NO300252B1

NO300252B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et mikrogranulært preparat

Info

Publication number: NO300252B1
Application number: NO881755A
Authority: NO
Inventors: Thomas Ko Sai Ying
Original assignee: Enzacor Pty Ltd
Priority date: 1986-08-28
Filing date: 1988-04-22
Publication date: 1997-05-05
Also published as: KR880701543A; AU7858587A; AU609419B2; JPH02500838A; HK85096A; GR871332B; CN1035801C; WO1988001506A1; EP0321481A1; NO944301L; NO881755L; DE3789965T2; NO881755D0; DK236388D0; DK236388A; CA1314217C; GR871331B; NO300991B1; NO944301D0; CN87106794A

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et mikrogranulært preparat.

Det ifølge oppfinnelsen fremstillbare mikrogranulære preparat er egnet for tilførsel av biologisk aktive materialer til tarmområdene i dyr.

Absorpsjonen av biologisk aktive materialer fra fordøyelses-kanalen foregår hovedsakelig i innvollene.

Mange biologisk aktive materialer er syrelabile og når de utsettes for sure betingelser blir de denaturert eller kjemisk modifisert slik at de mister aktiviteten. Dette frembyr et problem når de biologisk aktive molekyler tilføres oralt til dyr, som f.eks. mange forbindelser for farmasøytisk og veterinær anvendelse, som må passere gjennom magen. Mageområdet av dyr er meget surt på grunn av hydrogenioner fremstilt av de parietale celler i magesekken. pH i dette området kan være så lavt som 1 pH-enhet. Følgelig blir mange biologiske forbindelser irreversibelt denaturert, modifisert og/eller ødelagt før de når tarmområdet hvor absorpsjon foregår.

Et antall nyttige terapeutiske forbindelser og essensielle mineraler virker som mageirriterende midler. Særlig aspirin, Fe<2+>, Fe<3+>, Zn<2+> og K<+> bevirker mageirritasjon ved oral til-førsel. Denne irritasjon kan føre til ulcerasjon av magesekken. Denne ulempe oppveier de terapeutiske fordeler av disse forbindelser. Mangel eller ubalanse av fordøyelses-enzymer i dyr, som skyldes genetiske forstyrrelser eller sykdom i bukspyttkjertelen, kan behandles ved oral tilførsel av enzymer. Mange av disse enzymer er imidlertid syrelabile og blir irreversibelt denaturert i det sure område av magen før de når tarmområdet. Følgelig må det tilføres store doser enzymer, og dette gjør denne behandling ineffektiv og dyr.

Biologisk aktive materialer blir ofte denaturert ved passering gjennom vommen hos drøvtyggende dyr, hvor alkaliske pH-betingelser opptrer. Dette kan også virke som en barriere mot heldig bruk av oralt tilførte terapeutiske midler.

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveie-bringe et preparat egnet for tilførsel av biologisk aktive materialer til tarmområdet av dyr, hvor preparatet eliminerer eller i vesentlig grad reduserer tapet av biologisk aktivitet som skyldes de sure betingelser i magen, eller de alkaliske betingelser i vommen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for fremstilling av et mikrogranulært preparat, som er kjenne-tegnet ved at den omfatter trinnene: (a) immobilisering av ett eller flere biologisk aktive materialer inne i en gelmatriks, (b) mikrogranulering av de immobiliserte biologisk aktive

molekyler,

(c) innkapsling av mikrogranulene med en film av vannopp-løselig material, og (d) belegning av mikrogranulene fra trinn (c) med en polymer som er uoppløselig i syre men oppløselig i alkali eller med en film av polybutylmetakrylat hvis struktur er avbrutt av en fettsyre.

Foretrukket blir mikrogranulene forstøvningsbelagt med

filmen av vannoppløselig material i trinn c) og belegningen i trinn d) .

Biologisk aktive materialer refererer til forbindelser med farmasøytisk og veterinær anvendelse, enzymer som |3-galaktosidase og bromelin, vitaminer som f. eks. vitamin B12, metallioner som Fe<2+>, Fe<3+>, Zn<2+>, K<+>, antibiotika, antiseptika og farmasøytisk tålbare salter derav, videre proteiner, vaksiner, aminosyrer og mikroorganismer.

Betegnelsen "immobilisert form" refererer til biologisk aktivt material som er immobilisert inne i et gellignende material, innelukket i en semipermeabel membran, adsorbert på adsorp-sjonsmidler eller bundet til kompleksdannende midler.

Biologisk aktive materialer kan f. eks. immobiliseres ved hjelp av hvilken som helst av de følgende metoder: a) Inneslutningsmetoden - Innlemmelse av biologisk aktive materialer i kjernen av gellignende materialer eller

inneslutning inne i en semipermeabel membran,

b) Fornetninqsmetoden - Intermolekylær fornetning av de biologisk aktive materialer under anvendelse av fornet-ningsreagenser, eller c) Metoden med binding til bærer - Den fysiske eller kjemiske binding av de biologisk aktive materialer til

en vannuoppløselig substans ved hjelp av ionebinding og/eller kovalent binding.

Immobiliseringen gjennomføres slik at det biologisk aktive material bibeholder aktivitet uansett om det er immobilisert eller når det frigis.

Inneslutningen av biologisk aktive materialer inne i en kjerne kan gjennomføres ved sammenblanding av de biologisk aktive materialer med midler som kan danne en gel under visse betingelser, slik at de biologisk aktive materialer inne-sluttes i den dannede gelmatriks. Eksempler på geldannende midler inkluderer k-karrageenan, algininsyre, gelatin, cellulose eller derivater derav, eller de forskjellige geldannende syntetiske polymerer som f. eks. polyamider eller Chitosan.

Hvis et adsorpsjonsmiddel anvendes er det foretrukket mikro-findelt aktivert trekull.

Kompleksdannende midler kan, når disse anvendes, inkludere EDTA, dets salter eller derivater, eller hydrofile polymerer med høy molekylvekt som f. eks. polyakrylamider eller salter med høy molekylvekt som kan dissosiere deres ioniske binding i vandig oppløsning eller vandig/hydrofilt løsningsmiddel. Innkapsling innebærer avsetning av en tynn film eller kjemisk barriere over kjernen som muliggjør fysisk separasjon av kjernen av hver mikrogranul og dens omgivelse. Denne film eller barriere er vannoppløselig. Et eksempel på en forbindelse som danner en passende barriere er gelatin.

Tarmbelegget er foretrukket celluloseacetatftalat. En hvilken som helst annen syrebestandig, alkalioppløselig polymer kan imidlertid anvendes.

Butylmetakrylat eller annen polymer med høy molekylvekt kan erstattes med eller inneholde "vinduer" av (være avbrutt av) stearinsyre eller et hvilket som helst annet fettsyrederivat, eller annet material, som kan oppløseliggjøres av gallesaften. Foretrukne fettsyrer er C12-24.

Immobiliseringen av biologisk aktive materialer inne i en gel er et meget fordelaktig trekk. Særlig begrenser gelmatriksen tilgjengeligheten av denaturerende midler, som f. eks. organiske løsningsmidler anvendt ved påføringen av et tarmbelegg (et syreuoppløselig, alkalioppløselig belegg som f. eks. celluloseacetatftalat). En vesentlig andel av det biologisk aktive material immobilisert inne i gelmatriksen blir således til slutt tilgjengelig for katalytisk eller annen aktivitet.

Gelmatriksen hvori de biologisk aktive materialer kan immobiliseres er porøs og permeabel. Følgelig, når gelen utsettes for vandige betingelser, som f. eks. omgivelsene i tolvfingertarmen, vil gelen svelle på grunn av inntrengningen av tarmsaftene i gelmatriksen og de biologisk aktive materialer kan frigis og passere ut av gelen for katalytisk eller annen aktivitet.

Mikrogranuler av en meget liten partikkelstørrelse, av stør-relsesorden 50 til 500 (im, kan fremstilles ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse. Spesielt er biologisk aktive materialer immobilisert inne i en gel, eller i en oppløsning som er i stand til å danne en gel, lette å håndtere og behandle, og kan underkastes milde prosedyrer for fremstilling av mikrogranuler av den ønskede lille partikkelstørrelse. F.eks. kan en gel inneholdende biologisk aktivt material ekstruderes gjennom en sikt med meget liten porestørrelse, eller kan frysetørkes til å gi partikler av den ønskede størrelse.

Alternativt kan biologisk aktivt material i en oppløsning som er istand til å danne en gel, forstøves gjennom en passende dyse for dannelse av fine dråper som passerer inn i en oppløs-ning som bevirker at dråpene geldanner, slik at de biologisk aktive materialer immobiliseres inne i den dannede gelmatriks. Størrelsen av granulene tildannet på denne måte bestemmes av porestørrelsen i dysen, og det trykk hvormed oppløsningen for-støves. I motsetning kan slike resultater ikke oppnås ved hjelp av tidligere kjente metoder. Ved tidligere kjent tek-nikk blir biologisk aktive materialer som f. eks. enzymer enkelt blandet med konvensjonelle bindemidler som ikke kan underkastes de ovennevnte behandlinger for fremstilling av mikrogranuler med den ønskede partikkelstørrelse.

Mikrogranuler med en liten partikkelstørrelse er meget ønske-lig, ettersom de kan fordeles jevnt i dyreforet, og tillater hurtig frigivelse av biologisk aktivt material når de når tarmen, på grunn av det økte overflateareal av mikrogranulene.

Tilveiebringelsen av en vannoppløselig barriere omkring kjernen besørger beskyttelse mot denaturering bevirket av organiske løsningsmidler anvendt under påføring av tarm-beleggene. På grunn av den beskyttende natur av den tidligere nevnte gelmatriks oppnås vesentlig opprettholdelse av biologisk aktivitet av det biologisk aktive material.

Det mikrogranulære preparat fremstillbart ved den foreliggende oppfinnelse muliggjør at pH-sensitivt biologisk aktivt material kan bli beskyttet mot inaktivering i magen eller vommen, men likevel kan være tilgjengelig for virkning i tarmkanalen, særlig tolvfingertarmen. Når det mikrogranulære preparat når de alkaliske områder av tarmen hos enmagede dyr blir det ytre belegg oppløst, eller "vinduene" av fettsyre fordøyes. Tarm-saften kan da passere til det vannoppløselige belegg og bevirke at dette nedbrytes. Dette avdekker kjernen, hvilket får den til å svelle og frigi det biologisk aktive material.

Hos drøvtyggende dyr er en polymer med høy molekylvekt som f.eks. butylmetakrylat med "vinduer" av fettsyre egnet som et ytre belegg og tillater passering av det mikrogranulære preparat gjennom vommen og magen. I tarmområdet, særlig tolvfingertarmen, bli "vinduene" av fettsyre fordøyet av lipaser slik at det vannoppløselige belegg tillates å bli nedbrutt og kjernen avdekket, slik at denne sveller og frigir det biologisk aktive material.

Som den fagkyndige lett vil innse vil tykkelsen av beleggene av vannoppløselig film og alkalioppløselig polymer eller polymer med høy molekylvekt avbrutt av en fettsyre eller lignende emulgerbar substans, samt kjernestørrelsen, styre den takt hvormed de biologisk aktive materialer blir tilgjengelige, og ytterligere også lokaliteten inne i tarmen hvor de biologisk aktive materialer blir tilgjengelige.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen vedrører et fremstillbart mikrogranulært preparat som angitt i det foregående hvori kjernen inneholder |3-galaktosidase. Et slikt preparat er nyttig som et vekst f remmende middel for dyr som preawennes, særlig smågris som preawennes. Ytterligere er preparatet nyttig for behandling av diaré i smågris.

Karbohydratet tilstedeværende i purkemelk er hovedsakelig laktose. Laktose krever fordøyelse til enkle sukkerarter, nemlig glukose og galaktose, for å tillate absorpsjon fra den nedre del av tarmkanalen. Ved supplementering av ekstra (3-galaktosidase ved begynnelsen av tarmkanalen, under anvendelse av det ovennevnte mikrogranulære preparat, kan purkemelk fordøyes mer fullstendig og bevirke en vektøkning i smågris.

(3-galaktosidasemangel i smågris, mennesker (påvist som laktoseintolerans) eller andre dyr kan behandles ved tilførsel av det ovennevnte mikrogranulære preparat inneholdende (3-galaktosidase. (3-galaktosidase blir derved frigitt i tarmene og dette letter laktosefordøyelsen.

Ufordøyet laktose i den nedre del av fordøyelseskanalen danner et ideelt dyrkingssubstrat for at tykktarmsbakterier kan formere seg og gjære, under dannelse av gass og melkesyre. Dette resulterer i vannholdig sur diaré. Denne tilstand er kjent som diaré (dysenteri). Alvorlig diaré kan føre til tap av kroppsvæske og elektrolyttubalanse og fører til dehydratisering og død.

En ytterligere metode for behandling av diaré muliggjort ved oppfinnelsen utnytter det fremstillbare mikrogranulære preparat i samsvar med oppfinnelsen inneholdende en protease som f.eks. bromelin. Bromelin vil ved frigivelse i tynntarmen løse patogene organismer fra tarmreseptorene slik at diaréen avhjelpes.

En metode for økning av dyrevekst i dyr som preawennes, særlig smågris, innbefatter tilførsel av en effektiv mengde av et mikrogranulært preparat som angitt i det foregående hvori kjernen inneholder |3-galaktosidase i en immobilisert form.

En metode for behandling av diaré i smågris omfatter tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av et mikrogranulært preparat som beskrevet i det foregående hvori kjernen inneholder (3-galaktosidase eller en protease som f.eks. bromelin.

Oppfinnelsen er særlig nyttig i forbindelse med tilførsel av syrelabile materialer som f.eks. vitamin B12 og riboflavin til dyr inklusive mennesker.

Ytterligere kan materialer som bevirker mageirritasjon som f.eks. aspirin eller jern, sikkert tilføres dyr, inklusive mennesker, under anvendelse av det ifølge oppfinnelsen fremstillbare mikrogranulære preparat. Disse materialer blir følgelig ikke utsatt for innvirkning i fordøyelseskanalen før de når de alkaliske områder av tarmene.

En metode for beskyttelse av syresensitive biologisk aktive materialer mot nedbrytning eller inaktivering i mage eller vom, omfatter tilførsel av det fremstillbare mikrogranulære preparat.

De ifølge oppfinnelsen fremstillbare mikrogranulære preparater kan tilføres oralt til mennesker eller dyr i assosiasjon med en farmasøytisk eller veterinærmessig tålbar bærer eller hjelpestoff. F.eks. kan det mikrogranulære preparat tilføres sammen med vann, kaolin, talkum, kalsiumkarbonat, laktose, natriumklorid, kobbersulfat, sinksulfat, ferrosulfat, magne-siumsulfat, kaliumjodid, svovel, kaliumklorid, selen og/eller vitaminer som biotin, cholinklorid, nikotinamid, folinsyre eller vitaminer A, D3, E, K, Bl, B2, B6 og B12.

De mikrogranulære preparater kan tilføres som en vandig sur oppløsning, en suspensjon, i tablett- eller kapselform, som en pasta, eller i assosiasjon med mat eller fSrblandinger.

Eksempler på passende dyrefårblandinger inkluderer en eller flere av de følgende: mais, hvetekliblandinger, soyabønnemel, fiskemel, gressmel, skummet melk, trikalsiumfosfat, malt, korn, ris, milo, myse eller alfamel.

Foreliggende oppfinnelse skal nå beskrives ved hjelp av eksempler, med henvisning til de følgende utførelseseksempler og figurer hvori: Fig. 1 viser et spredningsdiagram av diaréalvorlighet i

bromelinbehandlet smågris, og

Fig. 2 viser et spredningsdiagram av diaréalvorlighet i ubehandlet smågris.

EKSEMPEL 1

Fremstillingsmåte for de fremstillbare mikrogranulære preparater i samsvar med oppfinnelsen

a) 2 % - 5 % (vekt/volum) av k-karrageenan blandes med renset vann ved temperatur 65°C inntil oppløsning av k-karrageenanet oppnås. Denne oppløsning avkjøles til 50°C. b) 1 % (vekt/volum) av biologisk aktivt material opp-løses i isotonisk fosfatbufferoppløsning (40 % 0,067 M NaH2P04 + 60 % 0,067 M Na2HP04) ved pH 6 ved 50°C. Denne oppløsning tilsettes til oppløsning a) og homogeniseres ved 500 omdreininger pr. minutt i 15 minutter. 2 - 5 % (vekt/volum) av ionisert kalsium i vann tilsettes så til oppløsningen og den resulterende oppløsning homogeniseres i ytterligere en time ved 50 omdreininger pr. minutt og avkjøles så til 20°C og gir en gel, væskecellekuler og en vandig fase. c) Den resulterende gel, væskecellekuler og vandige fase avkjøles til 5°C, dekanteres, filtreres og frysetørkes.

Det frysetørkede material males til å gi en granulstørrelse på 25 - 100 |im, og vaskes så med et herdemiddel som f.eks. 2,5 %

(vekt/vekt) glutaraldehyd eller formalin.

Alternativt ekstruderes gelfasen fra trinn b) og forstøves gjennom 50 \ im store porer ved 3 kP/cm<2> og faller 1 til 5 meter og ned i et herdemiddel som f.eks. 2,5 % (vekt/vekt) glutaraldehyd eller formalin slik at granuldannelse bevirkes. d) Granulene blir så filtrert og vasket med et mykningsmiddel som glyserol. Et hvilket som helst filmmyk-ningsmiddel kan anvendes. e) De resulterende granuler filtreres, fluidiseres og varmetørkes ved 40°C. f) Granulene fra det foregående trinn forstøvnings-belegges med 1 - 2 % (vekt/volum) av gelatin i vannoppløsning

ved 40°C.

g) Et syrebeståndig, alkalioppløselig belegg forstøv-ningsbelegges så på granulene. Belegget omfatter:

6 % (vekt/vekt) celluloseacetatftalat

30 % (vekt/vekt) isopropanol

0,5 % (vekt/vekt) ricinusolje

og aceton til 100 % (vekt/vekt).

h) Som et alternativ til trinn g) blir en polymer med høy molekylvekt hvor strukturen er avbrutt av en film av fettsyre eller lignende emulgerbare substanser forstøvningsbelagt på granulene inntil sluttvekten er 105 % (vekt/vekt). Belegget omfatter:

3 % (vekt/vekt) butylmetylakrylat

0,5 % (vekt/vekt) dibutylftalat

0,05 % (vekt/vekt) stearinsyre

og etylacetat til 100 % (vekt/vekt).

I trinn a) kan k-karrageenanet erstattes med et hvilket som helst geldannende middel som algininsyre, gelatin, cellulose eller dets derivater.

I trinn b) kan kalsium erstattes med hvilket som helst av andre alkalimetallioner som f.eks.: K, Rb<2+>, Cs<+>, Mg<2+>, Sr<2+>, eller to- eller treverdige metallioner som Al<3+>, Mn<2+>, Ba<2+>, Co<2+>, Ni<2+>, Zn<2+>, Pb<2+>, etc, eller NH4+ ioner eller alifatiske aminer eller aromatiske diaminer som trietylaminer, metylen-diaminer, etylaminer, heksametylendiaminer, etc.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av mikrogranuler inneholdende vitamin B2

( Riboflavin)

Fremstillingsmåte:

1. 7500 mg av riboflavin med British Pharmacopoea renhet blandes med 5000 ml 0,3 % iseddikoppløsning. Dette oppvarmes i vannbad og rystes inntil oppløsning. 2. 250 g k-karrageenan blandes med 5000 ml renset vann ved 65°C inntil oppløsning av karrageenanet er oppnådd. Denne oppløsning avkjøles til 50°C og blandes så med

ribo flavinoppløsningen.

3. Den resulterende gel/oppløsning homogeniseres så ved

500 omdreininger pr. minutt i 15 minutter.

4. 5 1 10 % kalsiumklorid i destillert vann tilsettes til gelen/oppløsningen, og blandingen homogeniseres i en time ved 50 omdreininger pr. minutt. Den avkjøles til

5°C og gelfasen dekanteres.

5a) 100 g av den dekanterte gel frysetørkes og granuleres til å gi granuler på omtrent 100 |i.g. Disse betegnes

kontrollgranuler.

5b) Resten av gelfasen filtreres og forstøves gjennom

50 nm store porer ved 3 kP/cm<2> inn i 2,5 % glutaraldehyd-løsning fra en høyde på tre meter. 6. Granulene fra 5b) filtreres og vaskes med 0,5 % glycerol i vannoppløsning. De resulterende granuler filtreres, fluidiseres og varmetørkes ved 40°C. Granulene samles. 7 . Granulene fra det foregående trinn forstøvningsbelegges med 2 % gelatinoppløsning i vann ved 40°C inntil sluttvekten er 104 % (vekt/vekt). 8. Granulene sprøytebelegges så med 3 % butylmetakrylat, 0,15 % dibutylftalat, 0,05 % stearinsyre i etylacetat-oppløsning inntil sluttvekten er 105 % (vekt/volum). 9. Granulene siktes slik at gjennomsnittsstørrelsen av granulene er under 500 [ Lm.

TESTGRANULER

In vitro testing:

1. 5 g "testgranuler" og 5 g av "kontrollgranuler" anbringes i separate 6 cm x 6 cm nylondukposer. 2. Posene forsegles og neddykkes i to timer i en fortynnet saltsyreoppløsning med pH 1, og ved omrøring ved 60 omdreininger pr. minutt. 3. Posene overføres så fra syreoppløsningen, renses under rennende vann i 3 0 minutter og drypptørres. 4. 200 ml vomfluid samles gjennom en åpning i en fistulaku. 5. De to testposer suspenderes i vomvæske og inkuberes i

24 timer ved 37°C.

6. Begge poser vaskes, og tørkes ved 40°C.

7 . Innholdet av hver pose veies og riboflavininnholdet assaybestemmes.

Resultater:

Ingen "kontrollgranuler" var tilbake i nylondukposen.

4,2 g "testgranuler" ble gjenvunnet fra nylonposene som inneholdt "testgranulene". Tapet av 0,48 g "testgranuler" skyldes sannsynligvis nedbrytning av de mikrogranuler som ikke var skikkelig tildannet under fremstillingsmetoden.

Fra assaybestemmelsesresultåtet av 1 g "testgranuler" behandlet med vomvæske ble det beregnet at 4,52 g av "testgranulene" i posen inneholdt totalt 114 mg riboflavin.

4,52 g ubehandlede granuler inneholder omtrent 114 mg riboflavin. 2 g av "testgranulene" ble innført på nytt i en nylonpose og suspendert i 100 ml tolvfingertarmvæske samlet fra et slakte-hus og inkubert ved 37°C. Granulene desintegrerte i løpet av to timer.

Assavbestemmelsesmetode:

1. De vomvæskebehandlede "testgranuler" innføres i 100 ml etylacetat/vannoppløsning (50%/50%) og homogeniseres ved

500 omdreininger pr. minutt i en time.

2. Løsningsmiddelfasen dekanteres og den vandige fase bibeholdes.

3. Prosedyren gjentas tre ganger.

4. 3 ml iseddik tilsettes så til den endelige vandige fase. Blandingen oppvarmes i et vannbad med hyppig risting inntil oppløsning, filtreres gjennom nr. 1 Wattman filterpapir og fortynnes til 1000 ml. 5 ml av 0,1 M natriumacetatløsning tilsettes og den oppnådde oppløs-ning fortynnes til 50 ml med vann. Absorpsjonsevnen av den resulterende oppløsning måles med et maksimum ved omtrent 444 nm. Innholdet av riboflavin beregnes, idet 323 tas som verdi for A (1 % 1 cm) ved maksimum omtrent 444 nm.

EKSEMPEL 3

Mikrogranulært preparat inneholdende metionin

Frems tillingsme tode:

Mikrogranuler inneholdende metionin ble fremstilt ved metoden i eksempel 2, med den unntagelse at 30 g DL-Metionin av nær-ingsmiddelrenhet ble anvendt i trinn 1. Granuler inneholdende metionin benevnes i det følgende "testgranuler". "Kontrollgranuler" ble tildannet ved hjelp av metoden i eksempel 2.

In vitro testing:

1. 5 g "testgranuler" og 5 g "kontrollgranuler" anbringes i separate 6 cm x 6 cm nylondukposer. 2. Posene forsegles og neddykkes i to timer i fortynnet saltsyreoppløsning med pH 1, og omrøres ved 60 omdreininger pr. minutt. 3. Posene overføres fra syreoppløsningen og renses under rennende vann i 30 minutter, og får deretter drypptørke. 4. 200 ml vomfluid samles gjennom en åpning i en fistulaku.

5. To testposer suspenderes i vomfluidet og inkuberes i

24 timer ved 37°C.

6. Begge poser vaskes og tørkes ved 40°C.

7. Innholdet av posene veies og assaybestemmes med hensyn til metionininnhold.

Resultat:

Ingen "kontrollgranuler" er tilbake i nylondukposen.

4,40 g "testgranuler" ble gjenvunnet fra nylonposen inneholdende "testgranuler". Tapet av 0,6 g "testgranuler" skyldes sannsynligvis nedbrytning av defekte mikrogranuler.

Fra assaybestemmelsesresultåtene av 1 g "testgranuler" behandlet med vomfluid ble det beregnet at 4,40 g av "testgranulene" inneholder totalt 563 mg metionin, idet 4,4 g ubehandlede granuler inneholder 536 mg metionin. 2 g av "testgranuler" ble på nytt innført i en nylonpose og suspendert i 100 ml tolvfingertarmvæske samlet fra et slakte-hus og inkubert ved 37°C. Granulene ble funnet å desintegrere i løpet av to timer.

Assavbestemmelsesmetode:

1. "Testgranuler" som er behandlet med vomsaft helles inn i en 500 ml kolbe med glasskork. 200 ml etylacetat/vann-oppløsning (50%/50%) tilsettes og homogeniseres ved 500

omdreininger pr. minutt i en time.

2. Løsningsmiddelfasen dekanteres for bibeholdelse av den vandige fase.

3. Denne prosedyre gjentas tre ganger.

4. Den endelige vandige fase innstilles til 20 ml med vann. 10 g tobasisk kaliumfosfat, 4 g enbasisk kaliumfosfat og 4 g kaliumjodid tilsettes og blandes grundig til opp-løsning. 5. Nøyaktig 100 ml 0,1 N jodoppløsning tilsettes. Kolben lukkes, det blandes godt, og kolben settes bort i 30 minutter, og deretter ble overskuddet av jod titrert med 0,1 N natriumtiosulfat. En blindprøvebestemmelse og nødvendige korreksjoner foretas. Hver ml 0,1 N jod er ekvivalent med 7,461 mg av DL-Metionin.

EKSEMPEL 4

Vekstfremmelse i smågris som preawennes

Smågris ble tilført 2 ml av en pasta inneholdende følgende:

og det mikrogranulære preparat fremstillbart i samsvar med oppfinnelsen hvori kjernen inneholdt (3-galaktosidase (300 F.CC. LU) .

Pasta ble tilført på fødselsdatoen og femte dag etter fødselen.

Smågris som var gitt den ovennevnte behandling vist en økt vektøkning i sammenligning med ubehandlet smågris. Ytterligere var forekomsten av diaré sterkt redusert i smågris som mottok det mikrogranulære preparat.

EKSEMPEL 5

Forhindring og behandling av diaré i smågris

E. coli bakterier med K88 pilus (K88<+> E. coli) er ansvarlig for en stor andel av neonatal og etterawenningsdiaré i griser. Disse bakterier må binde til tarmreseptorer før de kan bevirke sykdom.

In vitro forsøk har indikert at proteasen bromelin er ytterst effektiv ved nedbrytning av K88-bindingsaktiviteten av tarm (glykoprotein) K88-reseptorer. Denne reseptor blir bare uttrykt på slimhinneoverflaten av tarmene i griser av K88-utsatt fenotype.

Forsøket vist i det følgende illustrerer effektiviteten av det ifølge oppfinnelsen fremstillbare mikrogranulære preparat ved behandling av diaré i smågris.

Metoder:

Gris:

Tre drektige førstegangsfødende purker ble anskaffet fra Werribee Animal Research Institute. K88-fenotypene av de førstegangsfødende purker ble bestemt ved hjelp av kapsel-tester (Chandler, 1986). En gris (nr. 65G) ble funnet å være sterkt K88-adhesiv (utsatt for infeksjon), mens en ble funnet å være svakt K88-adhesiv (nr. 264Y), og en K88-ikke-adhesiv (nr. 219Y). Kullstørrelsene fra disse purker var henholdsvis syv, syv og ni smågris.

De førstegangsfødende purker nedkom alle i løpet av tre døgn, og smågrisene ble avvent i en alder av omtrent tre uker. Fire smågris fra hver av de første to kull og fem fra det resterende kull ble tilfeldig valgt og behandlet daglig med mikrogranulært preparat oppnådd i samsvar med oppfinnelsen inneholdende bromelin (0,04 % vekt/vekt). Alle andre smågris forble ubehandlet.

Behandling:

BromelinhoIdige mikrogranuler ble oralt tilført (2 g/dose) i karboksymetylcellulosebuffer med lav pH under anvendelse av en 10 ml sprøyte. Bromelinbehandling ble gjennomført en til to timer før foring. Den første dose av bromelin ble gitt dagen før avvenningen, og åtte påfølgende dager deretter.

Inokulasjon:

Massive inokulasjoner (omtrent 5 x IO<9> E. Coli/døgn) av hver av fem stammer av K88<+> E. Coli ble tilført daglig. Fire stammer var blitt isolert fra dødelige tilfeller av K88-colibacillose. Disse stammer var alle serogruppe 0149. De var blitt lagret i frysetørket tilstand etter isolering ett til fem år tidligere. Resterende K88<+> E. Coli var nylig isolert fra et ikke-fatalt tilfelle av diaré hos en lokal griseoppdretter (serogruppe 0 ikke-typebestembar). Bakteriene ble suspendert fra saueblodagar (5 % volum/volum) i fosfat-bufret saltløsning (PBS, pH 7,2). Smågrisene ble oralt inokulert med bakteriene umiddelbart før foringen.

Bedømmelse av diaré:

Sunnheten eller infeksjonsgraden av smågrisene ble bedømt ved: (i) levende vekt: Levende vekt ble bestemt før foringen for hver smågris 17 ganger i den tre ukers periode fra avvenning til slakting. (ii) diaré: En subjektiv bedømmelse av den kliniske tilstand av dyret ble foretatt som følger: Normal: Ingen symptomer på diaré eller dehydratisering, Løs: Avføring åpenbart mer flytende enn normalt.

Ingen tegn på dehydratisering.

Diaré: Flytende avføring i rikelige mengder.

Voldsom diaré: Diaré med tegn på debilisering og

dehydratisering.

Død:

(iii) bakterieinfeksion: Lengden av hemolytiske (hly<+>) bakteriekolonier som viste seg når avf©ringsmaterial ble platet ut på saueblodagar ble bestemt.

Bedømmelse av K88- fenotvpe:

Utskrapninger fra midttarmen ble samlet ved obduksjon fra de galter som de førstegangsfødende purker var blitt paret med. På tilsvarende måte ble purker og smågris bedømt for fenotype ved konstruksjon av et adhesjonsmønster av fem punkter i like stor avstand fra hverandre langs tynntarmen oppnådd ved obduksjon. Smågrisene ble slaktet fire uker etter avvenning. K88-fenotype av tarmutskrapningene ble bedømt ved enzymimmuno-assaybestemmelse (KPEIA, Chandler et al., 1986).

Resultater:

Alvorlig diaré (og død) etter inokulasjon av K88<+> E. coli var bare tydelig i smågris født av den K88-adhesive fenotype purke (nr. 65G). Smågris fra dette kull var tilsvarende K88-adhesive, selv om de sannsynligvis var heterozygoter (dvs bare bærende et enkelt dominant gen for K88 reseptorekspresjon). Smågris fra den svakt adhesive purke (nr. 264Y) var variable i reseptoraktivitet, men var mindre aktive enn smågris fra purke nr. 65G. Smågris fra den K88-ikke-adhesive purke (nr. 219Y) var også K88-ikke-adhesive.

Et spredningsdiagram som indikerer de daglige bedømmelser av diaré og de kull hvorfra smågrisene skrev seg er vist i fig. 1 (bromelinbehandlet smågris) og 2 (ubehandlet smågris). Både forekomsten og alvorligheten av diaré viste seg å være lavere i bromelinbehandlet smågris, selv om en smågris fra hver gruppe døde i løpet av 24 timer fra avvenningen. Begge disse smågriser var født av purke nr. 65G. Ti opptegnelser av "diaré" eller alvorlig diaré ble gjort i behandlings/inoku-las jonsperioden, og ni av disse var foretatt for smågris som ikke mottok bromelin. Diaré ble mer tydelig i den bromelinbehandlede gruppe først etter fullført inokulerings/behand-lingsperiode .

Bedømmelse av graden av infeksjon i smågris ved å bedømme mengden av Hly<+->kolonier i utplatinger fra rektale vattpinner ble funnet å være av liten verdi, sannsynligvis på grunn av at de massive daglige inokulasjoner førte til store mengder av Hly<+->kolonier i tilsynelatende upåvirket smågris. Organismene koloniserte sannsynligvis tykktarmen av disse smågrisene, et sted hvor de gjør liten skade.

Tilsvarende var daglige økninger i levende vekt av liten verdi ved bedømmelse av mulige fordeler som kunne tilskrives bromelin. De forbigående diaréer som ble iakttatt blant smågrisene med lav genetisk utsatthet (smågris av kullene fra purkene nr. 2 64Y og nr. 219Y) gjorde lite for å påvirke levendevekt-økningen.

Smågris fra den utsatte purke (nr. 65G) var som ventet mer alvorlig påvirket av bakterieangrepet. Død av en smågris i hver behandlingsgruppe etterlot bare to smågris i den ubehandlede gruppe. Vektøkning av en av disse smågriser var sterkt påvirket av angrepet, mens den andre ikke var påvirket. Ingen av de tre bromelinbehandlede smågris forble alvorlig påvirket av bakterieangrepet.

Dette forsøk indikerer at K88-reseptoraktiviteten kan modifiseres in vivo ved oral inokulering av mikrogranuler inneholdende bromelin umiddelbart før avvenningen, og i den påfølgende uke når infeksjon gjerne vil opptre. Slike mikrogranulære preparater viste seg å redusere de kliniske symptomer av sykdommen.

Ytterligere forsøk som ble gjennomført indikerer at smågris behandlet med det mikrogranulære preparat fremstillbart i samsvar med oppfinnelsen inneholdende bromelin, medførte en 28 % nedsettelse i forekomsten av diaré, i sammenligning med ubehandlet smågris.

Denne metode for forhindring eller behandling av colibacillose kan fremby et alternativ til bruk av antibiotika i intensive griseavlanlegg. Ettersom omtrent ti millioner griser dør årlig av colibacillose (Walters and Sellwood, 1984), kan behandling med mikrogranuler inneholdende en protease være meget fordelaktig for griseavlen.

Det ovennevnte forsøk anvender proteasen bromelin. Selv om forsøkene har vist at bromelin er den mest effektive protease for nedbrytning av K88-reseptoren, skal det forstås at andre proteaser, kombinasjoner av protease eller enzymer som virker til å ødelegge eller endre glykoproteiner, kan anvendes i dette aspekt. Eksempler på andre proteaser som kan anvendes er: trypsin, fungal protease p23, subtilisin, proteinase K, og andre fungale og bakterielle proteaser.

Et antall andre patogene bakterier er kjent, eller antas, å binde til tarmreseptorer. Eksempler på slike bakterier er Salmonella, Shigella og streptococcus. Proteaser innkapslet i det ifølge oppfinnelsen fremstillbare mikrogranulære preparat kan anvendes for behandling av infeksjoner med slike bakterier i dyr og mennesker.

Litteraturhenvisninger:

Chandler, D.S. (1986). Inherited resistance to K88<+> E. coli in pigs. Thesis accepted for doctorate of philosophy. La Trobe University.

Chandler, D.S., Chandler, H.M., Luke, R.K.J., Tzipori,

S.-R. and Craven, J.A. (1986). Screening of pig intestines for K88 non-adhesive phenotype by enzyme immunoassay.

Vet. Microbiol. 11: 153-161.

Kidder, D.E. and Manners, M.J. (1978). Digestion in the Pig. Scientechnica, Bristol, U.K.

Walters, J.R. and Sellwood, R. (1984). The performance of pigs genetically résistant to K88 E. coli. Proe. of British Society of Animal Productiqn, Scarborough, U.K. Paper No. 76, 26th-28th Maren.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et mikrogranulært preparat, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) immobilisering av ett eller flere biologisk aktive materialer inne i en gelmatriks, (b) mikrogranulering av de immobiliserte biologisk aktive molekyler, (c) innkapsling av mikrogranulene med en film av vannopp-løselig material, og (d) belegning av mikrogranulene fra trinn (c) med en polymer som er uoppløselig i syre men oppløselig i alkali eller med en film av polybutylmetakrylat hvis struktur er avbrutt av en fettsyre.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at gelmatriksen er tildannet fra k-karrageenan, gelatin, alginat, cellulose eller dets derivater, eller geldannende syntetiske polymerer.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at det vannoppløselige material er gelatin.

4. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1-3, karakterisert ved at mikrogranulene har en størrelse mellom 25 og 500 |im.

5. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 4, karakterisert ved at mikrogranulene har en størrelse mellom 50 og 350 \ im.

6. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 5, karakterisert ved at det biologisk aktive material er valgt fra gruppen bestående av farmasøytiske og veterinære forbindelser, enzymer, vitaminer, proteiner, vaksiner eller aminosyrer.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at det biologisk aktive material omfatter jern, sink eller kalium og salter av disse metaller, vitamin B12, riboflavin, metionin, (3-galaktosidase eller bromelin.

8. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 7, karakterisert ved at polymeren er cellulose-acetatf talat .

9. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 8, karakterisert ved at fettsyren omfatter C12_24-r ettsyrer.