CN113038958A - 用于从患者身体移除尿毒症毒素的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于降低患有一定程度的肾衰竭的患者体内的尿毒症毒素的浓度的组合物和方法。该方法可用于延缓对常规透析治疗的需求或作为辅助治疗以降低透析疗程的频率，并在一些情况下，作为此类透析疗程的替代。

Description

用于从患者身体移除尿毒症毒素的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月12日递交的美国专利申请No.62/744,966的权益，该专利申请的全部内容通过引用明确地并入本文。
背景技术
肾脏疾病困扰着世界上百分之十的人口，并成为了主要的健康负担。透析和肾移植是目前仅有的治疗选择。但是，这些治疗方法的经济成本非常高。
基于将消化系统用作肾功能的替代已经进行若干治疗尝试。在正常的消化过程中，胃肠道将营养物质和水输送到血液中，并通过肠排出废物和未消化的物质。肠壁调节营养物质、电解质、水和某些助消化物质(比如胆汁酸)的吸收。肠壁还扮演半透膜的角色，所述半透膜允许小分子从肠道进入血液，并阻止大分子进入循环系统。已经进行了各种侵入性和非侵入性的尝试，包括外肠瘘、肠透析、诱发性腹泻以及口服吸着剂和/或包封的脲酶的施用，以从胃肠道中提取尿毒症废物。
已经研究了将氧化淀粉、槐豆胶和其它物质作为治疗尿毒症的潜在口服吸着剂。还探索了将包封的脲酶作为结合氨的不可吸收的口服吸着剂。已将一些基因工程微生物包封，并显示在体外系统和尿毒症大鼠动物模型的尿素和氨的移除中有效。然而，这些治疗均无法以足以减轻肾衰竭患者尿毒症症状的量移除尿毒症毒素。此外，这些系统均不能解决血液中主要的尿毒症毒素硫酸吲哚酚的积累。
需要更有效的治疗，所述治疗能够在多种尿毒症毒素进入血流之前从消化道中有效地将其移除，从而减轻患者的尿毒症症状。
发明内容
为了以简化形式介绍一些概念而提供了本发明内容，所述概念将在下面的具体实施方式中进一步描述。本发明内容既不旨在标识所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
一方面，提供了一种用于降低患者的消化系统中的一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体的浓度的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含多个水凝胶颗粒，每个颗粒包含一种试剂，所述试剂包封在所述颗粒中并被配置为降低一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体的局部浓度
另一方面，提供一种用于降低患者的消化系统中的一种或多种尿毒症毒素的浓度的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向有此需要的患者施用本文公开的组合物。
附图说明
当结合附图考虑时，参照以下详细描述，本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更加明显并变得更好理解，其中：
图1A至图1C描绘了为治疗性饮料A组合物形式的示例性组合物，其包含在可饮用液体中悬浮的一种或多种类型的颗粒，从而使所述颗粒可以通过吸管吸入。可以将每种类型的颗粒配置为通过几种手段之一移除一种或多种尿毒症毒素或前体，所述手段包括通过无机或有机分子(包括蛋白质或肽)或生物体的活菌落(包括细菌、酵母菌或真菌)的吸附。
图2A至图2C示出了适合包含在本文公开的组合物中的示例性颗粒的结构。
图3为采用商购的96-液滴形成器(96-droplet former)通过本文描述的工艺形成的示例性藻酸Ca++珠子(直径为～3mm)的照片。
图4证明了将示例性藻酸盐珠子在其形成所在的CaCl2溶液中或在水中储存3周对尺寸的影响。
图5A至图5C示出了用于形成用在本文件中所述的工作的示例性藻酸钙珠子的移液设备和由该设备产生的珠子。将藻酸盐溶液从商购移液器中滴入下方的CaCl2溶液中(5A)。图5C和图5C为产生的～3mm直径的珠子的图片。由于使用该特定方法来形成珠子而最初与CaCl2溶液接触的藻酸盐液滴的非球形形状，有时会在凝胶珠子上发现小的“茎”(5C)。
图6A为采用2.25mM BSA+掺入在50mM Tris缓冲液pH～8.0中的FITC-BSA制备的藻酸Ca++(％)珠子的荧光图(左)。图6B证明了2.5μM下珠子中FITC-BSA随时间的损失。注意，即使在不含Ca++的缓冲液中储存一天，也有BSA从珠子中大量逃逸的迹象。
图7A至图B为未处理的(7A)和戊二醛处理的(7B)示例性BSA藻酸盐珠子的图片。经处理的珠子在表面周围看上去有一个“晕”，这可能表明了由白蛋白交联引起的凝胶缩合。
图8证明了从示例性未处理的和戊二醛处理的BSA藻酸盐水凝胶珠子中的BSA渗漏，表明其中BSA已经交联的珠子渗漏更少的BSA。
图9为示例性交联BSA-藻酸盐珠子吸收色氨酸的证明。将藻酸盐珠子用作对照。注意，与不含BSA的藻酸盐对照珠子相比，当溶液中含有添加的BSA-藻酸盐珠子时，溶液中色氨酸浓度的下降幅度更大。
图10A至图10B示出了pH对示例性BSA藻酸盐珠子的影响。相对于在pH 8.0和9.0保持透明的珠子，在pH 2.0，BSA藻酸盐珠子变成白色并缩小至其直径的一半(10A)。B.当将在pH 2.0下平衡的珠子移回至pH 8.0时，这些珠子将恢复为透明状态并恢复其原来直径(10B)。
图11证明了通过包含细菌的示例性珠子从缓冲液中移除葡萄糖。与含有热杀死的大肠杆菌的珠子相比，含有活的大肠杆菌的珠子从周围缓冲液中移除了更多的葡萄糖。细条代表标准偏差(n＝2)。
具体实施方式
本发明涉及用于降低患有一定程度的肾衰竭的患者体内的尿毒症毒素的浓度的组合物和方法。在一些情况下，所述组合物和方法可以用于延缓对常规透析治疗的需求或可以作为辅助治疗以降低透析疗程的频率，并在一些情况下，作为此类透析疗程的替代。
因此，一方面，本文公开的为一种用于降低患者的消化系统中的一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体的浓度的组合物，该组合物包含多个水凝胶颗粒，每个颗粒包含包封在该颗粒中并被配置为降低一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体的局部浓度的试剂。在一些实施方案中，每个颗粒可包含两种试剂。在一些实施方案中，每个颗粒可包含三种、四种、或五种试剂，比如细菌菌株。
尿毒症毒素为通常由肾脏过滤并排泄的化合物，例如尿素和硫酸吲哚酚，但这些化合物会在慢性肾脏病(CKD)患者的血液中积累。如本文所用，尿毒症毒素前体是可以在体内转化为尿毒症毒素的化合物。例如，尿毒症毒素硫酸吲哚酚是由肝脏产生的。肠道细菌将一部分源自饮食蛋白质的氨基酸色氨酸代谢成吲哚，该吲哚随后在肝脏中被代谢成硫酸吲哚酚。因此，在一些实施方案中，移除消化系统中产生的一种或多种尿毒症毒素前体(比如吲哚)对于控制CKD是需要的。或者，可以降低肠道中吲哚前体(色氨酸)的浓度，以达到相同的效果。
本文公开的组合物中可以包含能够降低一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体的浓度的任何合适试剂。在一些实施方案中，所述试剂配置为降低患者消化道(包括结肠)中一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体的局部浓度。
在一些实施方案中，所述试剂为微生物的菌落。合适的微生物的实例包括但不限于细菌、酵母菌、霉菌以及天然生物和基因工程生物。在一些实施方案中，所述试剂可包括益生菌的(probiotic)组合物。在一些实施方案中，所述益生菌的组合物可包含丙酸杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、链球菌或它们的组合。可用在本发明的组合物中的合适细菌还包括基因工程细菌(比如大肠杆菌)以表达一种或多种酶，所述酶将尿毒症毒素或尿毒症毒素前体转化为非毒性化合物或者使尿毒症毒素或尿毒症毒素前体变为非毒性的。
在一些实施方案中，所述微生物的菌落包含一种或多种被配置为将一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体作为食物来源的微生物菌株。在一些实施方案中，所述微生物的菌落包含一种或多种被配置为将一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体转化为一种或多种非毒性物质的微生物菌株。在一些实施方案中，所述微生物的菌落包含一种或多种微生物菌株，所述微生物菌株被配置为将一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体转化为沉淀在水凝胶颗粒内部的一种或多种非毒性物质。在一些实施方案中，所述微生物配置为通过增加水凝胶颗粒中微生物的数量而将一种或多种尿毒症毒素转化为生物质。包含在本文公开的组合物中的微生物包括活的和灭活的微生物培养物。
在一些实施方案中，所述微生物可包含在所述水凝胶中，从而所述微生物不会从水凝胶中逃逸和/或不会改变患者的肠道微生物群。
在一些实施方案中，所述组合物的每个颗粒包含至少两种微生物。在一些实施方案中，所述组合物的每个颗粒包含至少两种共生类型的微生物。
在一些实施方案中，所述试剂为吸着剂，比如吸附剂或吸收剂，其被配置为非共价地结合一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体，并可以被固定在凝胶珠子中以防止逃逸至肠道。合适的吸着剂包括有机和无机吸着剂。在一些实施方案中，吸着剂为可以特异性地或非特异性地结合一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体的蛋白质或重新设计的肽或抗体。在一些实施方案中，吸着剂为白蛋白。在一些实施方案中，吸着剂为牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方案中，所述试剂结合色氨酸或吲哚。
在一些实施方案中，所述试剂包括无机吸附剂，比如炭。
在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒包括球形水凝胶颗粒。在一些实施方案中，所述球形水凝胶颗粒具有约0.1mm至约10mm、约1mm至约10mm、约2mm至约8mm或约3mm至约5mm的直径。如本文所用，术语“约”意指所陈述值的±5％。球体的尺寸不仅可以确定试剂(如细菌生物体)的负载，而且可以确定毒素到达试剂的速率。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒是基本上球形或类球体的，两个术语均表示水凝胶颗粒不是完美的球体而是具有基本的球形特征。基本的球形颗粒包括具有椭圆形尺寸的颗粒，“泪滴”形颗粒以及具有诸如麻点或缺口的表面特征的颗粒。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒不是球形的。除了可以配置球形水凝胶的几何形状以外，还可以混合和匹配不同的尺寸和形状。例如，在一些实施例中，可以使用立方体形状和圆柱形状。
在本文公开的组合物中可以使用任何类型的生物相容性水凝胶。在一些实施方案中，水凝胶或其部分是难消化的。如本文所用，“难消化的”是指可以基本上完好地通过如人的胃肠道的材料。难消化的水凝胶的实例包括但不限于琼脂、藻酸盐和其他基于天然碳水化合物的凝胶形成剂。适于包含在本文公开的组合物中的水凝胶的其他实例为形成水凝胶的合成聚合物，比如聚丙烯酰胺、硅氧烷和聚乙二醇(PEG或PEO)聚合物。
包含在组合物中的水凝胶包含非毒性组分。在一些实施方案中，水凝胶包含已被指定为“一般认为是安全的”(GRAS)的组分。在一些实施方案中，水凝胶包含诸如由FDA批准供人或动物食用的诸如聚合物的组分。在一些实施方案中，包含在组合物中的水凝胶是非毒性的。
通常，水凝胶是多孔的，并允许尿毒症毒素或其前体向包封在组合物颗粒内的试剂(比如微生物)扩散。
在一些实施方案中，水凝胶为支持微生物生长、允许尿毒症毒素或其前体以及任选地所需的营养物和气体向微生物的内扩散但防止移除毒素的微生物释放到肠道微生物群中、并且其本身对患者无毒的水凝胶。
可以通过本领域已知的方法生产适于包含在本发明的组合物中的水凝胶颗粒。例如，可通过在二价阳离子(如钙或钡阳离子)存在下使藻酸钠交联产生藻酸盐水凝胶。在一些实施方案中，水凝胶是共价交联的。在一些实施方案中，水凝胶是藻酸钙(CA)-羧甲基纤维素(CMC)水凝胶。在一些实施方案中，通过将试剂(比如BSA)诱捕在藻酸钙水凝胶中，然后使诱捕在水凝胶中的试剂进一步交联，例如，采用戊二醛使在藻酸盐水凝胶中诱捕的BSA的氨基交联，从而制备水凝胶。在一些实施方案中，交联的诱捕试剂(如白蛋白)、分子可以在颗粒的水凝胶(比如藻酸盐水凝胶)中形成第二水凝胶，其本身仅通过静电键与Ca++离子结合而交联。本领域已知包含反应性基团(比如氨基、羧基和羟基)的水凝胶的交联方法。在一些实施方案中，水凝胶颗粒包含互穿网络，该互穿网络包含水凝胶(比如藻酸盐)和交联的蛋白质(比如白蛋白(如BSA))。
可以将几种类型的凝胶形成材料用于制备所公开的组合物的水凝胶颗粒，以及用于将试剂包封(如将细菌固定)在水凝胶颗粒内。在一些实施方案中，水凝胶由无毒的廉价商品材料制成，主要为藻酸盐(藻酸钠或SA)和聚(乙烯醇)(PVA)，和/或聚乙二醇的丙烯酸酯衍生物，比如PEG二丙烯酸酯PEGDA和PEG二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)。
在一些实施方案中，可以使用PEG的硫醇和降冰片烯衍生物，并且任选地使用可光活化的交联化学方便地使其交联。在一些实施方案中，通过将细菌细胞悬浮液与藻酸钠溶液混合并将该混合物滴入氯化钙浴中来固定试剂(比如细菌)，其中钙离子在藻酸链之间形成离子交联并使溶液液滴胶凝成颗粒，如珠子。可以将相同的离子交联方法用于从藻酸盐和PVA(PVA/SA)的混合物中制备颗粒。在一些实施方案中，可以通过使可光交联的苯乙烯基吡啶鎓PVA衍生物，即SbQ-PVA包含在混合物中来交联PVA。
在一些实施方案中，水凝胶包含PEG水凝胶，如由PEG丙烯酸酯制备的水凝胶。在一些实施方案中，PEG水凝胶可以抵抗胃肠道中的生物降解的。在一些实施方案中，可以使用薄片铸造法(sheet casting approach)来将细菌固定在PEG水凝胶中，其中使具有固定的细菌的水凝胶形成为薄片，随后将薄片切成小立方体。
在一些实施方案中，可以使用混合方法来制备本文公开的组合物的水凝胶颗粒。混合方法采用离子藻酸盐滴加法，将Ca+2浴用于最初形成SA/PEG丙烯酸酯聚合物混合物的珠子结构，同时开始进行自由基引发过程从而在PEG丙烯酸酯预聚物组分扩散出藻酸盐凝胶之前使该PEG丙烯酸酯预聚物组分交联。
使用本领域已知的方法，例如在T型通道的流体或微流体装置中通过改变油相和水相的流速，可以形成不同尺寸的颗粒。该方法允许以非常低的生产量和必要的除油步骤为代价，精确地控制粒径。在一些实施方案中，例如，当如上所述由PVA/SA混合物形成颗粒时，聚合物溶液可以是非常粘稠的；这一过程通过经由细针孔滴加聚合物溶液产生约3mm直径的颗粒。如果在针头和接收溶液(如氯化钙溶液)之间施加强静电场，则可以制备小到约0.5mm的更小珠子。
本文公开的水凝胶颗粒可以具有多种结构，所述多种结构的非限制性实例示于图2A至图2C中。在一些实施方案中，水凝胶颗粒(130)可以为包含单一类型的水凝胶的固体颗粒的形式(图2A)。在一些实施方案中，如图2B所示，本文公开的水凝胶颗粒(150)可包含核(170)和围绕该核的一个或多个外部壳层(160)。在一些实施方案中，如图2C所示，本文公开的水凝胶颗粒(180)可具有嵌入包含不同类型的水凝胶(190)的较大水凝胶颗粒(180)中的若干较小颗粒(200)。
在一些实施方案中，试剂(如细菌或吸着剂)位于颗粒的核中。在一些实施方案中，试剂(如细菌或吸着剂)既位于颗粒的核中，也位于颗粒的壳中。在一些实施方案中，颗粒的壳允许尿毒症毒素扩散到核中。在一些实施方案中，含有试剂(如细菌或吸着剂)的核包含难消化的水凝胶。在一些实施方案中，壳包含作为肠溶衣和/或保护颗粒核和固定在核内的试剂免受胃的酸性环境影响的聚合物或另一种材料。
在一些实施方案中，本文公开的组合物进一步包含流体载体。本文公开的组合物中可以使用促进凝胶颗粒摄入且对患者无毒的任何合适的流体载体。例如，在一些实施方案中，流体载体可以包括肉汤、汤、茶、咖啡、牛奶、果泥、果汁或它们的组合。在一些实施方案中，本文公开的组合物中可包含一种或多种甜味剂、食用着色剂、营养物、调味剂或它们的组合。
在一些实施方案中，本文公开的组合物可以用作肾衰竭的治疗方法。在一些实施方案中，可以将包含一种或多种类型的水凝胶颗粒和流体载体的本发明的组合物作为治疗性饮料提供给患有肾衰竭的患者，该治疗性饮料类似于可以例如通过吸管从饮料容器中食用的被称为“泡沫红茶(bubble tea)”的流行饮料。图1A至图1C描绘了在容器(110)中的此类治疗性饮料的一些实施方案，其中所述饮料包括流体载体(120)和一种或多种类型的水凝胶颗粒(1、2、3)。在一些实施方案中，如图1A所示，治疗性饮料，即本发明的组合物，包含流体载体(120)和一种类型的颗粒(120)。在一些实施方案中，治疗性饮料，即本发明的组合物，包含流体载体(120)和多于一种类型的颗粒，比如两种类型的颗粒(1和2)，如图1B所示。在一些实施方案中，治疗性饮料，即本发明的组合物，包含流体载体(120)和多于两种类型的颗粒，比如三种类型的颗粒(1、2和3)，如图1C所示。每种类型的水凝胶颗粒可以配置为降低特定尿毒症毒素或其前体的浓度。
当颗粒到达试剂或其前体开始积累所在的胃肠道的一部分(如患者的结肠)时，每个颗粒内的试剂(如微生物)可以吸收和/或生物转化一种或多种尿毒症毒素。然后水凝胶颗粒与包封的试剂(如微生物)以及可能也被吸收的任何过量流体一起在粪便中完整地被排出，因此包封在颗粒中的试剂不会污染肠道菌群。可以如通过调节每种饮料中毒素特异性的水凝胶颗粒的数量和比例而针对个体患者的需要来调整治疗性饮料的组成和/或任何特定颗粒的剂量。
在一些实施方案中，本文公开的组合物作为中性或营养性饮料的一部分被食用。在一些实施方案中，其中患者由于2型糖尿病而导致肾功能不全，所述组合物可以是无糖的。在一些实施方案中，本文公开的组合物可以以调味的、甜的或美味的形式(例如，基于鸡汤的“泡沫红茶”)提供。在一些实施方案中，可以基于患者的饮食和肾功能不全的程度而针对患者的个体营养需要来调整本文公开的组合物中包含的流体载体。治疗性饮料，即本文公开的组合物，还可以为患者提供非常积极和愉快的体验。因此，在一些实施方案中，通过在组合物中包含与食品相容的染料，而使所述水凝胶颗粒的类型可以是彩色标记的，从而产生彩色饮料。还可以采用将以患者特异性比例混合并匹配“球体”(即水凝胶颗粒)和合适的试剂(如细菌菌株)来根据患者食用的特定饮食调整疗法。例如，可以增加有待在富含蛋白质的大餐之前食用的组合物中移除色氨酸的颗粒的比例。
在一些实施方案中，在添加载体和/或以治疗性饮料的形式施用之前，水凝胶颗粒可以以干燥形式储存。在一些实施方案中，包含在本发明的组合物的水凝胶颗粒中的试剂(如微生物)可以被干燥并且经重新水合而重新活化。
因此，在另一方面，本文提供的是一种用于降低患者的消化系统中一种或多种尿毒症毒素的浓度的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本发明的组合物。在一些实施方案中，患者为人类患者，比如被诊断为患有肾衰竭的患者。在一些实施方案中，患者为兽医的患者，如犬科或猫科(家养的狗或猫)。对于兽医的应用，除了水凝胶颗粒外，本发明的组合物可进一步包含适于例如通过注射器喂食施用于兽医的患者的基质，比如鸡肉或牛肉泥。对于兽医的应用，可以选择水凝胶颗粒的尺寸，以允许该颗粒可不经咀嚼即可被患者吞咽、允许该颗粒通过胃肠道而不会阻塞胃肠道且允许该颗粒被排出。
在一些实施方案中，可以将本发明的治疗方法用于延缓对常规透析治疗的需要。在一些实施方案中，可以将本发明的治疗方法作为辅助疗法，例如用以降低透析疗程的频率，或作为一些透析疗程的替代。如本文所用，“辅助疗法”是这样一种疗法，其允许降低即使通过透析治疗也很难从血流中移除的一种或多种尿毒症毒素(比如硫酸吲哚酚)或其前体的浓度。
在一些实施方案中，本文公开的方法降低了患者的胃肠道的一部分(例如患者的结肠)中的一种或多种尿毒症毒素或其前体的浓度。在一些实施方案中，本文公开的方法降低了患者的血流中一种或多种尿毒症毒素或其前体的浓度。在一些实施方案中，本文公开的方法通过降低患者的消化系统(如结肠)中的色氨酸或吲哚的浓度来降低患者血流中的硫酸吲哚酚的浓度。
本文示出的细节仅是示例性的且仅出于对本发明优选实施方案的说明性讨论的目的，并且是为了提供本发明各个实施方案的原理和概念方面的据信最有用和最易理解的描述而给出。在这方面，没有试图以超过基本理解本发明所必要的详细程度显示本发明的结构细节，通过附图和/或实施例进行的描述使得本领域技术人员明白如何在实践中体现本发明的几种形式。
本文引用的全部参考文献均以引用的方式并入。如果需要，可以修改本发明的各方面以采用以上参考文献和申请的系统、功能和概念来提供本发明的另外进一步实施方案。根据详细说明，可以对公开内容作出这些和其他改变。
可以将任何前述实施方案的具体元件可以与其他实施方案中的元件组合或替代其他实施方案中的元件。另外，可选地可在这些实施方案中的至少一些中包含具体元件，其中其它实施方案中可包括一个或多个具体地排除了这些具体元件中的一个或多个的实施方案。此外，虽然在这些实施方案的上下文中已描述了与本发明的某些实施方案相关联的优点，但其它实施方案也可显示出这样的优点，并且并非所有实施例都必须显示出此类优点才落入本发明的范围内。
实施例
实施例1
藻酸Ca2+球体的形成
本实施例证明了通过通常称为“球化”的方法形成示例性颗粒(聚合物球)。该方法由以下组成：在水中或缓冲液中形成藻酸Na+稀释(<5％)但粘稠溶液的液滴，然后将一个或多个藻酸盐溶液的液滴转移至含有游离Ca++离子(比如CaCl2)的溶液中。Ca++离子扩散到藻酸盐溶液中，并与藻酸盐聚合物链上的羧酸根络合，从而藻酸盐缩合并交联成凝胶。胶凝作用最初发生在藻酸盐液滴的外表面，在藻酸盐的流体内核周围产生胶化的“壳”。随着Ca++溶液中颗粒温育的进行，Ca++离子进一步扩散通过胶化的皮层(cortex)进入其中的核藻酸盐溶液中；胶凝作用向内进入珠子内部，直到整个藻酸盐团块呈凝胶状，且珠子为固态连续凝胶。重要的变量为藻酸盐和Ca++溶液的浓度、藻酸盐液滴的体积、藻酸盐液滴注入的Ca++溶液的总体积、温度、pH、温育持续时间以及各溶液中任何其它溶质的存在。
通常通过在如移液管尖端的圆锥形物体的孔上形成一滴藻酸盐溶液来完成向Ca++溶液中添加液滴藻酸盐。一般而言，所需的藻酸盐液滴尺寸为1mm至5mm的直径；由于预期递送至人胃肠道的途径是通过摄入，因此对于这些应用而言，更大的直径是不切实际的；然而，出于研究目的和动物测试，超出此范围的直径是可取的。这可以通过改变藻酸盐液滴落入Ca++溶液中的孔的尺寸来实现。
制造
为了用于生产可食用藻酸盐球，商业制造商已经生产了可一次产生96个液滴的滴形成工具。已将此类商用设备用于形成图3所示的球体。如图4所示，由此形成的液滴，如果将其储存在它们形成所在的CaCl2溶液中，则可以在冰箱中储存至少3周且几乎无变化，但是如果将它们储存在蒸馏水中则会膨胀。
采用实验室设备的其他成球方法也可以同样快速，更容易重复使用。图5A和图5B示出用于以下所述的实验室中进一步工作的设备。将不同浓度的藻酸盐溶液吸入多通道移液管(Rainin E4XLS)中，之后将50μl/等分试样滴入CaCl2(0.5-1％)中。
采用若干技术，包括两种基于荧光的技术测量珠子的尺寸。使用凝胶成像仪(BioRad)在紫外或蓝色激发下，以荧光模式对珠子成像，测量珠子的像素尺寸，并计算相应的mm尺寸。其次，用具有为荧光素和Texas RedTM荧光团设置的带通滤光片(激发：双带通479/585nm(Semrock FF01-479/585)；发射：双带通524/628nm(Semrock FF01-524/628)；二向色：Dual-edge 505/606nm(Semrock FF505/606-Di01))的倒置荧光显微镜(ZeissAxiovert 25倒置荧光显微镜)对珠子成像。成像的珠子的尺寸与显微镜标准(AppliedMicro SM-3)相关。两次测量均表明，最初的珠子尺寸为约3mm的直径。
实施例2
通过BSA/水凝胶颗粒自缓冲液中移除色氨酸
本实施例证明了采用包含固定在颗粒中的分子结合剂/吸附剂的示例性水凝胶颗粒移除了尿毒症毒素的前体。一种关键的尿毒症毒素为硫酸吲哚酚，其作为吲哚的分解产物在肝脏中产生。而吲哚又通过肠道微生物群作为氨基酸L-色氨酸的微生物代谢产物在肠道中产生。已知L-色氨酸以及其它三种芳族L-氨基酸与白蛋白强烈结合，并且在携带硫酸吲哚酚的同一位点由白蛋白在血浆中转运。相信从肠中移除色氨酸可减少肠中吲哚的产生，从而减少下游的硫酸吲哚酚的产生，并因此降低血液中的硫酸吲哚酚的水平。开发了从肠中移除吲哚的模型系统，其证明装载了白蛋白的示例性水凝胶颗粒可以在通过胃肠道的过程中保留下来，并且还可以从模型溶液(即肠内容物)中移除色氨酸。以下描述的为使用示例性组合物移除结合白蛋白的毒素的方法的原理证明，所述示例性组合物包含包封在藻酸盐珠子中的牛血清白蛋白。
制造
含牛血清白蛋白的藻酸盐珠子的制备
首先通过将藻酸钠溶解在50mM Tris pH 8.0缓冲液中制备不同浓度(1.0％、1.5％、2.0％)的藻酸钠。在持续搅拌下，将1mM的BSA(Gemini Bioproducts 30％储备液，Cat#700-110)添加到混合物中。然后将混合物脱气以移除气泡。将BSA-藻酸盐混合物吸到多道移液器(Rainin E4XLS)中，然后将50μl/等分试样滴入CaCl2(0.5-1％)中。将包封在藻酸盐水凝胶中的BSA用缓冲液洗涤，并在4℃下储存直至使用。图3示出了制备包封BSA的藻酸盐水凝胶珠子的过程。珠子的直径为约3mm。类似地产生了不含BSA的对照珠子。
BSA-藻酸盐水凝胶既可以在没有内部液体的情况下通过在CaCl2中温育至少40分钟牢固地产生，也可以在具有内部液体的情况下通过在10-15分钟之内从CaCl2中移除珠子牢固地产生。水凝胶的牢固性(firmness)还随着藻酸钠的不同百分比而变化，随着浓度的增加，牢固性增加。
如图6所示，使用荧光标记的BSA的初步实验表明，在较短的储存时间内BSA可以从未紧密交联的藻酸盐珠子中逃逸。显然，在这些浓度下形成的凝胶不够紧密，无法固定BSA尺寸的蛋白。因此，开发了一种方法来防止诸如蛋白(如BSA)的尿毒症毒素吸附剂在包封在藻酸盐珠子中后的其迁移。
使包封BSA的藻酸盐珠子交联以防止BSA渗漏
戊二醛是易于与两种不同的伯胺基形成共价键的二价醛，长期以来将其用于通过分子间共价键形成来形成蛋白质凝胶。如果避免(可能影响活性位点的)过度处理，则在形成完全由蛋白质溶液组成的醛交联的凝胶后，酶和其它蛋白质可以保留功能性。由于藻酸盐本身没有胺基，因此戊二醛对含蛋白质的藻酸盐珠子的化学作用应限于交联包封在水凝胶中的蛋白质上的胺。
用在0.9％盐溶液中制备的0.3％戊二醛处理BSA-藻酸盐(1mM BSA，1.5％藻酸钙)水凝胶珠子(通过上述程序制备)达6分钟。采用100mM Tris pH 8.0缓冲液来终止戊二醛处理，然后用50mM Tris pH.8缓冲液洗涤珠子。结果示于图7A和图7B。
测试未处理的和戊二醛处理的BSA-藻酸盐珠子的BSA渗漏。在37℃，在孔板中用1ml的Tris pH 8.0缓冲液温育来自每组的约15个珠子。定期从孔中移除缓冲液并将其添加至黑孔板中并在读板仪中读数。在280/350nm(激发/发射)下测定了BSA中固有的色氨酸中吲哚环的荧光。采用戊二醛的这一处理很重要，因为BSA的任何渗漏均增加在以下描述的部分中测量的色氨酸。图8示出了，与未处理的BSA水凝胶珠子相比，该戊二醛交联的特定方案以显著地程度防止了BSA从水凝胶中逃逸。另外的戊二醛处理可以进一步防止蛋白质损失。
由包封BSA的藻酸盐水凝胶吸附色氨酸
如前述部分所述，用戊二醛处理示例性的BSA-藻酸盐珠子(1mM BSA，1.5％藻酸盐)和仅藻酸盐的珠子(1.5％藻酸盐)。在终止戊二醛反应并洗涤后，向每个孔板中的15个珠子中加入含有0.5mM色氨酸的Tris pH 8.0缓冲液1ml，并在37℃下温育。通过读取280/350nm处的荧光(激发/发射)定期分析珠子外的缓冲液中的色氨酸。图9示出了由包封了BSA的藻酸盐珠子吸收了色氨酸。相比之下，在用仅藻酸盐珠子的对照中，色氨酸浓度保持比在BSA藻酸盐珠子存在的情况下更高。
pH对BSA-藻酸盐珠子的影响
作为确定通过胃肠道对示例性加载BSA的藻酸盐珠子的存活的影响的第一步，测试了pH对BSA藻酸盐珠子的影响以模拟珠子从口腔至结肠的过程中将发生的变化。对于胃部条件选择pH 2.0的缓冲液，对于小肠中的条件选择pH 8.0和9.0的缓冲液。
将示例性BSA藻酸盐珠子添加至pH 2.0的甘氨酸-HCl缓冲液或添加至调节为pH2.0的PBS缓冲液中，并在一段时间内成像。在一个小时之内，BSA藻酸盐珠子不仅变成白色，而且尺寸缩小了一半(图10A)。相对地，经受pH 8.0和9.0的珠子保持透明且尺寸未改变。当将珠子从pH 2.0的缓冲液中转回至pH 8.0的Tris缓冲液中，它们在30分钟内恢复至原来的透明状态(图10B)。随pH的改变，BSA改变了其构象。本实施例证明了虽然BSA在通过消化道时会经受不同的pH，但是无论将凝胶珠子缓冲的如何好，构象改变的逆转都可以随着珠子从酸性胃环境向小肠和结肠移动而使包埋的BSA再次活化。
实施例3
活细菌在藻酸盐珠子中的包封及它们在变化的pH环境中的存活
材料和方法：
细菌细胞的生长和洗涤。将大肠杆菌K12(ATCC 10798)从冷冻库存中划线到LB-琼脂平板(Amresco J104,VWR,West Chester,PA,USA)上。在将板在37℃下温育至少16小时后，挑选单个菌落并将其接种到置于27ml松盖(loose-capped)玻璃试管中的2-3ml LB肉汤(Amresco J106,VWR)中。将接种的肉汤在37℃下以250rpm震荡生长过夜。将细胞1:100传代培养至15ml新鲜LB肉汤中，并如上所述生长约2小时(OD600＝0.8至2.0)。将细胞通过离心(以1ml等分试样，在12,000x g下2分钟，1.5ml微量离心管)回收，重悬于1体积的盐水(如所指出的，Tris缓冲的或未缓冲的)中并再次回收。在第二次洗涤并回收后，将细胞重悬于0.1-0.25体积的盐水中(如所指出的，Tris缓冲的或未缓冲的)。
基本指示培养基包含以下成分(以g/L表示)：K2HPO4(0.3)、NaCl(0.5)、NH4Cl(1)、葡萄糖(10)、MgSO4(0.5)、CaCl2(0.015)、溴百里酚蓝(0.03)。测试时未调节该培养基的pH，但测量的pH为7.0。
细菌细胞的热杀死。如果进行了死大肠杆菌对照，此时将一部分洗涤后的细胞移至单独的1.5ml微量离心管中。将该管放置在95℃的加热块上达10-15分钟，然后移开。通过将50-100μl加热的混合物铺在LB琼脂上来确认细胞的热杀死。
大肠杆菌珠子的形成。将细胞稀释至盐水(如所指出的，Tris缓冲的或未缓冲的)中，然后添加藻酸钠至终浓度为2％(w/v)。在我们手中在此藻酸盐溶液中细胞浓度小于或等于OD600＝0.5(大约4x108个细胞/ml)具有最佳的结构完整性。在将藻酸盐溶解(至少10分钟)后，采用下部的5mm已被无菌地移除的1000μl移液管尖端将溶液滴入置于广口无菌容器中的至少10ml 2％CaCl2(w/v)中。由此产生的珠子的平均直径为4mm(或平均体积约为33.5μl)。将珠子温育在CaCl2溶液达至少30分钟(除非另有说明)，然后无菌地移至新的无菌管中并用盐水覆盖(Tris或未缓冲的以匹配用于制备珠子的藻酸盐溶液)。
葡萄糖消耗(depletion)培养基包含以下成分(以g/L表示)：K2HPO4(0.3)、NaCl(0.5)、NH4Cl(1)、葡萄糖(4)、MgSO4(0.5)、CaCl2(0.015)。
活/死染色。为了评估掺入藻酸钙珠子之后的大肠杆菌细胞活力，采用活/死染色试剂盒(Invitrogen LIVE/DEADTM BacLightTM Bacterial Viability Kit，用于显微镜和定量测定，ThermoFisher L7012)。所述试剂盒含有两种染色剂：碘化丙啶和SYTO 9。将这两种染料以1:1的比例混合。然后将混合物在盐水(如所指出的，Tris缓冲的或未缓冲的)中(如所述，按1:100或1:200)稀释，然后施加至珠子(每个珠子20-40μl)。浸泡30分钟后，用干净的刀片切割珠子，并将切割的表面放置到玻璃显微镜载玻片上。采用使用彩色相机(Retiga 1300i)和为适当的荧光波长(双带通479/585nm激发(Semrock FF01-479/585)和524/628nm发射(Semrock FF01-524/628)滤光片)设置的滤光片组的Axiovert倒置显微镜(Zeiss Axiovert 25)对珠子成像。
葡萄糖浓度的测量。将CVS Health高级血糖仪(AgaMatrix,Inc.,Salem,NH,USA)用于测量溶液的葡萄糖浓度。将兼容的测试片插入机器中，然后将2μl的液体施加到测试片的末端。葡萄糖以mg/dL表示。在每个时间点一式两份测量溶液，并给出平均结果。
实验#1-在生理温度下装载大肠杆菌的珠子可消耗周围的小分子的培养基
如上所述制备含有活的或热杀死的大肠杆菌细胞的珠子。将6个珠子(约200μl总体积)添加至放置在10ml无菌带盖玻璃试管中的1ml或0.5ml葡萄糖消耗培养基中。在该初始T＝0时间点测量葡萄糖。将试管在37℃、250rpm振荡下温育。温育19小时后，再次测量葡萄糖(图11)。
在19小时的过程中含有活的和热杀死的大肠杆菌的珠子均导致了周围溶液中的葡萄糖明显降低。在热杀死条件下观察到的降低似乎是最小的，且在200μl珠子/ml条件下不显著。该种降低似乎是剂量依赖性的，并且在装载了热杀死细胞的珠子中，可能是由于葡萄糖扩散到(未取样的)珠子体积中。如果由于扩散作用而发生延迟稀释，并且珠子的整个体积都可以被葡萄糖扩散(水性)，则预期葡萄糖浓度将更大幅度降低。在装载了热杀死的大肠杆菌的珠子外部的缓冲液中葡萄糖的保留支持了以下假设：葡萄糖无法经由扩散接近大部分珠子体积。由于珠子比盐水更致密(它们会迅速从溶液中沉淀出来)，这表明它们体积中相对较大的部分是藻酸钙聚合物，而不是水。
当采用含有活的大肠杆菌珠子时，从溶液中移除的葡萄糖要比稀释所能解释的更多。这一结果支持了以下假设：聚合物基质内的大肠杆菌细胞能够摄取小分子并具有代谢活性。
实验#2-在生理条件下装载了大肠杆菌的珠子产生酸(一种代谢指标)
将含有(活的或热杀死的)大肠杆菌的珠子放置在基本指示培养基(如上所述)中，并在37℃、250rpm振荡下温育过夜。在此期间，在溶液中游离的大肠杆菌细胞使该指示培养基变黄，并使pH值(从7.0)下降到约4.5。尽管细胞几乎完全包含在珠子中，但含有活大肠杆菌的珠子显示出了这种相同的pH值变化(该异常珠子培养基的光密度没有变化，但是在铺板该培养基时发现了一些活细胞)。含有热杀死的大肠杆菌或未引入细菌制备的珠子未显示出该种相同的pH值变化。
由于这些细胞是在有氧条件下剧烈振荡生长的，因此这些珠子中的大肠杆菌是通过有氧呼吸(糖酵解和TCA循环)来实现大部分能量守恒的。这一过程产生的CO2可以通过形成碳酸来使水酸化。大肠杆菌还可以将葡萄糖发酵成混合酸(乳酸、乙酸、琥珀酸和甲酸)和气体，但是这种发酵只在无氧的情况下进行，因为这种情况可能会在珠子更深处发生。
实验#3-如活/死染色所示，大肠杆菌细胞在珠子制备过程中大部分存活下来，但 长期暴露在低pH下会受到挑战
采用活的或热杀死的细胞制备大肠杆菌珠子，将其洗涤并在盐水(0.9％NaCl)、10mM Tris-缓冲的盐水(pH 7.4)或100mM Tris-缓冲的盐水(pH 7.4)中稀释。在37℃下振荡的同时，将活的珠子在100mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2)中温育5分钟、30分钟或60分钟。在低pH温育后，将珠子用1mL 100mM Tris缓冲盐水(pH 7.4)中和至少30分钟。然后将珠子用活/死染色剂染色，并如上所述进行观察。绿色染色表示活细胞，而红色染色表示死细胞。结果汇总在下表1中。
表1：在珠子中存在不同量缓冲液的情况下，使包封在藻酸钙珠子中的大肠杆菌经受低pH(100mM甘氨酸-HCl，pH 2.0)。将细胞用BacLight LIVE/DEAD染色剂染色并成像。根据发出的荧光的主色，用眼睛确定是活的还是死的。将显示绿色的珠子确定为含有活的大肠杆菌，而显示红色的那些确定为死的。采用100mM Tris-缓冲的盐水制备的珠子主要为黄色，表明一些细胞死亡，而另一些由于更高缓冲液浓度的保护作用则没有死亡。
表1
Tris缓冲液(nM) 热杀死的 活的(无低pH处理) 处理5min 处理30min 处理60min
0 死亡 活的 活的 死亡 死亡
10 死亡 活的 活的 死亡 死亡
100 死亡 活的 活的 部分存活 死亡
短时间暴露于低pH值(比如在人的胃中所遭遇的)并不会导致大范围的大肠杆菌细胞死亡。然而，30分钟和60分钟的更长时间的暴露会得到红色染色，表明细胞死亡。使用平行制备的未染色珠子生长的培养物证实，在低pH处理30分钟后，在这些珠子中的活细胞没有保持存活。然而，缓冲凝胶珠子内的培养基具有保护作用。采用10mM或100mM Tris-缓冲的盐水制备的珠子中的大肠杆菌在5分钟低pH处理中存活，但是采用未缓冲的盐水制备的珠子中的大肠杆菌则没有存活。进一步的实验表明，采用50mM Tris-缓冲的盐水制备的珠子中的大肠杆菌没有在15分钟低pH处理中存活。但是，Tris缓冲液很容易从凝胶珠子中扩散出来。可以通过添加当珠子通过胃时不会从珠子中扩散出来的缓冲液(例如，具有可滴定基团的高分子量聚合物)来缓解低pH的影响。在一些实施方案中，可以包含诸如白蛋白或其他惰性蛋白的蛋白质作为缓冲试剂。
尽管已经示出和描述了示例性实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变。

Claims (31)

1.一种用于降低患者的消化系统中的一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体的浓度的组合物，所述组合物包含多个水凝胶颗粒，每个颗粒包含包封在所述颗粒中并被配置为降低一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体的局部浓度的试剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述试剂为微生物的菌落，其中，所述微生物的菌落包含一种或多种被配置为将所述一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体作为食物来源的微生物菌株。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述试剂为包含一种或多种微生物菌株的微生物的菌落，所述一种或多种微生物菌株被配置为将所述一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体转化为一种或多种非毒性物质。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述微生物为活的微生物或热灭活的微生物。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述试剂吸附或吸收一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述试剂为蛋白质。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述蛋白质为牛血清白蛋白(BSA)。
8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中，所述一种或多种尿毒症毒素或尿毒症毒素前体为色氨酸或吲哚。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶颗粒包含球形水凝胶颗粒。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述球形水凝胶颗粒具有约1mm至约10mm、约1mm至约5mm或约3mm至约5mm的直径。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶在暴露于胃肠道的条件之前或之后对哺乳动物是非毒性的。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶是人难消化的。
13.根据权利要求2至4中任一项所述的组合物，其中，所述微生物通过增加所述水凝胶颗粒中微生物的数量而将所述一种或多种尿毒症毒素转化为生物质。
14.根据权利要求2至4中任一项所述的组合物，其中，所述微生物将所述一种或多种尿毒症毒素转化为所述水凝胶颗粒内沉淀的固体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶包含聚乙二醇(PEG)水凝胶。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶包含藻酸钙水凝胶或藻酸钡水凝胶。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述水凝胶进一步共价交联。
18.根据权利要求6或7所述的组合物，其中，所述蛋白质在包封在所述水凝胶中之后共价交联。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述多个水凝胶颗粒包含多于一种类型的水凝胶颗粒，其中，每种类型的水凝胶颗粒配置为移除不同的尿毒症毒素。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含含有活性炭的水凝胶颗粒。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶颗粒包含壳和核。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述试剂在所述颗粒的核中。
23.根据权利要求21或22所述的组合物，其中，所述颗粒的壳允许尿毒症毒素扩散到所述核中。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的组合物，其中，所述核包含难消化的水凝胶。
25.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含流体载体。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述流体载体包括一种或多种甜味剂、营养物、调味剂或它们的组合。
27.一种用于降低患者的消化系统中一种或多种尿毒症毒素的浓度的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用前述权利要求中任一项所述的组合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述患者被诊断为患有肾衰竭。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述患者为人。
30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述患者为兽医的患者。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶颗粒以基本上未变化的形式被所述患者排出。
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