用10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，再将胶珠放入到4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组2：100mL发酵液中加入7g脱脂乳、2.5g碳酸钙、2g海藻酸钠进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，再将胶珠放入到与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组3：100mL发酵液加入5g海藻糖、3g脱脂乳、2.5g碳酸钙、2g海藻酸钠进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组4：100mL发酵液中加入8g两性淀粉、2.5g碳酸钙、2g海藻酸钠进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组5：向90mL发酵液中加入10mL40％浓度的明胶，然后加入2.5g碳酸钙、2g海藻酸钠进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组6：向95mL发酵液中加入5mL40％浓度的明胶，然后加入2.5g碳酸钙、2g海藻酸钠进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组7：向95mL发酵液中加入5mL40％浓度的明胶，然后加入5g海藻糖、2.5g碳酸钙、2g海藻酸钠进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
(2)实验结果及分析
由于噬菌体种类不影响该实验的微胶囊成球结果，四种噬菌体发酵液制备的微胶囊的成球结果一致，实验结果见下表1。
表1噬菌体微胶囊成球结果
实验组 成球结果
1 Q弹，使劲捏会碎。
2 搅拌过程一直有气泡，成球不规则有气泡，一捏就碎。
3 太黏，且有小气泡，不好吸取，小球漂浮。
4 不成型。
5 很稀，不成型。
6 可成型，但滴入氯化钙搅拌时碎掉了。
7 稀，成型差。
(1)从表1的结果可知，相对于其他实验组难以成球的结果，实验组1的方法更优，制备得到微胶囊的成球效果最好，但是使劲捏会碎，还需要进行进一步的配方优化。
(2)通过多组之间的比较可知，明胶的浓度和添加量对与微胶囊的成型影响较大，需要进一步优化。
(3)保护剂中，相较于两性淀粉、脱脂乳等，海藻糖和碳酸钙组合作为保护剂的制球效果更好。
2、噬菌体微胶囊的进一步优化
(1)实验方法：
在前述实验的基础上，对明胶的浓度和添加量进行进一步的优化，设置以下实验组：
实验组8：100mL发酵液中加入5～10g海藻糖、1.5～2.5g碳酸钙、1.9～2.5g海藻酸钠进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组9：100mL发酵液中加入5～10g海藻糖、1.5～2.5g碳酸钙、1.9～2.5g海藻酸钠、5mL20％浓度的明胶进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组10：100mL发酵液中加入5～10g海藻糖、1.5～2.5g碳酸钙、1.9～2.5g海藻酸钠、1mL20％浓度的明胶进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组11：100mL发酵液中加入5～10g海藻糖、1.5～2.5g碳酸钙、1.9～2.5g海藻酸钠、0.1mL20％浓度的明胶进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
实验组12：100mL发酵液中加入5～10g海藻糖、1.5～2.5g碳酸钙、1.9～2.5g海藻酸钠、0.5mL的20％浓度的明胶进行包埋搅拌30min，10mL注射器滴到2％氯化钙溶液中静止固化40min，弃去氯化钙溶液，无菌水反复冲洗胶珠，与4％壳聚糖溶液进行成膜反应60min，水洗除去未反应的壳聚糖，将得到的微胶囊进行4℃保存。
(2)实验结果及分析
从表2的结果可知，实验组8-12的产物都可成球，但是实验组10-12制备的微胶囊的成球效果更好，弹性适中，结构稳定不易碎，从实验组8或9与实验组10-12的结果比较可知，采用0.1-1ml左右的20％明胶制备微胶囊的效果更好，微胶囊结构更稳定。
表2噬菌体微胶囊成球结果
实验组序号 成球结果
8 Q弹，使劲捏会碎。
9 成球，但稍易碎。
10 成球，弹性适中。
11 成球，弹性适中。
12 成球，弹性适中。
二、噬菌体微胶囊的制备
实施例1
本实施例提供一种噬菌体微胶囊，其采用的噬菌体发酵液的制备方法同前述内容，其制备方法如下：
1)胶液配制：称取5.0g海藻糖、1.5g碳酸钙、0.4mL20％浓度明胶，加入到100mL噬菌体发酵液，搅拌至完全溶解混匀，再加入1.9g海藻酸钠，在磁力搅拌器上充分搅拌15min，混合均匀；
2)固化液的配制：称取3.0g氯化钙，加入200mL蒸馏水，搅拌至完全溶解；
3)洗涤液的配制：称取3.5g氯化钠，加入500mL蒸馏水，搅拌至完全溶解；
4)包膜材料配制：2g壳聚糖粉末，加入450mL0.5％(w/v)醋酸溶液溶解，用4M的NaOH调节pH＝5.0，定容至500mL现用现配。
5)采用锐孔法将噬菌体胶液挤入氯化钙固化液中，缓慢搅拌2分钟，继续静止固化30分钟以上，得到湿胶囊；
6)湿胶囊用氯化钠无菌水洗涤液进行洗涤3次；
7)湿胶囊于4℃冰箱放置一晚；
8)采用浸泡法将得到的湿胶囊浸入到包膜材料溶液中60min，使湿胶囊表面包覆一层薄膜。
采用本发明方法制备的微胶囊形态如图1A(浸泡状态)；
采用本发明方法制备的微胶囊的包埋率及包埋后存活噬菌体效价结果如下表3。
包埋率＝包埋后噬菌体的效价/初始噬菌体效价×100％
表3微胶囊的包埋率及包埋后存活噬菌体效价
Figure BDA0003493438590000111
实施例2
本实施例提供一种噬菌体微胶囊，其采用的噬菌体发酵液的制备方法同前述内容，其制备方法如下：
1)胶液配制：称取6.0g海藻糖、2.0g碳酸钙、0.7mL20％浓度明胶，加入到100mL噬菌体发酵液，搅拌至完全溶解混匀，再加入2.4g海藻酸钠，在磁力搅拌器上充分搅拌15min，混合均匀；
2)固化液的配制：称取3.8g氯化钙，加入200mL蒸馏水，搅拌至完全溶解；
3)洗涤液的配制：称取4.0g氯化钠，加入500mL蒸馏水，搅拌至完全溶解；
4)包膜材料配制：2g壳聚糖粉末，加入450mL0.5％(w/v)醋酸溶液溶解，用4M的NaOH调节pH＝5.0，定容至500mL现用现配。
5)采用锐孔法将噬菌体胶液挤入氯化钙固化液中，缓慢搅拌2分钟，继续静止固化30分钟以上，得到湿胶囊；
6)湿胶囊用氯化钠无菌水洗涤液进行洗涤3次；
7)湿胶囊于4℃冰箱放置一晚；
8)采用浸泡法将得到的湿胶囊浸入到包膜材料溶液中60min，使湿胶囊表面包覆一层薄膜。
采用本发明方法制备的微胶囊形态如图1B；
采用本发明方法制备的微胶囊的包埋率及存活噬菌体效价结果如下表4。
表4微胶囊的包埋率及包埋后存活噬菌体效价
Figure BDA0003493438590000121
Figure BDA0003493438590000131
实施例3
本实施例提供一种噬菌体微胶囊，其采用的噬菌体发酵液的制备方法同前述内容，其制备方法如下：
1)胶液配制：称取9.0g海藻糖、2.2g碳酸钙、0.2mL20％浓度明胶，加入到100mL噬菌体发酵液，搅拌至完全溶解混匀，再加入2.3g海藻酸钠，在磁力搅拌器上充分搅拌15min，混合均匀；
2)固化液的配制：称取5.0g氯化钙，加入200mL蒸馏水，搅拌至完全溶解；
3)洗涤液的配制：称取4.5g氯化钠，加入500mL蒸馏水，搅拌至完全溶解；
4)包膜材料配制：2g壳聚糖粉末，加入450mL0.5％(w/v)醋酸溶液溶解，用4M的NaOH调节pH＝5.0，定容至500mL现用现配。
5)采用锐孔法将噬菌体胶液挤入氯化钙固化液中，缓慢搅拌2分钟，继续静止固化30分钟以上，得到湿胶囊；
6)湿胶囊用氯化钠无菌水洗涤液进行洗涤3次；
7)湿胶囊于4℃冰箱放置一晚；
8)采用浸泡法将得到的湿胶囊浸入到包膜材料溶液中60min，使湿胶囊表面包覆一层薄膜。
采用本发明方法制备的微胶囊形态如图1C；
采用本发明方法制备的微胶囊的包埋率及存活噬菌体效价结果如下表5。
表5微胶囊的包埋率及包埋后存活噬菌体效价
噬菌体 包埋率 初始效价pfu/mL 包埋后效价pfu/mL
大肠杆菌噬菌体 86.96％ 5.75×109 5.00×109
沙门氏菌噬菌体 90.45％ 1.10×1011 9.95×1010
溶藻弧菌噬菌体 86.00％ 2.50×1010 2.15×1010
副溶血弧菌噬菌体 84.51％ 3.55×109 3.00×109
实施例4
本实施例提供一种噬菌体微胶囊，其采用的噬菌体发酵液的制备方法同前述内容，其制备方法如下：
1)胶液配制：称取7.0g海藻糖、2.0g碳酸钙、0.5mL20％浓度明胶，加入到100mL大肠杆菌噬菌体发酵液，搅拌至完全溶解混匀，再加入2.4g海藻酸钠，在磁力搅拌器上充分搅拌15min，混合均匀；
2)固化液的配制：称取4.2g氯化钙，加入200mL蒸馏水，搅拌至完全溶解；
3)洗涤液的配制：称取4.3g氯化钠，加入500mL蒸馏水，搅拌至完全溶解；
4)包膜材料配制：2g壳聚糖粉末，加入450mL0.5％(w/v)醋酸溶液溶解，用4M的NaOH调节pH＝5.0，定容至500mL现用现配。
5)采用锐孔法将噬菌体胶液挤入氯化钙固化液中，缓慢搅拌2分钟，继续静止固化30分钟以上，得到湿胶囊；
6)湿胶囊用氯化钠无菌水洗涤液进行洗涤3次；
7)湿胶囊于4℃冰箱放置一晚；
8)采用浸泡法将得到的湿胶囊浸入到包膜材料溶液中60min，使湿胶囊表面包覆一层薄膜。
采用本发明方法制备的微胶囊形态如图1A；
采用本发明方法制备的微胶囊的包埋率及存活噬菌体效价结果如下表6。
表6微胶囊的包埋率及包埋后存活噬菌体效价
噬菌体 包埋率 初始效价pfu/mL 包埋后效价pfu/mL
大肠杆菌噬菌体 89.50％ 1.00×1010 8.95×109
沙门氏菌噬菌体 93.09％ 7.68×1010 7.15×1010
溶藻弧菌噬菌体 90.65％ 5.35×109 4.85×1010
副溶血弧菌噬菌体 91.67％ 3.00×1010 2.75×1010
三、微胶囊的耐酸性测试
1、试剂的配置
人工胃液：取稀HCl 16.4mL，加水约800mL及胃蛋白酶10g，搅拌均匀后加水定容至1000mL，PH为1.2。
微胶囊破解液：柠檬酸钠14.7g，碳酸氢钠16.8g，溶于1LSM缓冲液中，0.22μm滤膜过滤除菌，常温保存待用。
SM缓冲液：MgSO4·7H2O 2g，明胶0.1g,NaCl5.8g，溶解于900mL去离子水中，再加入50mL1M Tris-HCl(pH7.5)定容至1L，121℃灭菌20min，置4℃冰箱保存备用。
2、实验方法：
取本发明前述实施例1的微胶囊颗粒0.1g(后续测试也是采用实施例1制备的微胶囊颗粒)，分别将其置于盛有50mL，pH1.2的人工胃液的三角瓶中，于摇床培养箱中在温度37±1℃，转速170rpm的条件下处理0min、30min、60min、90min、120min后，检测微胶囊颗粒中存活噬菌体的效价。对照为取1mL噬菌体发酵液，置于盛有49mL，pH1.2人工胃液的三角瓶中，于摇床培养箱中在温度37±1℃，转速170rpm的条件下处理0min、30min、60min、90min、120min后，检测微胶囊颗粒中存活噬菌体的效价和噬菌体存活率。
胶囊颗粒中噬菌体效价检测方法：取25g微胶囊颗粒加入225mL微球破解液，37℃170rpm摇床培养1h，检测溶液效价。效价检测用双层平板检测法进行噬菌体效价检测。噬菌体的效价就是1mL培养液中所含活噬菌体的数量。
双层平板检测方法：首先将噬菌体通过10倍比稀释，稀释至相应倍数(10-6、10-7、10-8)，取噬菌体稀释液分别和对应宿主菌菌液1:1混合均匀，37℃孵育5min后，吸取200μL混合液置于上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)中，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃培养箱倒置培养4～6h后，获得形成噬菌斑的双层平板。
噬菌体效价(pfu/mL)＝平行板间噬菌斑平均值×稀释倍数×10
胶囊颗粒噬菌体存活率＝处理不同时间后胶囊颗粒的噬菌体效价/处理0分钟(未进行耐酸处理)的胶囊颗粒噬菌体效价×100％
发酵液噬菌体存活率＝处理不同时间后发酵液中噬菌体效价/处理0分钟(未进行耐酸处理)的发酵液噬菌体效价×100％
3、实验结果及分析
微胶囊的存活趋势具体结果如表7，噬菌体发酵液(未经微胶囊处理)的存活趋势具体结果如表8。
从表7、表8的结果可知，噬菌体发酵液在人工胃液中会快速失活，以大肠杆菌噬菌体为例，其在处理90min时，其存活率就已低至3.05％，120min时，存活率仅为0.31％，已基本都失活；而本发明的湿胶囊的耐酸性强，在人工胃液中处理到120min时，噬菌体的存活率还保持在36.21％，且效价基本维持原水平。由此可见，本发明中湿胶囊的耐酸性明显优于未进行微胶囊处理的噬菌体发酵液，且微胶囊在人工胃液中可保持较高存活率。
表7湿胶囊耐酸性试验结果
Figure BDA0003493438590000171
表8噬菌体发酵液耐酸性试验结果
Figure BDA0003493438590000172
四、存储稳定性实验
1、实验方法
将试样放入10mL灭菌离心管中，封口膜密封，置于4℃冰箱和37℃恒温培养箱，放置一个月，检测湿胶囊、噬菌体发酵液中噬菌体效价和存活率。噬菌体效价和存活率的检测方法同前述内容。
2、实验结果及分析
微胶囊的存储稳定性具体结果如表9，噬菌体发酵液(未经微胶囊处理)的存储稳定性具体结果如表10。
从表9、表10的结果可知，与未进行微胶囊处理的噬菌体发酵液相比，本发明的湿胶囊的噬菌体的存储稳定性更高。其中，湿胶囊对溶藻弧菌噬菌体、副溶血弧菌噬菌体在37℃条件下的存活率提高幅度最大，分别提高了16.53％、22.93％。
表9湿胶囊存储稳定性试验结果(1个月)
Figure BDA0003493438590000181
表10噬菌体发酵液存储稳定性试验结果(1个月)
Figure BDA0003493438590000182
五、肠溶性测试
1、实验方法：
人工肠液的配置：取K2HPO46.8g，加水500mL溶解，用0.4％的NaOH溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g加水适量使溶解，将两溶液混合后，加水定容至1000mL。
取微胶囊0.1g离心洗涤后，分别放入50mL、pH6.8的人工肠液的烧杯中，于37℃恒温水浴搅拌，搅拌速度为200r/min，分别在0min、30min、60min、90min、120min取样，双层平板检测湿胶囊噬菌体效价。
结合前述的噬菌体发酵液的耐酸性检测结果可知，经胃后噬菌体发酵液存活率极低，因此本实施例中不再对噬菌体发酵液进行肠溶性检测。
胶囊颗粒噬菌体释放率＝肠溶测试处理不同时间后胶囊颗粒的噬菌体效价/处理0分钟(未进行肠溶测试处理)的胶囊颗粒噬菌体效价×100％
2、实验结果及分析
从表11的微胶囊的存活趋势的结果可知，本发明中微胶囊的肠溶性较好，且随着处理时间延长，微胶囊释放率越高，在处理120min时，噬菌体的释放率都在80％左右。
表11湿胶囊肠溶性试验结果
Figure BDA0003493438590000191
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种噬菌体微胶囊，其特征在于，由以下成分制备而成：100mL的噬菌体发酵液、5~10g海藻糖、1.5~2.5g碳酸钙、0.1~1mL的20%质量体积百分浓度的明胶和1.9~2.5g海藻酸钠；所述噬菌体发酵液采用的噬菌体为大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体或副溶血弧菌噬菌体；海藻糖和碳酸钙为保护剂，海藻酸钠和明胶为壁材。
2.根据权利要求1所述的噬菌体微胶囊，其特征在于，还包括固化剂，固化剂采用质量百分浓度为1.5%~2.5%的氯化钙溶液。
3.根据权利要求1所述的噬菌体微胶囊，其特征在于，还包括用于包覆在壁材外的包膜材料，包膜材料选用壳聚糖溶液。
4.如权利要求1-3中任一项所述的噬菌体微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、取5~10g海藻糖、1.5~2.5g碳酸钙、0.1~1mL的20%质量体积百分浓度的明胶液加入到100mL噬菌体发酵液中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，再取1.9~2.5g海藻酸钠加入到噬菌体与保护剂混合液中，充分搅拌均匀，得到噬菌体胶液；
B、通过锐孔法将噬菌体胶液挤入到固化剂溶液中，静止固化，得到湿胶囊；
C、将湿胶囊用洗涤液进行洗涤；
D、将洗涤后的湿胶囊浸泡在包膜材料溶液中进行覆膜处理后，得到噬菌体微胶囊。
5.根据权利要求4所述的噬菌体微胶囊的制备方法，其特征在于，洗涤剂为质量百分浓度为0.7%~0.9%的氯化钠溶液；包膜材料溶液采用质量百分浓度为0.2%~0.3%的壳聚糖醋酸溶液。
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